汪多仁

（中國(guó)石油吉林石化公司）

技術(shù)發(fā)展方向—技術(shù)應(yīng)用

Biopol生物降解塑料的開發(fā)與應(yīng)用（上）

汪多仁

（中國(guó)石油吉林石化公司）

全文介紹了生物降解塑料的性能，生產(chǎn)的主要技術(shù)路線與最佳的操作條件及有關(guān)進(jìn)展情況。對(duì)于工業(yè)化運(yùn)行的主要生物降解塑料生產(chǎn)工藝的技術(shù)特點(diǎn)進(jìn)行了具體的分析和總結(jié)，闡述了國(guó)內(nèi)外研究開發(fā)的現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢(shì)。并探討了擴(kuò)大應(yīng)用范圍等的前景與市場(chǎng)需求。

Biopol生物降解塑料開發(fā)應(yīng)用

1 理化性能

Biopol商品名為3－羥基丁酸－3－羥基戊酸共聚物（P3HB／3HV），相對(duì)分子質(zhì)量可達(dá)幾十萬(wàn)，HV的含量不等，相對(duì)密度1.25g／cm3。為可降解的生物塑料。其特點(diǎn)是3HV的含量高，柔韌性好，具有高的抗沖擊性，但楊氏模量較低。Biopol從硬質(zhì)到軟質(zhì)的機(jī)械性、耐熱性、耐化學(xué)品性與氣體屏障性好是，燃燒熱值低。在好氣與厭氣的條件下均具有良好的生物降解性。在空氣與凈水中不發(fā)生降解。

因組成聚合物的單體不同，聚羥基丁酸酯衍生聚合物可分為不同的種類，如多聚羥基丁酸簡(jiǎn)稱PHB、羥基丁酸和羥基戊酸共聚體、羥基丁酸和羥基己酸共聚體、羥基丁酸和羥基辛酸共聚體等。單體的碳原子數(shù)量不等，而且碳鏈之間可以是飽和鍵或不飽和鍵，羥基可以在3位碳原子上，也可以在4位或其他碳原子上。按單體組成可將多聚羥基烷酸分為兩類。多聚羥基烷酸的分子量一般在50，000 Da～1，000，000Da之間。這類高分子聚合物的熱塑性質(zhì)與聚乙烯、聚丙烯非常相似。

2 生產(chǎn)工藝

2.1 操作過(guò)程

早在1925年，法國(guó)科學(xué)家已發(fā)現(xiàn)了這種微生物聚酯。1972年英國(guó)ICI公司在活性污泥中檢測(cè)出含有3－羥基戊酸后，經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的開發(fā)，發(fā)現(xiàn)一種能生產(chǎn)PHB（羥基丁酸）的細(xì)菌，學(xué)名為堿桿菌屬富細(xì)菌。經(jīng)發(fā)酵法合成3－羥基丁酸酯（3HB）和3－羥基戊酸酯（3HV）的無(wú)規(guī)共聚酯－聚羥基丁酸酯－戊酸酯（PHBV）。商品名Biopol。

用細(xì)菌為菌種，在各種碳源的存在下，合成聚酯。所用的碳源包括葡萄糖、乙酸、丙酸、丁酸、甲醇和乙二醇等，其中最重要的碳源是丙酸。

自從聚3－羥基丁酸酯，即P3HB或PHB被發(fā)現(xiàn)后，已有很多微生物可用于合成PHB，作為主要成分或其中一種成分的均聚或共聚天然脂肪族聚酯。

制取微生物聚酯的菌種有氫細(xì)菌、氮固定菌、光合成菌、活性污泥菌等。

利用一種真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌H 16，以丁酸作惟一碳源，在無(wú)氮合成培養(yǎng)基中發(fā)酵生產(chǎn)PHB，在30℃、pH值為8的條件下培養(yǎng)48 h，PHB累積量可達(dá)到干細(xì)胞的60%。

