劉紅陽,　茆廣華,　許　海,　馮偉偉,　趙　婷,　丁陽陽,　陳　瑤,　仰榴青,吳向陽*

1.江蘇大學(xué)環(huán)境安全與工程學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013;2.江蘇大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013

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鉛和鄰苯二甲酸二丁酯聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎的影響

劉紅陽1,茆廣華1,許海1,馮偉偉1,趙婷2,丁陽陽2,陳瑤1,仰榴青2,吳向陽1*

1.江蘇大學(xué)環(huán)境安全與工程學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013;2.江蘇大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013

為了研究鉛(Pb)和鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎神經(jīng)發(fā)育和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響，考察兩者對(duì)斑馬魚胚胎神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用。將720個(gè)斑馬魚胚胎按3×3析因設(shè)計(jì)隨機(jī)分為9組，以Pb(0、0.01 mg/L和1 mg/L)和DBP(0、0.005 mg/L和0.5 mg/L)單獨(dú)及聯(lián)合對(duì)斑馬魚胚胎暴露120 h。觀察、記錄胚胎的孵化、死亡情況，采用熒光定量PCR測(cè)定斑馬魚胚胎神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因(NR1A、NR2A、NR2D)和神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(bcl-2、c-fos)的表達(dá)變化情況。與空白對(duì)照組相比，各暴露組均可致斑馬魚胚胎孵化率降低、死亡率增高(P<0.05)；聯(lián)合暴露組NR1A、NR2A、NR2D、c-fos基因表達(dá)水平顯著升高，bcl-2基因表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。Pb和DBP均可影響斑馬魚胚胎的發(fā)育，且具有一定的神經(jīng)毒性，而二者聯(lián)合暴露毒性復(fù)雜，對(duì)斑馬魚胚胎孵化率和死亡率的影響有交互作用，對(duì)神經(jīng)發(fā)育和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因無交互作用，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

鉛；鄰苯二甲酸二丁酯；聯(lián)合暴露；斑馬魚胚胎；基因表達(dá)

鉛(Pb)是一種普遍存在的環(huán)境有毒重金屬污染物，可對(duì)機(jī)體內(nèi)多個(gè)系統(tǒng)和器官造成損傷，并且能夠在神經(jīng)組織中蓄積，引起神經(jīng)系統(tǒng)功能的長(zhǎng)期損害。鄰苯二甲酸二丁酯(dinbutyl phthalate，DBP)常作為增塑劑，添加在聚氯乙烯、聚醋酸乙烯酯、纖維素和聚氨酯中，同時(shí)其生成的化合物被廣泛應(yīng)用于密封膠、涂料、粘合劑、化妝品和食品包裝等產(chǎn)品中。Pb和DBP都是常見的水體污染物，可通過工業(yè)廢水排放等方式進(jìn)入水體，在我國(guó)部分河流、水源均有檢出[1,2]。兩者可通過多種方式(如飲入、食入或皮膚直接接觸等)暴露于人體。長(zhǎng)期低劑量接觸Pb和DBP可對(duì)人類和動(dòng)物造成不同程度的損傷，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)方面[3,4]。多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道集中于Pb和DBP單獨(dú)暴露，關(guān)于它們聯(lián)合暴露的毒性鮮有報(bào)道。斑馬魚是一種理想的模式生物，常用于毒性測(cè)試和毒理研究。本文以斑馬魚胚胎為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究低濃度的Pb和DBP單獨(dú)及聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎神經(jīng)和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響，以探討Pb和DBP聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用。

1　材料與方法

1.1材料

醋酸鉛和DBP購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司； RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所；NR1A、NR2A、NR2D、bcl-2、c-fos和rpl13A引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成；其他試劑均為分析純。

