張?jiān)仆?　蘇　航,　刁　勇,　戚智青

華僑大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院, 福建 泉州 362021

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牛乳鐵蛋白肽的抑菌功能及基因工程制備進(jìn)展

張?jiān)仆?蘇航,刁勇,戚智青*

華僑大學(xué)生物醫(yī)學(xué)學(xué)院, 福建 泉州 362021

牛乳鐵蛋白肽(lactoferricin bovine，LfcinB)是由乳鐵蛋白(lactoferrin)經(jīng)酸性胃蛋白酶降解N端而產(chǎn)生的含25個(gè)氨基酸殘基的小肽，它具有抗菌、抗癌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等一系列生物活性，成為目前研究與開發(fā)的熱點(diǎn)。由于受到生產(chǎn)成本的限制，無(wú)法進(jìn)行大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)，基因工程技術(shù)將是實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)的最佳途徑。對(duì)牛乳鐵蛋白肽的抑菌功能以及基因工程制備的優(yōu)勢(shì)和改良方法進(jìn)行了綜述，旨在為基因工程生產(chǎn)牛乳鐵蛋白肽提供新思路。

牛乳鐵蛋白肽；抗菌肽；基因工程

乳鐵蛋白肽(Lfcin)是一種廣泛存在于自然界并參與機(jī)體非特異性免疫的生物活性多肽。它不僅存在于哺乳動(dòng)物的乳汁中，也廣泛分布在淚液、唾液、胰液、血液、精液、小腸液、膽汁和羊水等分泌物中，且初乳中含量最高[1]。自乳鐵蛋白肽首次被分離獲得以來(lái)，目前發(fā)現(xiàn)牛乳鐵蛋白肽(LfcinB)的抗菌活性最強(qiáng)，因此成為主要的研究對(duì)象。LfcinB不僅抗菌，而且具備抗病毒、抗癌、消炎、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、抗氧化、抗分解代謝[2]等一系列生物活性，其本身也不含稀有氨基酸和外源化學(xué)成分，可以被機(jī)體中的酶消化吸收，不具有免疫原性，因此是一種安全、環(huán)保、高效的新型生物抗菌肽。在醫(yī)療、食品、飼料、保鮮等領(lǐng)域展現(xiàn)了廣泛的應(yīng)用前景，而成為研究和關(guān)注的熱點(diǎn)。

目前國(guó)內(nèi)外制備LfcinB的主要問(wèn)題在于來(lái)源困難和純化LfcinB需采用多種分離純化方法，造成成本太高，很多研究只限于實(shí)驗(yàn)室，難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，因此采用基因工程技術(shù)解決LfcinB的來(lái)源問(wèn)題，同時(shí)優(yōu)化LfcinB的純化工藝實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)對(duì)新一代生物抗菌肽發(fā)展具有重大意義。

1　牛乳鐵蛋白肽的抑菌功能

Abe等[3]進(jìn)行了脫鐵型乳鐵蛋白(lactoferrin)在pH 2.0～3.0條件下的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白發(fā)生了明顯的降解，但是其抗菌活性卻大大增加，于是推測(cè)乳鐵蛋白中存在耐熱的抗菌多肽。同時(shí)用胃蛋白酶和胰蛋白酶處理乳鐵蛋白，雖然會(huì)影響乳鐵蛋白的空間結(jié)構(gòu)和抗原性，但不能消除乳鐵蛋白的抗菌效果[4]，這一點(diǎn)也說(shuō)明乳鐵蛋白中存在抗菌肽。之后又相繼發(fā)現(xiàn)多種動(dòng)物中存在抗菌肽，其中以LfcinB的抗菌效果最為顯著。LfcinB在生物活性上與乳鐵蛋白(lactoferrin)幾乎一致，其不同點(diǎn)就是不能與鐵離子相結(jié)合，但牛乳鐵蛋白肽具有更強(qiáng)的抗菌能力[5]。目前研究最多的也是它的抗菌活性，它具有廣譜的抗菌效果。其抗菌機(jī)理主要是通過(guò)阻斷菌類對(duì)鐵源的吸收[6]或通過(guò)影響細(xì)胞的遺傳物質(zhì)和細(xì)胞器來(lái)達(dá)到抑菌的功能[7]。但對(duì)于不同的菌類具有不同程度的抑菌效果，這主要是因?yàn)槟承┘?xì)菌細(xì)胞膜表面存在一種可以抵抗乳鐵蛋白(LF)殺傷力的蛋白受體——乳鐵蛋白結(jié)合蛋白B (LbpB)[8]。