利用一種生絲微菌成都亞種8502－3菌株，于甲醇為主要碳源的培養(yǎng)基在35℃，pH值為7.2的條件下連續(xù)發(fā)酵獲得細(xì)胞生物量，PHB的最高產(chǎn)率為59.1%，按小時(shí)計(jì)為0.64 g／L。日本用芽孢桿菌和假單胞菌作生產(chǎn)菌，以質(zhì)量含量為1%的羥基乙酸作惟一碳源，在30℃下，先于醇酯培養(yǎng)液培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)入4%蔗糖培養(yǎng)液中培養(yǎng)4天（30℃），然后檢測(cè)PHB產(chǎn)量，前者的PHB質(zhì)量含量占干細(xì)胞的63%，后者為75%。

美國(guó)加州研究人員改變基因轉(zhuǎn)移方式，所用外源基因不是來(lái)自細(xì)菌，而是取自豌豆植物的DNA片段，用它導(dǎo)入擬南芥菜細(xì)胞，使其葉綠體能產(chǎn)生PHB顆粒。該植物源基因在宿主植物中表達(dá)PHB的產(chǎn)量提高了約3倍，其干重增加14%，并且對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)不良影響。這樣，為開發(fā)植物性PHB成為可能采用發(fā)酵工程技術(shù)，運(yùn)用華癸根瘤菌M02菌株進(jìn)行了分批發(fā)酵。

從土壤中篩選一株嗜甲基桿菌以甲醇為底物可大量累積PHB，并可連續(xù)進(jìn)行生產(chǎn)，質(zhì)量含量（下同）可達(dá)干細(xì)菌的55%，與以葡萄糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)PHB類似；也能用來(lái)生產(chǎn)PHB與PHV共聚物。甲醇質(zhì)量濃度控制在1.7 g／L，此共聚物產(chǎn)量平均占干細(xì)胞的25%～30%，以甲醇和戊酸混合物為原料可生產(chǎn)PHB與PHV共聚物，其中PHV為PHB的1／5。

由細(xì)菌發(fā)酵生成PHB，關(guān)鍵是選擇最適當(dāng)?shù)木N。在培養(yǎng)微生物菌種的過(guò)程中，必須選取最適當(dāng)?shù)沫h(huán)境使細(xì)菌繁殖，而且應(yīng)限制其他的營(yíng)養(yǎng)源如氮和磷等。

以碳源為底物發(fā)酵生產(chǎn)由3－羥基丁酸和3－羥基戊酸而成的共聚物，產(chǎn)品廢棄后可生物降解。從土壤中篩選一株嗜甲基桿菌以甲醇為底物可大量累積多聚羥基烷酸，并可連續(xù)進(jìn)行生產(chǎn)，質(zhì)量含量（下同）可達(dá)干細(xì)菌的55%，與以葡萄糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)多聚羥基烷酸類似，也能用來(lái)生產(chǎn)多聚羥基烷酸與PHV共聚物。甲醇質(zhì)量濃度控制在1.7g／L為最佳，此共聚物產(chǎn)量平均占干細(xì)胞的25%～30%，以甲醇和戊酸混合物為原料可生產(chǎn)多聚羥基烷酸與PHV共聚物，日本從美國(guó)引進(jìn)的真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌ATCEl7697，采用二步培養(yǎng)法，用氣態(tài)物質(zhì)為底物，先在有機(jī)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，達(dá)到對(duì)數(shù)增殖期后，再進(jìn)行自養(yǎng)培養(yǎng)，從而獲得高產(chǎn)率的PHB。在改進(jìn)Alcaligeuseutrophns的菌體中供給或酸發(fā)酵合成P（3HB－HV），其中3HV含量達(dá)到95%。在改進(jìn)的Alcaligeuseutrophns的菌體中供給4－羥基乳酸或r－丁內(nèi)酯，經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生P（3HB－HV）P，產(chǎn)率為60%。利用肥大產(chǎn)堿桿菌，在含蔗糖和r－丁內(nèi)酯的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，可生產(chǎn)3－羥基丁酸和4－羥基丁酸共聚物，其產(chǎn)率高達(dá)60%。

