陳偉劉日淵張亮冀飛郭維維任麗麗李佳楠袁碩龍張悅陳磊楊仕明*中國人民解放軍總醫(yī)院，耳鼻咽喉頭頸外科（北京0085）2中國人民解放軍空軍總醫(yī)院，耳鼻咽喉頭頸外科（北京0006）重慶市畜牧科學(xué)院（重慶402460）

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榮昌豬電子耳蝸植入方法建立及聽功能初步觀察

陳偉1，2劉日淵1張亮3冀飛1郭維維1任麗麗1李佳楠1袁碩龍1張悅1陳磊3楊仕明*1
1中國人民解放軍總醫(yī)院，耳鼻咽喉頭頸外科（北京100853）
2中國人民解放軍空軍總醫(yī)院，耳鼻咽喉頭頸外科（北京100036）
3重慶市畜牧科學(xué)院（重慶402460）

【摘要】目的建立在大型哺乳動物-豬體內(nèi)植入電子耳蝸的方法，觀察電子耳蝸植入前后聽功能變化。方法榮昌豬6只，雌雄不限，40-45日齡，體重8～12Kg，均選自重慶畜牧科學(xué)院養(yǎng)豬研究所。分為聽力正常組（Mitf+/+），與突變耳聾組（Mitf -/-）,每組3只。在全麻下進(jìn)行電子耳蝸植入術(shù)。于手術(shù)前，手術(shù)后即刻以及手術(shù)后1周記錄聽性腦干反應(yīng)（Auditory Brainstem Response，ABR），和電刺激腦干誘發(fā)電位（Electrical Auditory Brainstem Response，EABR）；頭顱X片觀察電極植入位置。結(jié)果6只動物電子耳蝸植入手術(shù)成功，耳蝸電極位置正確，在耳蝸內(nèi)盤繞1.5～1.75圈。電子耳蝸植入即刻，手術(shù)側(cè)（右耳）各頻率ABR閾值在120 dB SPL無法引出；手術(shù)后7天，手術(shù)側(cè)（右耳），低頻ABR閾值在100dB SPL左右，高頻在120 dB SPL仍無法引出。聽力正常榮昌豬組（Mitf+/+），電子耳蝸植入手術(shù)即刻及一周后EABR閾值在90 CL左右，明顯低于突變耳聾榮昌豬組（Mitf -/-）的190 CL。結(jié)論本研究建立的榮昌豬電子耳蝸植入方法確實可行，通過植入電極進(jìn)行EABR測試方法設(shè)計合理。為更加直接地研究電子耳蝸植入設(shè)備在體內(nèi)的工作狀態(tài)和各項數(shù)據(jù)，研究電極植入后耳蝸的生理病理改變創(chuàng)造了條件。

【關(guān)鍵詞】耳蝸植入；榮昌豬；ABR；EABR

Financial funds：This work was supported by grants from the National Basic Research Program of China (973 Program) (# 2012CB967900；2011CBA01000)，the National Natural Science Foundation of China (NSFC #81271082).Special Cultivating and Developing Program of Beijing Science and Technology Innovation Base.Competing Interests:The authors have declared that no competing interests exist.

據(jù)國內(nèi)相關(guān)統(tǒng)計，目前我國聽力言語殘疾者達(dá)2800萬之多，并仍以每年3萬聾兒的速度在增長。其中，感音神經(jīng)性耳聾占絕大多數(shù)，目前最佳的治療手段為電子耳蝸植入。自1984年美國FDA正式批準(zhǔn)多導(dǎo)電子耳蝸在成人應(yīng)用至今，全世界已有30萬聾人通過植入電子耳蝸而重新獲得聽力。這其中包括10萬先天性耳聾的兒童，他們得益于此技術(shù)而回到有聲世界，并開啟了與正常兒童同樣精彩的人生。但是，電子耳蝸并不能解決所有耳聾患者的苦惱，如感染造成的雙側(cè)耳聾，常因耳蝸骨化、纖維化造成電極插入困難；聽神經(jīng)病患者，其電子耳蝸植入后的效果難以預(yù)料。與此同時，植入電子耳蝸的耳聾患者，也還有眾多疑問不能解答。如植入電極位置與殘余聽力保存間的關(guān)系；言語識別能力與植入電極的位置、長度、通道數(shù)量的關(guān)系仍不清楚。這都需要大量的實驗研究，來獲得寶貴的數(shù)據(jù)，不斷改進(jìn)和更新電子耳蝸的植入電極及相應(yīng)裝置；也需要將新設(shè)計的電子耳蝸電極、植入體等，在動物模型上進(jìn)行有效性、安全性的評價和調(diào)試。