實(shí)驗(yàn)用AB品系斑馬魚，親本魚購(gòu)于國(guó)家斑馬魚資源中心。斑馬魚的養(yǎng)殖參照《Zebrafish Book》[5]對(duì)斑馬魚進(jìn)行喂養(yǎng)、繁殖和培育，每日喂2次水蝦(鹵蟲無節(jié)幼體)。幼魚5月大后將雌雄魚分開飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前1 d，將7～18月大的雌雄親本魚按比例放入到交配缸中(雌∶雄=1∶2)，第2天早上取出隔板讓雌雄斑馬魚自行交配，采集30 min內(nèi)產(chǎn)下的受精卵。將胚胎置于恒溫孵箱中，28.5℃孵育6 hpf(受精后6 h)，備用。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)按3×3析因設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)分為9組。根據(jù)生活飲用水Pb限值0.01 mg/L，DBP限值0.003 mg/L[6]，并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的前期研究結(jié)果[7,8]，各實(shí)驗(yàn)組的暴露劑量見表 1。

表1　Pb和DBP劑量

1.2.2斑馬魚胚胎試驗(yàn)將孵育6 hpf的斑馬魚胚胎置于6孔培養(yǎng)板，每孔20只，用去離子水洗凈后，每孔加入500 μL工作液，每個(gè)劑量受試液設(shè)4個(gè)平行。分別在24 hpf、48 hpf、72 hpf和96 hpf 更換受試液，于120 hpf觀察記錄脫模后幼魚的死亡數(shù)及幼魚的孵化數(shù)，統(tǒng)計(jì)胚胎的死亡率和孵化率并收集幼魚于-80℃冷凍備用。

1.2.3胚胎神經(jīng)發(fā)育和凋亡相關(guān)基因表達(dá)采用Real-time PCR方法測(cè)定胚胎神經(jīng)發(fā)育相關(guān)NR1A、NR2A、NR2D，凋亡相關(guān)bcl-2、c-fos以及管家基因rpl13A的表達(dá)水平?？俁NA的提取和cDNA的合成：用Trizol法提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度和RNA質(zhì)量(A260/A280為1.8～2.0)。采用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)(引物序列見表2)，SYBR 熒光實(shí)時(shí)定量 PCR 法測(cè)定 mRNA的表達(dá)情況。反應(yīng)參數(shù)：95℃變性 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本的RNA含量均根據(jù)各自的rpl13A含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。目的基因表達(dá)數(shù)據(jù)采用2-△△Ct相對(duì)表達(dá)定量方法分析獲得。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

表2　本研究所用引物序列

2　結(jié)果與分析

2.1Pb和DBP聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎孵化率和死亡率影響

對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育情況一般觀察，與空白對(duì)照組相比，低濃度的Pb和DBP對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育期間形態(tài)基本無影響，高濃度的DBP和聯(lián)合暴露組，斑馬魚胚胎出現(xiàn)發(fā)育遲緩。如表3所示，Pb和DBP單獨(dú)暴露組斑馬魚胚胎的孵化率隨著暴露濃度的增加逐漸降低，死亡率隨著暴露濃度的增加逐漸升高。與對(duì)照組相比，各暴露組(除Pb-L和DBP-L)可顯著降低胚胎的孵化率，增加胚胎的死亡率(P<0.05)；與Pb組和DBP組相比，Pb+DBP組中胚胎孵化降低，死亡率增加(P<0.05)。由表3可知，Pb和DBP聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎孵化率和死亡率的影響存在交互作用且為協(xié)同作用(P<0.05)。

表3　Pb和DBP聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚孵化率和死亡率的影響±s)

注：a：與空白對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)； b：Pb+DBP組與Pb組比較差異顯著(P<0.05)；c：Pb+DBP組與DBP組比較差異顯著(P<0.05)。

表4　方差分析結(jié)果

2.2Pb和DBP聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎 NMDA受體基因表達(dá)的影響

Pb和DBP單獨(dú)和聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎NR1A基因表達(dá)的影響見圖1A。與對(duì)照組相比，各暴露組(除Pb-L、DBP-L和Pb-L+DBP-L)NR1A基因的表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)；與Pb組相比，Pb-L+DBP-H和Pb-H+DBP-H組NR1A基因的表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)；與DBP組相比，Pb-H+DBP-L 和Pb-H+DBP-H組的NR1A基因的表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)。

Pb和DBP單獨(dú)和聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎NR2A基因表達(dá)水平見圖1B。與對(duì)照組相比，各暴露組(除Pb-L和DBP-L)NR2A基因的表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)；與Pb組相比，Pb+DBP組(除Pb-H+DBP-L)NR2A基因的表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)；與DBP組相比， Pb-H+DBP-L和Pb-H+DBP-H組NR2A基因的表達(dá)水平顯著上升(P<0.05)。