目前合成的Biopol是聚羥基丁酸酯－戊酸酯共聚物（PHBV），是以葡萄糖為基礎(chǔ)，加入丙酸調(diào)整HV的比例。當(dāng)前所用的細(xì)菌最具代表性的是Alcaligeneseutraphus，一般采用兩步制取。第一步是在34℃下使細(xì)菌繁殖，直至繁殖到最大量時(shí)，限制一些必須的營(yíng)養(yǎng)源如氮和磷等。第二步再提高培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度，這樣在細(xì)菌體內(nèi)開始蓄積PHB。同時(shí)加入丙酸后在34℃有氧的空氣中繼續(xù)發(fā)酵，使HB單元向無(wú)規(guī)地嵌入HV鏈段，在細(xì)菌內(nèi)合成聚酯。通過(guò)控制丙酸的加入量來(lái)控制HV的比率。發(fā)酵后的懸浮水溶液經(jīng)酶和洗滌劑洗滌、濃縮、離心、噴霧干燥并造粒。PHB的提取和純化技術(shù)是目前開發(fā)生產(chǎn)PHB的一個(gè)關(guān)鍵，提取方法的不同不僅能顯著改變最終產(chǎn)品的性能，而且是影響產(chǎn)品成本的重要因素之一?，F(xiàn)在人們從微生物細(xì)胞中分離提純PHB的主要方法有有機(jī)溶劑法、酶法和化學(xué)試劑法等。

在菌種培養(yǎng)中采用混合培養(yǎng)技術(shù)，在解決培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)物黏度過(guò)高、改進(jìn)培養(yǎng)液介質(zhì)、提高培養(yǎng)物密度等方面已取得了突破性進(jìn)展，尤其是在PHB的提取工藝中，可以采用低溫冷凍技術(shù)對(duì)菌體進(jìn)行預(yù)處理，該技術(shù)對(duì)提高產(chǎn)品質(zhì)量和降低生產(chǎn)成本效果顯著。

用十二烷基磺酸鈉從微生物細(xì)胞中提取PHB的方法。SDS分子不但可以結(jié)合細(xì)胞中的蛋白質(zhì)形成溶于水的復(fù)合物，而且能包被脂類分子形成溶于水的膠束，因此可作為一種有效的試劑應(yīng)用在PHB的分離上。乙二胺四乙酸也具有獨(dú)特的性質(zhì)。它是一種螯合劑，可以鏊合蛋白質(zhì)中的金屬離子使其具有水溶性，而且，脂多糖的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性在EDTA的存在下也能被破壞。

用SDS和EDTA從微生物細(xì)胞中提取PHB的方法。

與其他生物技術(shù)流程一樣，后處理非常關(guān)鍵。由于發(fā)酵法除產(chǎn)生聚酯外，還有脂質(zhì)和蛋白質(zhì)被膜，必須除掉各種雜質(zhì)。為此，采用酶可使脂質(zhì)和蛋白質(zhì)被膜分解為水溶性物質(zhì)，再用水洗法提純，可簡(jiǎn)化流程，降低成本。直接采用農(nóng)副產(chǎn)品為原料，將更具競(jìng)爭(zhēng)力。

改變基因轉(zhuǎn)移方式，所用外源基因不是來(lái)自細(xì)菌，而是取自豌豆植物的DNA片段，用它導(dǎo)入擬南芥菜細(xì)胞，使其葉綠體能產(chǎn)生多聚羥基烷酸顆粒。

