陳雨 臧悅含

（中國(guó)刑警學(xué)院 遼寧沈陽 110035）

接觸DNA常規(guī)提取純化方法的比較探討

陳雨 臧悅含

（中國(guó)刑警學(xué)院 遼寧沈陽 110035）

接觸DNA的提取純化是法醫(yī)物證工作的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一。接觸性檢材上的脫落細(xì)胞本就量小體微，所以運(yùn)用有效的方法對(duì)這些潛在的微量脫落細(xì)胞中的DNA進(jìn)行提取純化就顯得十分重要。文章擬對(duì)接觸DNA的常規(guī)提取純化方法及影響因素進(jìn)行簡(jiǎn)要闡述，并對(duì)其進(jìn)行橫向的比較探討，以期得出最有效的接觸DNA提取純化方法。

接觸DNA 提取純化 影響因素 比較探討

接觸DNA是指通過皮膚與檢材接觸而在檢材表面留下皮膚脫落上皮細(xì)胞的DNA，脫落細(xì)胞多數(shù)為角化的上皮細(xì)胞，肉眼無法觀察到，具有易污染、易降解、載體大、DNA量少等特點(diǎn)。目前常用的接觸DNA提取純化方法主要有Chelex-100法、磁珠法、硅珠法、有機(jī)溶劑法、過柱法、直擴(kuò)法等。針對(duì)不同類型的接觸性檢材應(yīng)采取不同提取純化方法。

1　常規(guī)提取純化方法

1.1Chelex-100法

Chelex-100是一種螯合樹脂，是以亞氨基二乙酸為吸附因子的苯乙烯與二乙基苯的共聚體，其中亞氨基二乙酸側(cè)鏈起到螯合金屬離子的作用。在低離子強(qiáng)度、低堿性、100℃條件下細(xì)胞膜破裂，蛋白質(zhì)變性，使DNA游離出來。Chelex-100通過螯合金屬離子，抑制核酸酶對(duì)DNA的酶解作用。離心后，使Chelex-100顆粒及變性蛋白質(zhì)沉淀，DNA留在上清液中，可用于PCR擴(kuò)增的模板使用。

采用 Chelex-100法時(shí)需要注意：Chelex-100放置后會(huì)有沉淀現(xiàn)象，使用之前需要搖勻。

Chelex-10置于空氣中一段時(shí)間后PH值會(huì)下降，故使用前需要用純水清洗。若檢材陳舊或有雜質(zhì)可事先清洗或延長(zhǎng)浸泡時(shí)間。

1.2磁珠法

磁珠法提純接觸DNA的原理是利用細(xì)胞裂解液使細(xì)胞裂解進(jìn)而使DNA分子游離出來，DNA分子帶負(fù)電可以被吸附到磁珠表面。然后在磁場(chǎng)的作用下使磁珠與液體分開，回收磁珠顆粒，洗滌后，再用純水或TE洗脫磁珠吸附的DNA。采用不同的試劑盒提取過程會(huì)略有差別。

1.3硅珠法

硫氰酸胍是一種強(qiáng)蛋白質(zhì)變形劑。高速離心后可以使變性蛋白質(zhì)與DNA分離開，并去除其他不溶性雜質(zhì)。溶液中加入二氧化硅微粒，DNA能夠被二氧化硅特異性吸附。被吸附的DNA在沒有硫氰酸胍存在的條件下又可以從二氧化硅上解離。再經(jīng)過漂洗可將溶液中的PCR抑制物去除，最后得到純凈的DNA溶液。

采用硅珠法時(shí)要注意：1、裂解液的量一定要完全浸沒檢材；2、吸附過程中加硅珠之前要先離心一次，保證硅珠的吸附性；3、洗脫液不要太多，必要時(shí)可以結(jié)合其他方法進(jìn)行純化。

1.4直擴(kuò)法

直擴(kuò)法是一種免提取擴(kuò)增方法，即不需要DNA的提取步驟而是直接將適量檢材直接用于PCR擴(kuò)增快速得到STR分型。目前已經(jīng)研制出多種用于直接擴(kuò)增的試劑盒，其中接觸D N A提純多采用Identifiler Direct PCR直擴(kuò)試劑盒。