但目前用來進(jìn)行電子耳蝸植入研究的動物模型都是小動物模型，包括貓、豚鼠、大鼠等。這些小動物的內(nèi)耳解剖、發(fā)育和體積與人類相差甚遠(yuǎn)(1)。研究時使用的植入體和電極，包括新型植入電極均需進(jìn)行特殊改制，才能植入到這些小動物的耳蝸內(nèi)。由此產(chǎn)生的實驗數(shù)據(jù)不能完全反映應(yīng)用于臨床的植入電極的真實情況，而且還需要額外耗費(fèi)資金和技術(shù)力量投入。因此，開發(fā)并建立大型哺乳動物的電子耳蝸植入實驗平臺迫在眉睫。

本研究在課題組前期對榮昌豬、小型豬的中耳、內(nèi)耳解剖結(jié)構(gòu)的大量研究及聽覺功能數(shù)據(jù)庫建立的基礎(chǔ)上。建立了規(guī)范的電子耳蝸植入手術(shù)流程，并對電子耳蝸植入前后的聽功能變化進(jìn)行了觀察和初步總結(jié)。

1　材料與方法

1.1動物及分組

榮昌豬由重慶畜牧科學(xué)院提供，分為聽力正常榮昌豬組（Mitf+/+），與突變耳聾榮昌豬組（Mitf -/-）,各3只，雌雄不限。40-45日齡，體重8～12Kg。提取豬耳廓組織，經(jīng)PCR和凝膠電泳進(jìn)一步確定豬的基因類型無誤。

1.2電子耳蝸的選擇和相關(guān)數(shù)據(jù)

使用的是國產(chǎn)諾爾康的Nurotron CS-10A型電子耳蝸。包括放入體內(nèi)的植入體（圖1.）和體外的言語處理器以及電池盒（圖2.）。

圖1　Nurotron CS-10A型電子耳蝸植入體Figure 1 Nurotron CS-10A-cochlear implants

圖2　Nurotron CS-10A型電子耳蝸體外機(jī)Figure 2 Nurotron CS-10Aelectronic cochlea in vitro

為了設(shè)計體內(nèi)植入體的固定及放置位置，以及體外機(jī)（包括體外線圈、言語處理器和電池盒）的固定、放置位置。我們測量了Nurotron CS-10A型電子耳蝸各部件的相關(guān)大小，具體數(shù)據(jù)如表1.所示。

1.3麻醉

手術(shù)前禁食12小時，手術(shù)當(dāng)天禁水。速眠新Ⅱ（1.5 mL/支，吉林某獸藥研發(fā)中心生產(chǎn)，批號0005013），以0.5ml對動物進(jìn)行頸后肌肉注射行麻醉誘導(dǎo)，10分鐘后連接呼吸機(jī)吸入異氟烷0.2ml/分鐘行全身麻醉。