生產(chǎn)多聚羥基烷酸主要方法是生化法或生物發(fā)酵法。多聚羥基烷酸是許多原核生物于非平衡生長(zhǎng)（如缺乏氮磷鎂氧等）條件下合成的細(xì)胞內(nèi)碳源和能源的儲(chǔ)藏性物質(zhì)。至今已發(fā)現(xiàn)60余種自養(yǎng)及異養(yǎng)菌能產(chǎn)生多聚羥基烷酸，例如堿桿菌屬，假單細(xì)胞菌屬，甲基營(yíng)養(yǎng)菌屬等。可從一種淡水氰基菌或海水氰基菌包括藍(lán)綠藻類基質(zhì)中分離提取多聚羥基烷酸。1976年，英國(guó)ICI公司使用Alealegenes Entropls菌，在普通發(fā)酵罐中合成了多聚羥基烷酸。目前對(duì)生化法的改進(jìn)包括利用價(jià)格低來(lái)源廣的農(nóng)副產(chǎn)品或廢棄物作為糖質(zhì)原料生產(chǎn)多聚羥基烷酸，并利用重組DNA技術(shù)，以提高產(chǎn)量。

此方法合成的生物降解高分子比較純凈，無(wú)需引入添加劑，由微生物合成的聚酯，可以通過(guò)變換組成合成各具不同結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的共聚體，可以制成C12－C17的各種無(wú)規(guī)共聚物，如多聚羥基丁酸、羥基丁酸和羥基戊酸共聚體［P（HB－COHV）］基丁酸和羥基己酸共聚體LP（HB－COHH）］、羥基丁酸和羥基辛酸共聚體LP（HB－CO－HO）?等。碳鏈之間可以是飽和鍵或不飽和鍵，按單體組成可將多聚羥基烷酸分為兩類：為短側(cè)鏈多聚羥基烷酸與聚羥基烷酸。

有很多微生物可用來(lái)合成多聚羥基烷酸作為主要成分，或其中一種成分的均聚或共聚天然脂肪族聚酯。這些物質(zhì)作為能源儲(chǔ)藏物質(zhì)，在微生物體內(nèi)以顆粒狀的微粒形式存儲(chǔ)。

在培養(yǎng)微生物菌種的過(guò)程中，必須選取最適當(dāng)?shù)沫h(huán)境使細(xì)菌繁殖，而且應(yīng)限制其它的營(yíng)養(yǎng)源如氮和磷等。

日本曾對(duì)真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌、嗜酸假單胞菌在含4－羥基丁酸、丁內(nèi)酯或1，4－丁二醇的無(wú)氮培養(yǎng)基中生產(chǎn)3－羥基丁酸和4－羥基丁酸的共聚物進(jìn)行了開發(fā)。從美國(guó)引進(jìn)了真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌ATCCl7697，采用二步培養(yǎng)法，用CO2、H2O2等氣態(tài)物質(zhì)為底物，先在有機(jī)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，達(dá)到對(duì)數(shù)增殖期后，再進(jìn)行自養(yǎng)培養(yǎng)，從而獲得高產(chǎn)率的產(chǎn)品。

在改進(jìn)Alcaligeuseutrophns的菌體中供給或酸發(fā)酵合成P（3HB－CO－3HV），3HV含量達(dá)95%。在改進(jìn)的Alcaligeuseutrophns的菌體中供給4－羥基乳酸或丁內(nèi)酯，經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生P（3HB－CO－4HB），產(chǎn)率為60%。這是一種既有塑料的結(jié)晶性又有橡膠彈性的一種高分子材料，在共聚體中，隨著4－羥基丁酸含量的增加，斷裂伸長(zhǎng)率增大，當(dāng)含量＞40%的共聚體時(shí)具有橡膠彈性。4－羥基丁酸比例增加的結(jié)果，可使結(jié)晶率降至零。

英國(guó)帝國(guó)化學(xué)公司選用一種假單胞菌為生產(chǎn)菌，木糖為惟一碳源，培養(yǎng)出多聚羥基烷酸，占干細(xì)胞生物量的60%。日本一家公司用芽孢桿菌和假單胞菌作生產(chǎn)菌，1%的羥基乙酸為惟一碳源，在30℃經(jīng)醇酯培養(yǎng)液培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)入4%蔗糖培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)4天，隨后檢測(cè)多聚羥基烷酸產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)用假單胞菌生產(chǎn)的多聚羥基烷酸質(zhì)量含量占干細(xì)胞的75%。