根據(jù)Bellamy等[9]用LfcinB對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、需氧菌、厭氧菌和兼性厭氧菌等近40種菌進(jìn)行了抑菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)LfcinB不僅可以抑制細(xì)菌，對(duì)絲狀真菌、酵母菌也有不同程度的抑制，如煙曲霉菌(Aspergillusfumigatus)、青霉(Penicilliumpinophilum)和隱球酵母菌(Cryptococcusuniguttulatus)等，尤其是對(duì)大腸桿菌(Escherichiacoli)、腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、鏈球菌(Streptococcus)、微球菌(Micrococca)、產(chǎn)氣夾膜梭菌(Clostridiumperfringens)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus)、白色念珠菌(Moniliaalbican)等具有較強(qiáng)的抑制作用。其中LfcinB對(duì)糞腸道球菌(Entercoccusfaecalis)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)的抑菌效果最差，而對(duì)人類腸道消化有益的菌種如雙歧桿菌(Bifidobacteriun)完全沒有抵抗作用，同時(shí)還能增加溶菌酶活性和有機(jī)酸的含量，刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，降低胃腸道液的pH;對(duì)其他的菌株也在不同程度上達(dá)到了抑制效果。通過(guò)分析菌種可以看出，LfcinB對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌更為敏感，其抑菌濃度大致在0.6～45 μg/mL。

食品安全與民生息息相關(guān)，開發(fā)全天然、綠色、無(wú)污染的新型抗菌肽具有重大意義。而LfcinB抗菌種類多且抗菌效果突出，同時(shí)LfcinB的抗菌種類大多是肉類、魚類、蔬菜、水果腐敗的主要菌種。然而LfcinB的開發(fā)卻受到LfcinB來(lái)源困難、成本高等因素的限制，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，限制了其利用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)將是實(shí)現(xiàn)LfcinB低成本大規(guī)模生產(chǎn)最有效的途徑。

2　采用基因工程技術(shù)生產(chǎn)牛乳鐵蛋白肽

牛體內(nèi)牛乳鐵蛋白肽的含量很少，利用蛋白酶體外水解牛乳鐵蛋白分離操作復(fù)雜、原材料獲取困難、費(fèi)用高，不能滿足大規(guī)模生產(chǎn)利用的需要，而化學(xué)合成法往往適用于合成一些高價(jià)的藥理級(jí)肽，對(duì)于牛乳鐵蛋白肽的合成成本太高，同時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生一些對(duì)人體有害的副產(chǎn)品。目前研究表明利用基因工程中DNA體外重組技術(shù)可在不同的表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)有效表達(dá)，但與其他方法相比技術(shù)尚未成熟，其限制因素主要在于表達(dá)牛乳鐵蛋白肽的產(chǎn)率、活性均較低，后期的分離存在問(wèn)題，因此利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)LfcinB和改良基因工程技術(shù)是目前實(shí)現(xiàn)牛乳鐵蛋白肽低成本工業(yè)化生產(chǎn)最有效的途徑。

2.1LfcinB基因工程制備的優(yōu)勢(shì)