表1　Nurotron CS–10A型電子耳蝸各部件測量值Table 1 The data of Components of Nurotron CS-10A

1.4手術(shù)步驟

所有動物都選擇右耳為電子耳蝸植入側(cè)。

①體位擺放：榮昌豬右側(cè)臥位，右耳朝上，左耳后海綿墊墊襯固定。

②消毒、鋪單：碘伏消毒右側(cè)耳周及顱頂部，常規(guī)鋪無菌單（圖3.）。

③右耳后切口：右側(cè)耳后，沿耳廓附著緣切口，長約5cm,上自耳廓上端，下至下頜角。切開皮膚、皮下組織，顯露頜下腺，頸部肌群。沿腺體與肌肉間分離，直至乳突骨面。切斷部分肌腱，分離顯露外耳道后壁骨面。緊貼頜下腺，在外耳道后壁用電鉆磨開一個3＊3mm的骨窗。可見外耳道后壁的軟組織，推開后，顯露出鼓膜以及面神經(jīng)，鼓索神經(jīng)，磨除部分外耳道后上壁骨質(zhì)，顯露出砧骨及鐙骨頭。

④顯露耳蝸圓窗：磨除部分面神經(jīng)表面骨質(zhì)，游離面神經(jīng)并向下移位。即可顯露圓窗。

⑤磨制電子耳蝸植入體骨槽：用明膠海綿暫時封閉外耳道后壁骨窗。延長耳后切口上端至顱頂部，切開皮膚、皮下組織、肌肉層，直至顱骨骨面。游離顱頂部軟組織，直至植入體模型置入良好。磨除頭顱頂骨與枕骨及顳骨交界處部分骨質(zhì)，顯露出硬腦膜，但注意不能損傷硬腦膜。

⑥植入體置入、固定：將Nurotron CS-10A型電子耳蝸植入體放入磨好的顱頂部骨槽內(nèi)。尼龍線縫合固定。

⑦電子耳蝸電極植入：劃開圓窗膜，將電極用專用電極鉗夾持好，通過圓窗緩慢插入耳蝸鼓階。（圖4）

⑧縫合固定體外機(jī)：將體外機(jī)線圈與植入體的線圈磁鐵對應(yīng)好，縫合固定于頭皮。并將電池盒與言語處理器放入專用保護(hù)背心內(nèi)固定于動物背部。

⑨切口：逐層縫合切口，手術(shù)結(jié)束。

圖3　榮昌豬電子耳蝸植入手術(shù)體位Figure 3 The position of Rongchang pig cochlear implant

圖4　耳蝸電極通過耳蝸圓窗路徑插入鼓階Figure 4 The cochlea electrode through the round window implant into the scala tympani

1.5聽性腦干反應(yīng)（auditorybrainstemresponse ABR）

動物麻醉后，37℃保溫板保溫。記錄電極插入顱頂正中，參考電極插入雙耳廓軟組織內(nèi)，地極插入鼻尖。在隔聲屏蔽室內(nèi)以短聲（Click）及短純音（tone burst，4kHz，8kHz，16kHz，20kHz）作為刺激音。以能分辨出可重復(fù)的ABR波形的最低刺激強(qiáng)度確定閾值[2]。

1.6電刺激腦干誘發(fā)電位（Electrical Auditory Brain?stem Response，EABR）

通過Nurotron耳蝸公司提供的EABR測試軟件，連接體內(nèi)機(jī)。調(diào)試成功后（各電極阻抗通過檢測），選擇2#，6#,10#，16#,22#電極分別記錄EABR。刺激強(qiáng)度由200CL開始，每次下降10CL，直至無法引出可以重復(fù)的EABR波形，然后以5CL幅度提高刺激強(qiáng)度，以能分辨出可重復(fù)的EABR波形的最低刺激強(qiáng)度確定閾值，并重復(fù)三次，取其平均值做為閾值。

2　結(jié)果

2.1術(shù)后動物整體狀況觀察

6只動物電子耳蝸植入手術(shù)順利，手術(shù)時間120分鐘左右，術(shù)后30分鐘左右動物蘇醒。術(shù)后無站立及行走不穩(wěn)，術(shù)后進(jìn)食正常，恢復(fù)良好。切口愈合良好，無感染、無皮膚破損，植入體無移位，無外露。顱頂部保護(hù)罩及防護(hù)外衣固定良好。（圖5B、C）