與傳統(tǒng)的化學(xué)合成高分子相比，微生物合成高分子具有如下特點(diǎn)：微生物酶體系的高度選擇性和?！?；組裝過(guò)程對(duì)培養(yǎng)條件具有響應(yīng)性；反應(yīng)條件溫和，生產(chǎn)過(guò)程和產(chǎn)品對(duì)環(huán)境友好。PHA是某些微生物處于非平衡生長(zhǎng)狀態(tài)下（如缺乏氮、磷、鎂等）細(xì)胞內(nèi)合成的一種儲(chǔ)藏性聚酯，在細(xì)菌中的功能類似植物中的淀粉和動(dòng)物中的脂肪。

通過(guò)改變菌株的遺傳結(jié)構(gòu)，如將合成關(guān)鍵酶基因轉(zhuǎn)入能利用廉價(jià)底物的菌株如大腸桿菌中，或把能利用廉價(jià)底物的基因?qū)氲缴a(chǎn)菌株中以提高產(chǎn)量、降低成本，以及尋找具有新的物理機(jī)械特性或者特殊用途的PHA等措施，來(lái)增強(qiáng)細(xì)菌發(fā)酵法生產(chǎn)的生物可降解塑料的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，多聚羥基烷酸有著與石化塑料相似的理化性質(zhì)，又能在一定條件下被微生物迅速而徹底地降解，因此多聚羥基烷酸是一種理想的傳統(tǒng)石化塑料替代品。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的革蘭氏陰性、氧化性、能運(yùn)動(dòng)的短桿菌，經(jīng)鑒定為肥大產(chǎn)堿菌。該菌株具有優(yōu)良的產(chǎn)聚羥基丁酸（多聚羥基烷酸）能力，能利用常見的碳源，生長(zhǎng)要求較簡(jiǎn)單，經(jīng)提取后的多聚羥基烷酸純度與Sigma產(chǎn)品相一致。能得到為細(xì)胞干重23.9%的多聚羥基烷酸。該菌株有工業(yè)應(yīng)用前景。

很多野生菌在被發(fā)現(xiàn)能夠合成PHA，即被用來(lái)進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。許多優(yōu)良的PHA生產(chǎn)菌應(yīng)該具備可以利用便宜的碳源、生長(zhǎng)迅速及易于操作提取PHA等特點(diǎn)。為了達(dá)到商業(yè)化的目標(biāo)，人們利用改良菌種、優(yōu)化發(fā)酵和提取工藝等一系列手段來(lái)降低PHA的生產(chǎn)成本。

從簡(jiǎn)單而便宜的碳源中生產(chǎn)出具有更多不同單體組成的PHA，對(duì)PHA的廣泛應(yīng)用非常重要，從這種意義上講，CO2是最理想的碳源。有的研究把酵母、藍(lán)藻、植物和昆蟲細(xì)胞作為PItA潛在的生產(chǎn)者獲得了成功。出于經(jīng)濟(jì)考慮，植物和藍(lán)藻是最有可能的候選者。在不久的將來(lái)，PHA就可能不是被生產(chǎn)出來(lái)，而是從轉(zhuǎn)基因植物中獲取了。

目前正在研究培育能生產(chǎn)含大量所需聚羥基丁酸酯物質(zhì)的菜籽油的油菜。為此，研究人員正在將真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌的基因轉(zhuǎn)移入油菜的遺傳物質(zhì)。這項(xiàng)研究獲得成功，則可望大大降低聚合物的生產(chǎn)成本，從而增加其供應(yīng)量，產(chǎn)生更大的環(huán)境效益。

例1將豆芽汁100g，葡萄糖5g，（NH4）2SO44g，MgSO40.6 g，KH2PO40.61 g，K2HPO40.39g，CaCl20.1 g，NaCl0.1 g，微量元素液4 mL，pH值為7.0，加水定容至l，000mL。