基因工程制備LfcinB主要有以下幾個(gè)方面的優(yōu)勢(shì)：①牛乳鐵蛋白肽的分子量約為3 100 Da，一級(jí)結(jié)構(gòu)由25個(gè)氨基酸殘基組成，其氨基酸序列為FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF。分子量小，序列較短容易合成，有利于DNA的體外重組；②LfcinB的2個(gè)半胱氨酸(Cys)會(huì)形成分子內(nèi)二硫鍵，使其形成一個(gè)類似環(huán)狀的結(jié)構(gòu)，這個(gè)結(jié)構(gòu)可以有效的阻止蛋白酶對(duì)LfcinB的降解，但該結(jié)構(gòu)對(duì)其抑菌作用并沒有明顯的影響。Hoek等[10]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)二硫鍵被破壞后，失去了環(huán)狀結(jié)構(gòu)依然具有與LfcinB相似的抑菌活性。因此在利用原核和真核生物表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，即使缺少翻譯后精準(zhǔn)的加工修飾過(guò)程，不能有效的形成二硫鍵，也不會(huì)影響其抗菌方面的應(yīng)用，減少了基因工程技術(shù)操作難度；③Vogel等[11]分析了LfcinB中的結(jié)構(gòu)與抗菌活性間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)LfcinB中的11個(gè)氨基酸(RRWQWRMKKL)具有與完整肽鏈相同的抗菌活性。Hilchie等[12]研究認(rèn)為其活性中心是色氨酸/精氨酸(Trp/Arg)集中的區(qū)域(RRWQWR)。所以利用基因工程技術(shù)表達(dá)時(shí)，即使出現(xiàn)個(gè)別堿基的缺少或者突變，只要保證其活性中心的堿基序列正常，可能就不會(huì)影響其抗菌活性。同時(shí)利用這一點(diǎn)還可以對(duì)牛乳鐵蛋白肽的氨基酸序列進(jìn)行修飾，減少氨基酸合成的數(shù)目，降低基因工程的操作難度，使其能夠更有效的表達(dá)。④ LfcinB在其完整結(jié)構(gòu)中呈現(xiàn)的二級(jí)結(jié)構(gòu)是α螺旋結(jié)構(gòu)，當(dāng)LfcinB從牛乳鐵蛋白上水解下來(lái)時(shí)，其二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)轉(zhuǎn)變成β折疊結(jié)構(gòu)，而β折疊結(jié)構(gòu)比α螺旋結(jié)構(gòu)更有利于與細(xì)胞膜接觸。這一特性減少了利用基因工程技術(shù)對(duì)一些進(jìn)行高級(jí)結(jié)構(gòu)修飾后需要保證其原有的空間結(jié)構(gòu)才能發(fā)揮功能的物質(zhì)的操作難度。

可見利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)LfcinB存在眾多優(yōu)點(diǎn)。但是不同的表達(dá)系統(tǒng)也存在各自的優(yōu)缺點(diǎn)，針對(duì)這些缺點(diǎn)，基因工程改良制備是實(shí)現(xiàn)LfcinB工業(yè)化生產(chǎn)的有效途徑。

2.2LfcinB基因工程改良制備

不同的表達(dá)系統(tǒng)存在不同的優(yōu)缺點(diǎn)，目前主要利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)和酵母菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行LfcinB的生產(chǎn)。一方面這兩種表達(dá)系統(tǒng)的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，另一方面遺傳操作相對(duì)比較簡(jiǎn)單。但這兩種表達(dá)系統(tǒng)都有各自的缺陷，基于這些缺陷人們開始探索LfcinB在基因工程上的改良。目前主要有以下幾種方案。

2.2.1改良LfcinB抗菌活性LfcinB的抗菌過(guò)程中，色氨酸(Trp)起了關(guān)鍵的作用，Trp中的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)與膜表面上的甘油相互作用，促進(jìn)了LfcinB與質(zhì)膜的有效結(jié)合。Strom等[13]利用基因突變技術(shù)將LfcinB上的第6位的色氨酸(Trp)突變成了丙氨酸(Ala)后，發(fā)現(xiàn)其抗菌活性明顯下降。同時(shí)發(fā)現(xiàn)其他物種的Lfcin中增加Trp的數(shù)量，能夠增加其抗菌活性[14]。Murata等[15]通過(guò)加入牛奶核糖核酸酶(MR15)可有效增強(qiáng)乳鐵蛋白肽的抗菌活性，因此推測(cè)乳鐵蛋白在體內(nèi)可能與MR15結(jié)合共同發(fā)揮抗菌能力。盡管這些方法提高了LfcinB的抗菌活性，但提高的幅度相對(duì)較小，甚至增加了生產(chǎn)成本，因此并不能解決LfcinB在生產(chǎn)過(guò)程中高成本的問(wèn)題。