Pb和DBP單獨(dú)和聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎NR2D基因表達(dá)水平見圖1C。與對(duì)照組相比，Pb+DBP組(除Pb-L+DBP-L)NR2D基因表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)；Pb-H+DBP-H組與Pb和DBP組相比，NR1A基因表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)。析因分析表明，Pb和DBP聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎NR1A、NR2A和NR2D基因表達(dá)的影響不存在交互作用(P>0.05)。

圖1　Pb和DBP聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎NMDA受體基因表達(dá)水平的影響Fig.1　Effects of co-exposure to Pb and DBP on the expression level of NMDA receptor gene from zebrafish embryos.A：NR1A; B：NR2A; C：NR2D。a：與空白對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)； b：Pb+DBP組與Pb組比較差異顯著(P<0.05)；c：Pb+DBP組與DBP組比較差異顯著(P<0.05)。

2.3斑馬魚胚胎凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平的變化

Pb和DBP單獨(dú)和聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎bcl-2基因表達(dá)水平見圖2A。與對(duì)照組相比，Pb-H、Pb-L+DBP-H、Pb-H+DBP-H組顯著下調(diào)bcl-2基因表達(dá)水平(P<0.05)；與Pb組相比，Pb-H+DBP-H組的bcl-2表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)；與DBP組相比，Pb-L+DBP-H和Pb-H+DBP-H組的bcl-2表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)。

Pb和DBP單獨(dú)和聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎c-fos基因表達(dá)水平由2B可知。與對(duì)照組相比，各暴露組(除Pb-L和DBP-L)c-fos基因表達(dá)水平顯著增高(P<0.05)；與Pb組相比， Pb+DBP組(除Pb-H+DBP-L)的c-fos基因表達(dá)水平增加(P<0.05)；與DBP組相比，Pb-H+DBP-H的c-fos基因表達(dá)水平顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；析因分析表明，Pb和DBP聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎bcl-2和c-fos的基因表達(dá)的影響不存在交互作用(P>0.05)。

圖2　Pb及DBP對(duì)斑馬魚胚胎凋亡相關(guān)基因表達(dá)水平的影響Fig.2　Effects of co-exposure to Pb and DBP on the expression level of apoptosis-related genes from zebrafish embryos.A:bcl-2; B:c-fos。a：與空白對(duì)照組比較差異顯著(P<0.05)； b：Pb+DBP與Pb組比較差異顯著(P<0.05)；c：Pb+DBP與DBP組比較差異顯著(P<0.05)。

3　討論

研究表明Pb和DBP侵入生物體，會(huì)對(duì)神經(jīng)中樞產(chǎn)生毒性作用，包括干擾神經(jīng)遞質(zhì)、改變受體的密度、分布和功能，改變神經(jīng)細(xì)胞的DNA代謝和釋放以及誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡等。目前，Pb和DBP的毒性研究主要集中在單一暴露。張小晶等[13]發(fā)現(xiàn)Pb對(duì)斑馬魚胚胎發(fā)育有明顯的毒性作用且可引起神經(jīng)細(xì)胞的損害。Chen等[14]發(fā)現(xiàn)0.1～1 mg/L的醋酸鉛暴露于斑馬魚胚胎后可導(dǎo)致斑馬魚胚胎發(fā)育毒性，且可對(duì)成魚的學(xué)習(xí)記憶能力造成一定的損傷；DBP(1 250 mg/L)暴露于斑馬魚，可引起斑馬魚的發(fā)育毒性[15]。本文采用熒光定量RT-PCR方法研究Pb和DBP暴露于斑馬魚胚胎對(duì)神經(jīng)相關(guān)基因NR1A、NR2A和NR2D及細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bcl-2和c-fos表達(dá)量的影響,首次研究了Pb和DBP的聯(lián)合毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在單獨(dú)暴露組中，隨著暴露劑量升高，斑馬魚的孵化率逐漸降低，死亡率逐漸升高；斑馬魚單獨(dú)暴露于低濃度的Pb(0.01 mg/L)和DBP(0.005 mg/L)死亡率低于10%，胚胎孵化率沒有明顯影響，而當(dāng)Pb-L+DBP-L暴露時(shí)，斑馬魚胚胎死亡率達(dá)到18.75%，胚胎孵化率降至47.50%。說明DBP加強(qiáng)了Pb的毒性，且二者表現(xiàn)出協(xié)同作用。