2.2電子耳蝸植入術(shù)后影像學(xué)

術(shù)后3天行頭顱X片照射檢查，顯示耳蝸植入體位于顱頂部，耳蝸電極插入位置正確，在耳蝸內(nèi)盤繞1.5～1.75圈。（圖5A）

圖5　A.電子耳蝸植入術(shù)后，X片顯示電極植入位置正確，位于豬耳蝸第一、二轉(zhuǎn)的鼓階內(nèi)；B.顱頂保護(hù)罩與防護(hù)外衣組合；C.顱頂線圈固定方法及保護(hù)罩佩戴方法。Figure 5 A.After surgery,X-ray showed that the electrode is inserted correctly,which located within the pig cochlea first to second turn of scala tympani.B.Combination of vertex protective cover and protective coat.C.Vertex coil fixed method and protective casing wear method

2.3聽功能檢測

ABR閾值測試：聽力正常榮昌豬組（Mitf+/+）動物在手術(shù)前的ABR閾值在各頻率相差不大，平均在45～50 dB SPL。電子耳蝸植入手術(shù)即刻，手術(shù)側(cè)（右耳）各頻率ABR閾值在120 dB SPL無法引出，對側(cè)耳（左耳）各頻率ABR閾值稍有升高，平均在65 dB SPL，但個體差異較大。手術(shù)后7天，手術(shù)側(cè)（右耳），低頻ABR閾值部分可以引出，閾值在100dB SPL左右，高頻在120 dB SPL仍無法引出；對側(cè)耳（左耳）各頻率ABR閾值基本恢復(fù)至手術(shù)前水平（表2.）。

EABR閾值測試：聽力正常榮昌豬組（Mitf+/+）動物，電子耳蝸植入手術(shù)即刻，不同電極（2#，6#,10#，16#,22#）刺激所得EABR閾值中，22#電極的閾值較高，在140 CL，其余電極在90 CL左右；植入手術(shù)后一周，各個電極刺激所得EABR閾值無明顯變化。突變耳聾榮昌豬組（Mitf -/-）動物,電子耳蝸植入手術(shù)即刻，不同電極（2#，6#,10#，16#,22#）刺激所得EABR閾值較高，在190 CL左右；植入手術(shù)后一周，各個電極刺激所得EABR閾值無明顯變化(表3.)。

3　討論

既往對各物種耳蝸鼓階長度測量研究顯示，小鼠為4.55mm，大鼠為7.24mm，沙鼠為9.20mm，與人類的28.46mm相差甚遠(yuǎn)[3]。課題組前期研究顯示豬耳蝸與人更為接近，長度為39.47mm，轉(zhuǎn)數(shù)為3圈半，較人類耳蝸多出一圈[4,5]。本研究顯示豬耳蝸完全可以容納臨床實際應(yīng)用的電子耳蝸電極，無需額外改造電極，可以完全再現(xiàn)耳蝸電極在體內(nèi)工作時的各種參數(shù)，得到寶貴的一手?jǐn)?shù)據(jù)。本研究中所有動物的電極都可以完全植入到耳蝸內(nèi)，為進(jìn)一步研究各個電極刺激、輸出以及聯(lián)合刺激模式提供了條件。

以往有文獻(xiàn)報道[6]電子耳蝸電極植入對殘余聽力的損傷一般是中、高頻區(qū)受損嚴(yán)重，低頻區(qū)受損相對較輕。本研究中，在聽力正常動物實行電子耳蝸植入即刻，ABR測試結(jié)果顯示，低、中、高頻都受損嚴(yán)重。這可能是由于：

