李東輝

TSG-6對(duì)腦出血大鼠血腦屏障的保護(hù)作用

李東輝

目的：探討腫瘤壞死因子α刺激基因6因子（TSG-6）對(duì)腦出血大鼠血腦屏障的保護(hù)作用及對(duì)Claudin-5和ZO-1表達(dá)的影響。方法：大鼠108只，隨機(jī)分為對(duì)照組12只、模型組48只和TSG-6組48只。大鼠自體動(dòng)脈血注射制備腦出血模型，分光光度法檢測(cè)各組出血側(cè)和未出血側(cè)大腦皮質(zhì)及海馬組織中伊文思藍(lán)（EB）濃度，Western Blotting檢測(cè)出血側(cè)和未出血側(cè)大腦皮質(zhì)及海馬組織中Claudin-5和ZO-1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：干預(yù)后4 h、1 d、3 d和7 d，模型組和TSG-6組出血側(cè)大腦皮質(zhì)和海馬組織中EB濃度高于對(duì)照組（P<0.05）；模型組和TSG-6組出血側(cè)大腦皮質(zhì)和海馬組織中Claudin-5和ZO-1蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組（P<0.05）；TSG-6組出血側(cè)大腦皮質(zhì)和海馬組織中EB濃度低于模型組（P<0.05）；TSG-6組出血側(cè)大腦皮質(zhì)和海馬組織中Claudin-5和ZO-1蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組（P<0.05）；TSG-6組和模型組未出血側(cè)大腦皮質(zhì)和海馬組織中的EB濃度、Claudin-5和ZO-1蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異（P>0.05）。結(jié)論：TSG-6對(duì)腦出血大鼠的血腦屏障有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與升高血腦屏障中的緊密連接蛋白Claudin-5和ZO-1的表達(dá)水平有關(guān)。

腫瘤壞死因子α刺激基因6因子；腦出血；Claudin-5；ZO-1

血腦屏障損傷后，血腦屏障的通透性顯著增加，導(dǎo)致外周血液中的各種炎性因子和炎性細(xì)胞進(jìn)入大腦，從而嚴(yán)重?fù)p傷大腦[1-3]。腫瘤壞死因子α刺激基因6因子（tumornecrosis factor alpha-stimulated gene-6，TSG-6）是近些年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種抗炎活性細(xì)胞因子，可抑制炎性因子的合成分泌以及抑制炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)[4]。另有研究表明血腦屏障通透性的異常增加與血腦屏障中的緊密連接復(fù)合體的異常變化有關(guān)，Clandin-5和ZO-1是緊密連接復(fù)合體重要的組成部分[5,6]。本文觀察外源性TSG-6對(duì)腦出血大鼠血腦屏障的保護(hù)作用及對(duì)緊密連接蛋白Claudin-5和ZO-1的影響，為治療腦出血提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性SD大鼠108只，體質(zhì)量220～260 g，購(gòu)自安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證編號(hào)為SCXK（皖）2015-004。將108只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組12只、模型組48只和TSG-6組48只。

1.1.2 主要試劑及儀器TSG-6（購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)公司）、伊文思藍(lán)（Evans Blue，EB，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司）、Claudin-5和ZO-1兔抗鼠多克隆抗體（購(gòu)于美國(guó)Bioworlde公司），紫外分光光度儀（購(gòu)于美國(guó)Beckman公司）、低溫離心機(jī)（購(gòu)于日本日立公司）、低溫冰箱（購(gòu)于中國(guó)海爾公司）、電泳儀（購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腦出血模型制備及各組處理 使用自體血注入法復(fù)制大鼠腦出血模型。將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉后置于立體定位儀，頭皮正中切口，右側(cè)顱骨鉆孔（中線旁開(kāi)3 mm，前囟前0.2 mm）。剪斷大鼠尾巴2～3 cm，用試管采血，壓迫斷端并包扎，微量注射器抽取50 μL未凝血，將微量注射器插入腦組織，深度為6.0 mm，向右側(cè)尾狀核緩慢注入自體血，盡量減少反流。然后緩慢移出，骨蠟封閉顱骨鉆孔，縫合頭皮并消毒[7]。對(duì)照組大鼠不做任何處理。對(duì)造模完成的大鼠腹腔注射頭孢菌素，在籠中進(jìn)行飼養(yǎng)。造模后，TSG-6組立即從尾靜脈注射含TSG-6的PBS溶液（100 μg/100 g）；模型組和對(duì)照組從尾靜脈注射PBS溶液，劑量為100 μL/100 g。模型組和TSG-6組分別在干預(yù)4 h、1 d、3 d和7 d后各處死12只，對(duì)照組在造模后第7天后處死。