谷氨酸NMDA(N-methyl-D-aspartate，N-甲基-D-天冬氨酸)受體基因是神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因，在神經(jīng)發(fā)育及學(xué)習(xí)記憶過程中起到至關(guān)重要的作用，其中NR1亞基是組成功能性的NMDA受體所必備的；NR2(包含NR2A～NR2D亞型)亞基為輔助NMDA受體形成多元化結(jié)構(gòu)[16]。NR2A和NR2D表現(xiàn)出“雙向調(diào)節(jié)”作用，低頻刺激可被激活并對(duì)學(xué)習(xí)記憶產(chǎn)生增強(qiáng)作用，過度表達(dá)或激活，會(huì)出現(xiàn)谷氨酸興奮性毒性反應(yīng)，引起學(xué)習(xí)記憶受損的認(rèn)知功能障礙。因此，通過NMDA受體的基因表達(dá)水平的變化，可以衡量不同化學(xué)物質(zhì)的神經(jīng)毒性作用。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果表明低濃度的Pb和DBP單獨(dú)暴露不會(huì)引起NR1A、NR2A基因表達(dá)水平的顯著變化，但是高濃度的Pb和DBP以及Pb+DBP聯(lián)合暴露可以誘導(dǎo)斑馬魚胚胎NR1A、NR2A基因表達(dá)水平的增加；低濃度和高濃度Pb和DBP單獨(dú)暴露不會(huì)引起NR2D基因表達(dá)水平顯著變化，但Pb+DBP聯(lián)合暴露可以上調(diào)斑馬魚胚胎NR2D基因表達(dá)水平。Pb和DBP單獨(dú)和聯(lián)合暴露可能通過影響神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)斑馬魚胚胎產(chǎn)生神經(jīng)毒性。NMDA受體對(duì)Ca2+有較高的通透性，被持續(xù)激活后Ca2+大量增加，引起Ca2+超載，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡；當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生病變時(shí)，NMDA受體過度激活可對(duì)神經(jīng)組織造成不利影響[17]。本實(shí)驗(yàn)中Pb和DBP聯(lián)合暴露誘導(dǎo)NR1A、NR2A和NR2D上調(diào)，可能是由于NMDA受體被過度激活。有文獻(xiàn)報(bào)道[18]0.1 μmol/L、0.5 μmol/L、2.5 μmol/L和12.5 μmol/L劑量的Pb暴露于斑馬魚胚胎醋酸，發(fā)現(xiàn)Pb可上調(diào)NR1.1、NR1.2和NR2BmRNA的表達(dá)，改變了正常的NMDA受體表達(dá)規(guī)律，與本文研究結(jié)果一致。

bcl-2和c-fos均為細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，其表達(dá)與突觸活動(dòng)相關(guān)并在長(zhǎng)期記憶形成和鞏固中起著重要作用[19]。bcl-2為抑凋亡基因,c-fos為促凋亡基因，在細(xì)胞凋亡中起重要作用，發(fā)育早期神經(jīng)元細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致神經(jīng)毒性。本文研究結(jié)果表明，低濃度的Pb和DBP單獨(dú)暴露不會(huì)引起bcl-2和c-fos基因表達(dá)水平顯著變化，但是高濃度的Pb和DBP以及Pb+DBP聯(lián)合暴露可以誘導(dǎo)斑馬魚神經(jīng)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因bcl-2表達(dá)量下降，高濃度的Pb以及Pb+DBP聯(lián)合暴露可以誘導(dǎo)c-fos表達(dá)量上升，且無交互作用。提示DBP和Pb聯(lián)合暴露增強(qiáng)了Pb對(duì)斑馬魚胚胎bcl-2和c-fos基因表達(dá)的影響，Pb和DBP單獨(dú)和聯(lián)合暴露可能通過影響神經(jīng)胚胎細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，產(chǎn)生神經(jīng)毒性。多種刺激均可誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中c-fos基因的表達(dá)，c-fos不恰當(dāng)?shù)谋磉_(dá)或突變可誘發(fā)細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)其表達(dá)的相關(guān)機(jī)制主要與NMDA、NO、Ca2+和γ-氨基丁酸(GABA)等因素有關(guān)[20]。bcl-2在細(xì)胞凋亡中起抗凋亡作用，但被酶解后失去了抗凋亡的作用，加速了細(xì)胞凋亡；當(dāng)bcl-2表達(dá)降低時(shí)，使線粒體跨膜電位耗散并釋放細(xì)胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子[21]。由此推測(cè)，通過下調(diào)bcl-2基因表達(dá)，上調(diào)c-fos基因表達(dá)水平可抑制細(xì)胞增殖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有文獻(xiàn)報(bào)道[22]，Pb暴露使斑馬魚胚胎的bcl-2表達(dá)水平下調(diào)，c-fos基因表達(dá)水平上升，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生，這與本文研究結(jié)果一致。