①豬的耳蝸為3圈半，在同等的電極長度下，電極插入豬耳蝸時較人要多一次大角度的轉(zhuǎn)彎，并且電極前端到達(dá)的區(qū)域，豬耳蝸鼓階的高度較人類更狹小，會導(dǎo)致耳蝸更大的損傷；②電極植入時擾動了內(nèi)、外淋巴液動力學(xué)平衡，帶來的機(jī)械振動類似于強(qiáng)噪聲的損傷，而豬對噪聲損傷可能較人類更為敏感。這與前期研究中發(fā)現(xiàn)豬耳蝸頂轉(zhuǎn)毛細(xì)胞纖毛過長的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)是相符合的[2]；③本研究應(yīng)用的國產(chǎn)電極，其電極長度及結(jié)構(gòu)設(shè)計的差異，以及手術(shù)方法、熟練程度和電極植入深度不同等都可能導(dǎo)致內(nèi)耳傷害程度不一樣，從而導(dǎo)致聽力損害不同。本研究中觀察到在術(shù)后一周時，植入耳蝸電極側(cè)的低頻ABR部分有所恢復(fù)，達(dá)到100 dB SPL左右，但高頻部分在120 dB SPL仍無法引出（表2.）。分析其原因可能為:①低頻聽力部分對應(yīng)的區(qū)域在耳蝸尖部，植入的電極并沒有到達(dá)和直接損傷該區(qū)域。在電極植入一周后，內(nèi)、外淋巴液動力學(xué)再次達(dá)到平衡，低頻的聽力得以部分恢復(fù)；②但由于手術(shù)創(chuàng)傷以及植入電極引發(fā)的炎性反應(yīng)會波及到低頻區(qū)域，因此仍有不可逆的聽力損害。目前在臨床中，局部使用糖皮質(zhì)激素減輕炎性反應(yīng)，可以幫助術(shù)者實現(xiàn)保存殘余聽力的目的。

本研究中，植入電極耳的對側(cè)聽力也有一過性的損害（表2.）。可能是因為豬的顳骨乳突部分為板障型，磨骨時的減震效果較人類差，導(dǎo)致噪聲性聽力損害，表現(xiàn)為暫時性閾移。這也提示研究人員，在臨床中如果行單側(cè)聾患者的耳蝸植入時，要注意對側(cè)耳的聽力保護(hù)。

本組6只動物EABR測試中，設(shè)計了5個不同位置的電極作為測試點，其中2#為電極頭端，對應(yīng)于低頻區(qū)域，6#,10#，16#,22#依次排列直至圓窗位置。聽力正常組的各個電極EABR閾值均較相應(yīng)的耳聾組低，分析是由于耳聾動物耳蝸內(nèi)的螺旋神經(jīng)節(jié)數(shù)量減少導(dǎo)致。前期研究中發(fā)現(xiàn)突變耳聾榮昌豬組（Mitf -/-）的螺旋神經(jīng)節(jié)數(shù)量在出生后30天減少至正常的70%[7]。本研究中使用的動物是出生后40 天-45天，耳蝸內(nèi)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量已經(jīng)有明顯的減少，導(dǎo)致EABR的閾值增高。研究結(jié)果還顯示2組內(nèi)的EABR閾值，靠近圓窗處的22#電極閾值高于其他電極的閾值。既往動物實驗結(jié)果與本研究類似，刺激電極從蝸尖移至蝸底時，EABR的Ⅰ波和Ⅲ波潛伏期逐漸延長，反應(yīng)閾值亦增高[8,9]。其原因主要考慮與EABR刺激電流的性質(zhì)、刺激電極位置、電極與螺旋神經(jīng)節(jié)及耳蝸神經(jīng)的距離等條件有關(guān)。從本研究的結(jié)果分析，靠近圓窗的22#電極距離螺旋神經(jīng)節(jié)較遠(yuǎn)，也符合EABR測試的結(jié)果。并且，電極周圍的纖維化反應(yīng)也可能增加電阻，進(jìn)一步使EABR閾值增高。

本研究運(yùn)用榮昌豬，一種大型哺乳動物，成功建立了臨床常規(guī)使用的電子耳蝸設(shè)備的耳蝸植入研究平臺。但目前的樣本量較少，僅有6只動物，并且只做了急性期的研究觀察，尚缺乏大樣本和長期的研究數(shù)據(jù)，所得數(shù)據(jù)還不能建立具有統(tǒng)計學(xué)意義的數(shù)據(jù)庫，還有待進(jìn)一步完善和深入研究。