2.2.2融合表達(dá)因?yàn)長(zhǎng)fcinB抗菌作用影響了大腸桿菌和酵母菌的正常生長(zhǎng)，使得培養(yǎng)后達(dá)不到較高的濃度，這一缺點(diǎn)現(xiàn)在多采用融合表達(dá)予以克服。田子罡等[16]利用pET32a質(zhì)粒在E.coliBL-21實(shí)現(xiàn) LfcinB15-W4，10的串聯(lián)融合表達(dá)，經(jīng)分離后具有抗菌活性。 Kim等[17]利用乳鐵蛋白肽與銀離子肽成功在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了融合表達(dá)，同時(shí)也具有抗菌活性；分析原因可能是LfcinB發(fā)揮抗菌作用與LfcinB本身的兩性特征分不開，當(dāng)進(jìn)行融合表達(dá)時(shí)由于N端的封閉以及受到周圍其他氨基酸的影響，破壞了原有的空間結(jié)構(gòu)，使LfcinB抗菌活性大大降低，不影響表達(dá)系統(tǒng)中菌類的正常生長(zhǎng)。這一方法雖然提高了表達(dá)量，但在后續(xù)的純化過(guò)程中依然面臨復(fù)雜繁瑣的分離操作，難以實(shí)現(xiàn)低成本制備。

2.2.3復(fù)性大腸桿菌在表達(dá)真核生物蛋白時(shí)形成包涵體，目前多采用離心、洗滌、重懸和超聲波破碎等方式獲得包涵體，再采用氧化型的溶劑進(jìn)行復(fù)性處理得到目的蛋白。包涵體的形成有效地將體內(nèi)可溶性蛋白進(jìn)行了區(qū)分，同時(shí)避免了蛋白酶對(duì)目的蛋白的降解，提高了目的蛋白的產(chǎn)率。但是蛋白包涵體的形成也加大了目的蛋白的生產(chǎn)成本，尤其是復(fù)性過(guò)程中常常伴隨著蛋白質(zhì)的沉淀和水解[18]。因此成為蛋白質(zhì)工程中最為復(fù)雜的一個(gè)環(huán)節(jié)。LfcinB在表達(dá)抑菌功能時(shí)，并不需要很高級(jí)的空間結(jié)構(gòu)，因此利用大腸桿菌表達(dá)LfcinB降低了復(fù)性的操作難度。

雖然基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)LfcinB的生產(chǎn)，但在產(chǎn)物的純化效率和活性等方面嚴(yán)重制約了LfcinB投入商業(yè)化的進(jìn)程。因此未來(lái)更多的研究方向應(yīng)該集中在如何降低LfcinB的生產(chǎn)成本。可通過(guò)將修飾LfcinB的基因與其他基因片段進(jìn)行融合表達(dá)，這樣既解決了表達(dá)量的問(wèn)題，同時(shí)又提高了LfcinB的抗菌活性。也可通過(guò)從一些嗜熱、嗜強(qiáng)酸、嗜強(qiáng)堿的菌類中分離其作用片段與LfcinB進(jìn)行融合表達(dá)，借助融合基因的特點(diǎn)大大的簡(jiǎn)化分離操作。這一點(diǎn)暫時(shí)還沒有實(shí)驗(yàn)證明。但是一旦證明可行，不僅可降低LfcinB的制備成本，同時(shí)也有可能應(yīng)用到其他生物活性肽的制備中。