1.2.2 血腦屏障通透性評(píng)估 每組各6只大鼠，在處死前1 h通過(guò)尾靜脈注入2%的EB（0.3 mL/100 g），處死大鼠，將生理鹽水從左心室灌注，直至右耳有清亮液體流出。分別取出血側(cè)和健側(cè)大腦的皮質(zhì)及海馬組織，用分析天平進(jìn)行精密稱重，將稱重后的皮質(zhì)和海馬組織放在容量為5 mL的二甲基甲酰胺溶液試管中，37℃水浴48 h，將水浴后的皮質(zhì)和海馬組織在離心機(jī)中進(jìn)行離心并收集上清液，3 000 rpm、離心15 min，采用分光光度法檢測(cè)上清液中EB在632 nm波長(zhǎng)處的最大吸光度，然后在根據(jù)EB的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出不同大腦皮質(zhì)和海馬組織中的EB含量。

1.2.3 大鼠腦組織中Clandin-5和ZO-1的檢測(cè) 每組各6只大鼠，分別取出血側(cè)和健側(cè)大腦的皮質(zhì)和海馬組織，加入適量裂解液，在低溫的條件性使用玻璃勻漿器對(duì)皮質(zhì)和海馬組織進(jìn)行勻漿，4℃、12 000 rpm，離心5 min，吸取上清液，加入適量的上樣緩沖液水煮后用凝膠電泳儀對(duì)總蛋白進(jìn)行分離，將目的蛋白轉(zhuǎn)膜至NC醋酸纖維素膜上，在5%脫脂奶粉溶液中封閉1 h，3次洗膜，加入Claudin-5和ZO-1兔抗鼠多克隆抗體4℃孵育過(guò)夜，3次漂洗，在辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗中常溫下孵育2 h，3次洗膜，涂抹ECL發(fā)光試劑，暗室內(nèi)曝光，拍照，分析目的蛋白和內(nèi)參蛋白的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（χ±s）表示，重復(fù)測(cè)量和多變量方差分析、單因素方差分析、LSD檢驗(yàn)法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血腦屏障通透性變化比較

干預(yù)后4 h、1 d、3 d和7 d，模型組和TSG-6組的腦組織中的EB濃度較對(duì)照組增加，有顯著性差異（P< 0.01）；TSG-6組的腦組織中的EB濃度低于模型組，有顯著性差異（P<0.01）；健側(cè)的大腦皮質(zhì)和海馬組織中的EB濃度和對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1-4。

2.2 各組大鼠腦組織中Claudin-5表達(dá)水平比較

干預(yù)后4 h、1 d、3 d和7 d，模型組和TSG-6組的Claudin-5表達(dá)水平較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；TSG-6組的Claudin-5表達(dá)水平高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；健側(cè)的大腦皮質(zhì)和海馬組織中的Claudin-5表達(dá)水平和對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖1。

2.3 各組大鼠腦組織中緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)水平比較

第4小時(shí)、第1天、第3天和第7天中模型組和TSG-6組的ZO-1表達(dá)水平較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；TSG-6組在第4小時(shí)、第1、3和7天的ZO-1表達(dá)水平均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）；TSG-6組的健側(cè)的大腦皮質(zhì)和海馬組織中的ZO-1表達(dá)水平和對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），見(jiàn)圖2。

表1 各組大鼠出血側(cè)大腦皮質(zhì)中EB濃度比較（μg/g，χ±s）

表2 各組大鼠出血側(cè)大腦海馬組織中EB濃度比較（μg/g，χ±s）

表3 各組大鼠健側(cè)大腦皮質(zhì)中EB濃度比較（μg/g，χ±s）

表4 各組大鼠健側(cè)大腦海馬組織中EB濃度比較（μg/g，χ±s）

3 討論

TSG-6是最新研究發(fā)現(xiàn)的一種具有抗炎作用的活性細(xì)胞因子，研究發(fā)現(xiàn)TSG-6在多種炎性病理變化中具有抗炎和細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)的作用。郭艷等[8]研究表明，給予腦梗死大鼠外源性TSG-6，可顯著減緩腦梗死所導(dǎo)致的血腦屏障通透性增加、縮小腦梗死面積、改善神經(jīng)功能損傷。Watanabe等[9]研究發(fā)現(xiàn)，TSG-6減輕腦梗死大鼠血腦屏障通透性的作用機(jī)制可能是因?yàn)橐种苹|(zhì)金屬蛋白9表達(dá)，并減輕中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)程度。本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)腦出血大鼠給予外源性TSG-6可顯著降低出血側(cè)大腦皮質(zhì)和海馬組織血腦屏障的通透性，同時(shí)對(duì)未出血側(cè)大腦皮質(zhì)和海馬組織的血腦屏障的通透性沒(méi)有影響，這說(shuō)明TSG-6對(duì)腦出血大鼠的血腦屏障有顯著的保護(hù)作用。