發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖30g，其他成分與種子培養(yǎng)基相同。發(fā)酵罐裝料容積5L，兩層六平直葉攪拌器，四擋板，起始培養(yǎng)體積4 L，接種量5%，培養(yǎng)溫度29℃，通氣量1∶l，攪拌轉(zhuǎn)速200～800 r／min，溶氧控制大于10%，以6 mol／L NaOH和6 mol／L HCl調(diào)節(jié)pH值恒定在7.0。

分批發(fā)酵起始發(fā)酵罐裝料容積3 L，接種量10%，發(fā)酵條件控制同分批發(fā)酵，控制溶氧大于10%，必要時(shí)補(bǔ)純氧。通過(guò)發(fā)酵條件的調(diào)節(jié)盡量延長(zhǎng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間，從而得到較高的細(xì)胞量和產(chǎn)物量。用發(fā)酵罐的補(bǔ)料泵分次補(bǔ)入50%葡萄糖和20%（NH4）2SO4，使糖和銨離子的濃度分別保持在10 g／L～30g／L和1 g／L～4 g／L。培養(yǎng)基其它成分，按照分批發(fā)酵的數(shù)據(jù)和菌體生長(zhǎng)情況隨時(shí)加入，保證營(yíng)養(yǎng)充足。

例2 LB培養(yǎng)基，將M9培養(yǎng)基中除碳源外的所有組分的濃度分別提高2倍和4倍，配制成2× M9和4×M9培養(yǎng)基。

培養(yǎng)方法：

培養(yǎng)溫度均為37℃，接種量均為10%。搖床培養(yǎng)時(shí)，300mL三角瓶中裝50mL培養(yǎng)基，搖床轉(zhuǎn)速為280 r／min，培養(yǎng)48h。發(fā)酵罐培養(yǎng)，采用27L攪拌式不銹鋼發(fā)酵罐。

向罐中投入15L的M9培養(yǎng)基，葡萄糖與4HB濃度分別為1%與0.4%，補(bǔ)料液為60%的葡萄糖、2%的硫酸鎂與4%的酵母提取液，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖的濃度低于0.5%時(shí)，補(bǔ)加1%的葡萄糖。當(dāng)培養(yǎng)基中4HB的濃度低于0.05%時(shí)，用26%的4HB儲(chǔ)液向培養(yǎng)基中補(bǔ)加0.4%的4HB。攪拌速度為600～1，000r／min，以控制溶氧濃度在20%以上。酸堿雙向調(diào)控維持pH7.0。

例3所用菌種為圓褐固氮菌G－3。

培養(yǎng)基：

蔗糖20g／L，K2HPO40.8 g／L，KH2PO40.2g／L，MgSO4·2H2O 0.2 g／L，CaCO32 g／L，F(xiàn)eCl3.6H2O 0.125 g／L，Na2MoO4·2H2O 0.25g／L，蛋白胨1 g／L，pH 7.2。培養(yǎng)方法采用圓褐固氮菌G－3菌株進(jìn)行培養(yǎng)，控制溫度30℃，pH7.2酸堿雙向調(diào)控，初始裝量l.2L，接種量l0%。

（未完待續(xù)：見本刊2016年第2期）

Biopol of biodegradable plastics Development and app lication

WANG DUO REN
（Petrochina Jilin petrochemical Corpant）

Advances in and prospect of Biopol of biodegradable plasticsmanufacturing technology The advances in Glyoxalmanuf acturing technologywere reviewed 1n the paper.The features the tcchnologies for industrial production of Biopol of biodegradable plasticswere discussed and reviewed.processes of Biopol of biodegradable plastics producing and optimum con—ditions and new development ofmagnesium borate whisker and their ststus quo and devepmant trends of sends athome and abroad have been presented in the article for future developmentof application are evaluated and marked demand

Biopol of biodegradable plastics develpment Application