表2　聽力正常（Mitf+/+）動物電子耳蝸植入前后ABR閾值Table 2 ARB threshold of normal animals（Mitf+/+）before and after cochlear implantation

表3　聽力正常（Mitf+/+）與突變耳聾豬（Mitf-/-）電子耳蝸植入前后EABR閾值（CL）Table 3 EABR threshold of normal hearing pigs (Mitf +/+),and the mutation deafness pigs (Mitf -/-) before and after cochlear implantation

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·聽覺研究新模型專輯·

Establish the standard method of Rongchang pig cochlear implant and preliminary observation of hearing function

CHEN Wei1，2,LIU Riyuan1,ZHAGN Liang3,JI Fei1,GUO Weiwei1,REN Lili1,LI Jianan1,YUAN Shuolong1,ZHANG Yue1,CHEN Lei3,YANG Shiming*1
1 Department of Otolaryngology,Head & Neck Surgery,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China.2 Department of Otolaryngology,Head & Neck Surgery,Chinsese PLA Air Force General Hospital,Beijing 100036,China.3 Key Laboratory of Pig Industry Sciences (Ministry of Agriculture),Chongqing Academy of Animal Science,Chongqing 402460,China.
Corresponding author:YANG ShimingEmail:yangsm301@263.com

【Abstract】Objective Establish the standard method of cochlear implant on large mammals–pigs,and observed the changes of ABR & EABR before and after cochlear implants.Methods Six Rongchang pigs,male and female unlimited,40-45 days,8 ~ 12 kg,were selected from Key Laboratory of Pig Industry Sciences (Ministry of Agriculture),Chongqing Academy of Animal Science.Divided into the normal hearing group (Mitf +/+),and the mutation deafness group (Mitf -/-),each group of three.Cochlear implantation were operated in general anesthesia.ABR & EABR were recorded prior to surgery,immediately finish surgery and 1 week after.Observed the position of electrodes by Skull X-ray.Results Cochlear implant is succeed in six animals,electrode position is good,within the cochlea coiling 1.5 ~ 1.75 turns.Cochlear implants immediately,operation side (right),waveform of ABR can’t be recorded.Seven days after the operation,operation side (right),ABR threshold is 100 dB SPL at low frequency,but waveform of ABR can’t bebook=16,ebook=25recorded at high frequency still.Cochlear implants immediately and a week later,EABR threshold is 90 CL at normal hearing group (Mitf +/+).It was lower than 190 CL of group of mutation deafness(Mitf -/-).Conclusion Our study show that the methods of cochlear implant at Rongchang pig is really practical,and the EABR test via electrodes implanted is convenient and feasible.Our study provide the basis for more directly research on cochlear implants in vivo and the physiological or pathological changes of cochlear after cochlear implanted.

【Key words】Cochlear implant，Rongchang pig，ABR，EABR

收稿日期：2016-02-03

通訊作者：楊仕明，Email:yangsm301@263.com

作者簡介：陳偉，博士在讀，副主任醫(yī)師，研究方向：電子耳蝸植入相關(guān)研究，內(nèi)耳基因及干細(xì)胞治療相關(guān)聽覺醫(yī)學(xué)研究

基金項目：國家973計劃重大科學(xué)研究計劃干細(xì)胞項目（2012CB967900）；國家973計劃重大科學(xué)問題導(dǎo)向項目（2011CBA01000）；國家自然科學(xué)基金面上項目（81271082）；國家自然科學(xué)基金青年項目（81400472）；北京科技創(chuàng)新基地培育與發(fā)展專項；重慶市基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項目（11611，14440）；空軍總醫(yī)院課題（KZ2015005）。

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.01.004

【中圖分類號】R764

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1672-2922（2016）01-15-6