血腦屏障中的第一道屏障由毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和毛細(xì)血管之間的緊密連接復(fù)合體組成，研究認(rèn)為血腦屏障通透性調(diào)控的關(guān)鍵點(diǎn)是緊密連接復(fù)合體的活性變化[10,11]?？缒さ鞍资蔷o密連接復(fù)合體重要的組成部分之一，跨膜蛋白的外部和鄰近的跨膜蛋白相互連接，內(nèi)部和細(xì)胞質(zhì)附著蛋白相互連接。Claudin-5和ZO-1是血腦屏障中重要的緊密連接蛋白。其中ZO-1在黏附連接和緊密連接上都有表達(dá)，在組成細(xì)胞緊密連接中起重要作用，ZO-1表達(dá)水平的變化和血腦屏障通透性的變化聯(lián)系緊密[12]。陳鐸等[13]研究認(rèn)為，Claudin-5是調(diào)控血腦屏障通透性非常重要的活性蛋白，腦梗死大鼠血腦屏障的通透性顯著增加，并且可能與Claudin-5和ZO-1表達(dá)水平顯著性下降有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，TSG-6組和模型組損傷側(cè)的大腦皮質(zhì)和海馬組織中的Claudin-5和ZO-1表達(dá)量顯著高于對(duì)照組損傷側(cè)的Claudin-5和ZO-1表達(dá)量；TSG-6組損傷側(cè)的大腦皮質(zhì)和海馬組織中的Claudin-5和ZO-1表達(dá)較對(duì)照組高且較模型組低，表明TSG-6對(duì)出血大鼠的血腦屏障有一定的保護(hù)作用，但不能完全恢復(fù)造模對(duì)血腦屏障所造成的損傷。腦出血大鼠損傷側(cè)的大腦皮質(zhì)和海馬組織中的Claudin-5和ZO-1蛋白表達(dá)水平均顯著下降，出血側(cè)大腦皮質(zhì)和海馬組織中的Claudin-5和ZO-1蛋白表達(dá)水平?jīng)]有下降，外源性給予大鼠TSG-6后出血側(cè)大腦皮質(zhì)和海馬組織中的Claudin-5和ZO-1蛋白表達(dá)下降的程度會(huì)顯著降低。這說(shuō)明TSG-6對(duì)腦出血大鼠血腦屏障保護(hù)作用的作用機(jī)制可能與升高血腦屏障中緊

圖1 各組大鼠腦組織中Claudin-5表達(dá)水平比較（n=6）

圖2 各組大鼠腦組織中ZO-1表達(dá)水平比較（n=6）

密連接蛋白Claudin-5和ZO-1表達(dá)水平有關(guān)。

綜上所述，TSG-6對(duì)腦出血大鼠的血腦屏障有保護(hù)作用，可以降低血腦屏障通透性，其保護(hù)作用機(jī)制可能與升高血腦屏障中的緊密連接蛋白Claudin-5和ZO-1的表達(dá)水平有關(guān)。

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（本文編輯：王晶）

Effect of TSG-6 on Blood-brain Barrier Permeability in Cerebral Hemorrhage RatsLI

Dong-hui.Department ofPediatrics,HezePeonyPeople'sHospital,Shandong274000,China

Objective:To explore the effect of TSG-6 on blood-brain barrier permeability and expression of Claudin-5 and ZO-1 in cerebral hemorrhage rats.Methods:Total 108 rats were divided into groups control(n= 12),model(n=48)and TSG-6(n=48).Brain trauma model was induced by hydraulic shock method.Evans blue (EB)tissue concentration in cerebral cortex and hippocampus of bleeding side and not bleeding side were detected by Spectrophotometry.Claudin-5 and ZO-1 protein levels in cerebral cortex and hippocampus of bleeding side and not bleeding side were detected by Western Blotting.Results:After 4 h,1 d,3 d,7 d,EB concentration in cerebral cortex and hippocampus of bleeding side of Model group and TSG-6 group were significantly higher than the control group(P<0.05).Claudin-5 and ZO-1 protein levels in cerebral cortex and hippocampus of bleeding side of Model group and TSG-6 group were significantly lower than the control group(P<0.05).EB concentration in cerebral cortex and hippocampus of bleeding side of TSG-6 group was significantly lower than the Model group(P<0.05).Claudin-5 and ZO-1 protein levels in cerebral cortex and hippocampus of bleeding side of TSG-6 group were significantly lower than the Model group(P<0.05).The EB concentration,Claudin-5 and ZO-1 protein levels in not bleeding side of Model group and TSG-6 group were noe significantly different from the control group(P>0.05).Conclusion:The BBB on traumatic brain injury in rats is protected by TSG-6.The mechanism may be elevated in the blood-brain barrier tight junction protein Claudin-5 and ZO-1.

TSG-6;cerebral hemorrhage;Claudin-5;ZO-1

R741;R741.02

A DOI 10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.06.003

菏澤市牡丹人民醫(yī)院兒科山東 菏澤274000

2015-10-29

李東輝291280451@qq. com