3　展望

LfcinB的研究始于20世紀(jì)80～90年代，早期的研究主要集中在對(duì)不同生物體Lfcin的抗菌效果、抗菌種類、抗菌機(jī)制和結(jié)構(gòu)等方面的研究。目前的研究主要傾向于LfcinB的抗病毒、抗癌、免疫等醫(yī)學(xué)方面的研究。而很少涉及到將LfcinB制成食品保鮮劑、抗生素、飼料添加劑、乳制品添加劑等用于日常生活中。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)解決其來(lái)源不足的問(wèn)題已經(jīng)成為趨勢(shì)，許多研究人員已相繼在不同的生物表達(dá)體系中實(shí)現(xiàn)了對(duì)LfcinB的表達(dá)。其優(yōu)勢(shì)一方面在于LfcinB的肽鏈比較短，容易構(gòu)建基因重組的載體，另外LfcinB發(fā)揮抗菌作用的氨基酸數(shù)量較少，出現(xiàn)基因突變很少影響其抗菌能力。因此利用基因工程技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模有效的生產(chǎn)，無(wú)疑是未來(lái)最佳的選擇。這方面的發(fā)展也同時(shí)受到了國(guó)內(nèi)外許多商業(yè)機(jī)構(gòu)和研究部門的認(rèn)同和高度關(guān)注。

關(guān)于LfcinB的研究已經(jīng)做了相當(dāng)多的工作，而對(duì)于牛乳鐵蛋白中的另一抗菌肽Lfampin的研究卻較少，van der Kraan等[19]在白色念珠菌和大腸桿菌中做了研究，發(fā)現(xiàn)這兩段肽會(huì)有幾分鐘的內(nèi)在化，同時(shí)擾亂細(xì)胞膜的完整性，在膜的表面出現(xiàn)了一個(gè)類似囊狀的結(jié)構(gòu)，而且Lfampin的囊狀化程度高于LfcinB，這一點(diǎn)說(shuō)明Lfampin在某些菌類中的抗菌效果可能優(yōu)于LfcinB。Flores-Villaseor等[20]通過(guò)對(duì)LfcinB、Lfampin以及這兩者組合成的聯(lián)合肽(LFchimera)對(duì)耐藥性的大腸桿菌和金黃色葡糖球菌進(jìn)行了抗菌性比較，發(fā)現(xiàn)LFchimera要優(yōu)于LfcinB和Lfampin的抗菌效果。因此在加大LfcinB的研究和開發(fā)力度的同時(shí)，加大對(duì)Lfampin的開發(fā)以及這種聯(lián)合表達(dá)方式的研究，采用多種抗菌肽聯(lián)合使用，來(lái)達(dá)到更好的抑菌效果。

LfcinB生產(chǎn)成本是目前亟待解決的問(wèn)題。而一旦解決了LfcinB的生產(chǎn)工藝和成本問(wèn)題。不僅有利于新型天然保鮮劑的開發(fā)、抗生素的生產(chǎn)，同時(shí)對(duì)食品、化妝品、飼料、醫(yī)療、藥物等各個(gè)領(lǐng)域的研究都是一個(gè)重大的突破，有望實(shí)現(xiàn)新一代抗菌類產(chǎn)品的開發(fā)和利用。

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Progress on Antibacterial Function and Preparation by Genetic Engineering of Bovine Lactoferrin

ZHANG Yun-wei, SU Hang, DIAO Yong, QI Zhi-qing*

CollegeofBiomedicine,HuaqiaoUniversity,FujianQuanzhou362021,China

Lactoferricin bovine(LfcinB) is a kind of small peptide which derives from lactoferrin when it was mainly generated by the pepsin-mediated digestion from N-terminal of lactoferrin. It contains 25 amino acids residues and a number of biological functions, including antimicrobial, anticancer, antioxidant and immunomodulatory effects. So LfcinB has become the focus of research. To date, high process production costs made it difficult to produce on more commercial level scale. Genetic engineering will be the best method to produce LfcinB. This paper gave an overview on antimicrobial activities of LfcinB and its production by genetic engineering including the advantage and improve, which aimed to provide new ideas about genetic engineering produce LfcinB.

lactoferricin bovine; antibacterial peptides; genetic engineering

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.04.02

2016-03-01; 接受日期：2016-04-08

福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016N51010032) 資助。

張?jiān)仆?，碩士研究生，研究方向分子生物學(xué)。E-mail：932136251@qq.com。*通信作者：戚智青，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事基因工程研究。E-mail：zqqi@hotmail.com