具體操作：擴(kuò)增的體系因檢材的不同會(huì)有所區(qū)別，這里以煙蒂為例做簡(jiǎn)要介紹，首先取適量引物Primer、Master mix混勻后置于擴(kuò)增管中；然后剪取煙蒂唾液斑處適量，將檢材置于擴(kuò)增液中以完全浸沒為準(zhǔn)，擴(kuò)增參數(shù)可以選擇95℃11min變性、72℃1min延伸、59℃2min復(fù)性為一個(gè)循環(huán)體系，循環(huán)30次。

直擴(kuò)法在操作過程中要注意判別脫落細(xì)胞的位置，轉(zhuǎn)移的檢材大小要適中，過大會(huì)產(chǎn)生PCR抑制或混合污染現(xiàn)象，過小有可能會(huì)檢不出接觸DNA，因此要結(jié)合生活工作經(jīng)驗(yàn)提取。

2　比較討論

采用Chelex-100法提取的檢材，優(yōu)點(diǎn)是適用范圍廣、操作簡(jiǎn)便成本低，整個(gè)過程只在一個(gè)EP管中進(jìn)行，損耗和污染少提取DNA的量較多。缺點(diǎn)是對(duì)于提取液中的雜質(zhì)、小片段DNA、蛋白質(zhì)、PCR抑制物等無法去除。此方法適用于脫落細(xì)胞較多、雜質(zhì)少、DNA提取條件較好的檢材。

磁珠法提取接觸DNA靈敏度較高，整個(gè)過程中不需要離心，操作簡(jiǎn)便，不含有色素、蛋白質(zhì)以及PCR抑制物，或者含量極少不影響分型，純度較高。整個(gè)自動(dòng)化提取DNA的過程在同一反應(yīng)管中進(jìn)行，樣品損失較少，提取的DNA純度較高，只要模板量超過2ng就可以進(jìn)行性別分型及10個(gè)基因座以上的STR分型。利用磁珠法可以去除100bp以下的小片段DNA，減少STR擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)的小片段優(yōu)勢(shì)現(xiàn)象，產(chǎn)物峰也比較均衡。因此磁珠法更適用于陳舊性、接觸性等疑難微量檢材。

硅珠法提取接觸DNA的靈敏度較高，提取時(shí)間短，純度高。改良硅珠法優(yōu)勢(shì)主要在于：1、應(yīng)用離心套管無需移管；2、吸附液量增大，充分吸附；3、漂洗次數(shù)減少；4、洗脫體系減小等。改良硅珠法提純的接觸DNA質(zhì)量更高，STR分型成功率更大。適用于犯罪現(xiàn)場(chǎng)的多數(shù)檢材，一般不受檢材的限制。

直擴(kuò)法的優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)便、節(jié)省時(shí)間、所需檢材量小、檢出率高等，操作步驟較少，DNA丟失現(xiàn)象少使得檢出率大大提高。但直擴(kuò)法適用范圍較小，僅適用于干凈、保存條件好的檢材，對(duì)于污染嚴(yán)重、腐敗陳舊等PCR擴(kuò)增抑制物較多的檢材則需要慎重考慮。

當(dāng)檢材脫落細(xì)胞較多、雜質(zhì)少、提取條件好時(shí)可采用Chelex-100 法提取接觸DNA；當(dāng)檢材上脫落細(xì)胞較少、檢材陳舊腐敗、雜質(zhì)較多時(shí)可以采用Chelex-100聯(lián)合磁珠法或者Chelex-100法聯(lián)合硅珠法進(jìn)行提取純化；當(dāng)需要檢驗(yàn)的檢材數(shù)量較多，且檢材保存條件比較好，例如DNA數(shù)據(jù)庫(kù)的建設(shè)時(shí)可以選用直擴(kuò)法直接擴(kuò)增分型。

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［R89］

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1674-2060（2016）05-0154-01