綜上所述，Pb和DBP暴露對(duì)斑馬魚胚胎死亡率和孵化率均具有一定的影響且聯(lián)合暴露存在協(xié)同作用。低濃度的Pb和DBP單獨(dú)暴露對(duì)NMDA受體以及凋亡相關(guān)基因bcl-2和c-fos影響很小，但是聯(lián)合暴露組對(duì)NR1A、NR2A、NR2D、bcl-2和c-fos有顯著影響。說明二者均可影響斑馬魚胚胎的發(fā)育，且具有一定的神經(jīng)毒性，而二者聯(lián)合暴露毒性復(fù)雜，無交互作用，其致毒的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Effect of Combined Exposure of Lead and Dibutyl Phthalate on Embryo of Zebra Fish (Daniorerio)

LIU Hong-yang1, MAO Guang-hua1, XU Hai1, FENG Wei-wei1, ZHAO Ting2, DING Yang-yang2, CHEN Yao1, YANG Liu-qing2, WU Xiang-yang1*

1.SchooloftheEnvironmentandSafetyEngineering,JiangsuUniversity,JiangsuZhenjiang212013,China;2.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,JiangsuUniversity,JiangsuZhenjiang212013,China

The aim of the research was to study the effect of individual and combined exposure to lead (Pb)and dinbutyl phthalate(DBP) on the neurological and apoptosis-related gene expressions, and the effect on the nervous system of zebra fish embryos. According to the 3×3 factorial design, 720 zebra fish embryos were randomly divided into 9 groups, Pb (0, 0.01 mg/L,1 mg/L) and DBP (0, 0.005 mg/L,0.5 mg/L) were administered individually and mixtures to zebra fish embryos for 120 h, hatchability and mortality were record. Quantitative real-time PCR was used to assess neurological gene (NR1A,NR2A,NR2D) and apoptosis-related gene (bcl-2,c-fos) expressions. Exposure to individual and combined of Pb and DBP could cause decrease in hatchability and increase in mortality. There was an interaction between Pb and DBP on hatchability and mortality(P<0.05). Co-exposure to Pb and DBP up-regulatedNR1A,NR2A,NR2D,c-fosgene and down-regulatedbcl-2 gene (P<0.05). Exposure to Pb and DBP could impaire the development of zebra fish embryos and cause a certain neurotoxicity. The joint toxicity of them was complicated. It has interaction effect on the hatching rate and mortality and no interaction on neurological gene and apoptosis related genes of zebra fish embryos. The mechanism needs to be further studied.

lead; dibutyl phthalate; combined exposure; embryo ofDaniorerio; gene expression

10.3969/j.issn.2095-2341.2016.04.05

2016-04-08; 接受日期：2016-04-28

江蘇高校協(xié)同創(chuàng)新中心計(jì)劃資助。

劉紅陽，碩士研究生，主要從事環(huán)境化學(xué)相關(guān)研究。E-mail: 405389805@qq.com。*通信作者：吳向陽，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事環(huán)境化學(xué)、水污染控制和農(nóng)業(yè)資源高效利用等研究。E-mail:wuxy@ujs.edu.cn