李亞袁碩龍張悅潘紅梅任麗麗張亮?xí)r晰喬月華,3徐州醫(yī)學(xué)院聽力中心中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科北京008533徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床聽力中心重慶市畜牧科學(xué)院

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小型豬與大鼠不同記錄部位誘發(fā)VEMP的比較

李亞1*袁碩龍2*張悅2潘紅梅4任麗麗2張亮4時晰1喬月華1,3
1徐州醫(yī)學(xué)院聽力中心
2中國人民解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科北京100853
3徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床聽力中心4重慶市畜牧科學(xué)院

【摘要】目的分析正常小型豬不同記錄部位（頸部伸肌、咬?。┑那巴フT發(fā)肌源性電位（vestibular evoked myogenic potential,VEMP）波形圖，并與大鼠的VEMP波形圖進(jìn)行比較；方法各選取12只前庭功能正常的大鼠和小型豬，進(jìn)行麻醉之后，用自制裝置進(jìn)行固定，1000Hz強(qiáng)短聲誘發(fā)頸部伸肌、咬肌肌源性電位，并記錄其波形；結(jié)果大鼠頸部伸肌誘發(fā)的肌源性電位，第一個正向波P的潛伏期為6.45±0.23ms，振幅約1.45±0.49uv，80dB SPL引出率為58%；咬肌誘發(fā)肌源性電位，第一個正向波P的潛伏期為6.38±0.34ms，振幅約1.57±0.35uv，閾值80dB SPL引出率為50%。小型豬頸部伸肌誘發(fā)肌源性電位，第一個正向波P的潛伏期7.65±0.64ms，振幅1.66±0.34uv，80dBSPL的引出率為58%；咬肌誘發(fā)肌源性電位，第一個正向波P的潛伏期7.60±0.78ms，振幅1.31±0.28uv，80dBSPL的引出率為50%。結(jié)論小型豬和大鼠不同部位記錄得到的VEMP，只有振幅和引出率的差異，而潛伏期沒有統(tǒng)計學(xué)意義；從波形的重復(fù)性、波幅的大小、引出率以及潛伏期的綜合考慮，小型豬咬肌部位記錄的VEMP波形優(yōu)于頸部伸肌，大鼠頸部伸肌記錄得到的VEMP波形優(yōu)于咬??；在相同部位記錄到VEMP第一個正向P波的潛伏期時間、波幅的大小方面小型豬較大鼠的稍高。

【關(guān)鍵詞】前庭誘發(fā)肌源性電位；小型豬；大鼠；頸部伸肌肌源性電位；咬肌肌源性電位

李亞和袁碩龍為并列第一作者

Fund project :The national 973 Plan major scientific research project of stem cell project (2012CB967900).The national 973 Plan major scientific issues oriented project (2011CBA01000).National Natural Science Foundation of China（81400472）.The fundamental research funds for the project in Chongqing city (11611,14440).National Natural Science Foundation of China（81470684）.Jiangsu province clinical medical science and technology special b12014032.The peak of six talents in Jiangsu Province 2014-WSN-043,China Postdoctoral Science Foundation 2015M571818,Student innovation and entrepreneurship training program of higher education of Jiangsu province 201510313003Z.Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest.

前庭誘發(fā)性肌源性電位(Vestibular-evoked myo?genic potential,VEMP)，是過強(qiáng)音刺激球囊并在緊張的骨骼肌上記錄到的肌源性電位，來反映人和動物前庭丘腦通路完整性的一種客觀、無創(chuàng)的電生理檢查方法，對于前庭系統(tǒng)及其相關(guān)疾病的診斷具有重要的臨床參考價值[1,2]。進(jìn)行VEMP檢查時需要胸鎖乳突肌保持一定的張力,部分年老者及頸椎疾病患者進(jìn)行VEMP檢測較為困難，Deriu等[3,4]通過聲、電刺激正常人的前庭，在咬肌記錄到肌源性電位；謝溯江等[5]建立強(qiáng)短聲誘發(fā)的咬肌肌源性電位的鼠的模型，并探討了該電位的起源。

小型豬已在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，在耳科研究中，小型豬在解剖、生理上等方面與人類極為相似，尤其前庭的形態(tài)結(jié)構(gòu)和相對位置與人的更為接近[6]，正逐步成為研究人類耳科疾病的重要實驗動物[7,8]；小型豬的咬肌，較為粗壯發(fā)達(dá)，近似正方形，起自顴骨，止于下頜支，該肌肉表面有面皮肌和面神經(jīng)，深面主要覆蓋下頜支[9]；位置表淺、肌肉粗大、易操作；大鼠咬肌發(fā)達(dá)、皮下脂肪少、易定位；在臨床上，頸部伸?。ㄐ劓i乳突肌）作為VEMP的記錄部位已得到廣泛的應(yīng)用，已成為評價前庭功能的常用檢測方法之一；因此本實驗選取頸部伸肌和咬肌分別作為VEMP的記錄部位，在小型豬和大鼠上進(jìn)行觀察。本研究選取的廣西巴馬小香豬和大鼠作為研究對象，分析其在頸部伸肌、咬肌部位記錄到的VEMP波形圖的特點，兩者進(jìn)行比較。

2　材料方法

2.1實驗動物及分組

12頭正常的雌性小型巴馬香豬（由中科院北方大動物研究基地提供），出生后6個月，體重約25kg，檢查外耳道有無異常分泌物，觀察有無步態(tài)異常、頭部左右搖晃、軀干卷曲、強(qiáng)迫環(huán)行運(yùn)動（轉(zhuǎn)圈）等平衡功能異常表現(xiàn)，12只成年雌性大鼠（軍事科學(xué)院實驗動物中心），體重300g左右觀察耳廓反射是否靈敏、有無四肢外展或無力、平衡障礙等行為異常；分別在小型豬與大鼠進(jìn)行VEMP測試。

2.2麻醉

為了減少清醒狀態(tài)下腦電活動、頭部運(yùn)動及四肢肌肉的運(yùn)動干擾，在測試前對實驗動物進(jìn)行麻醉，麻醉前禁食12h；以3%戊巴比妥鈉（1ml/kg，北京普博斯生物公司）+速眠新Ⅱ(0.1ml/kg，吉林華牧動物保健品有限公司）給予小型豬肌肉注射麻醉；3min-5min即出現(xiàn)小型豬頭部下耷、活動減少、步態(tài)不穩(wěn)、喜臥等表現(xiàn)，大鼠給予1%戊巴比妥鈉（北京普博斯生物公司）0.4ml/100g進(jìn)行腹腔緩慢注射，以角膜反射、疼痛消失為標(biāo)志表示麻醉成功。

2.3VEMP測試

將針式記錄電極插入大鼠右側(cè)咬肌下1/3表層，參考電極插入鼻尖，接地電極插入頭頂部皮下。在大鼠上下門齒之間銜一自制塑料球，使其上下頜骨盡可能張大，人為的使咬肌緊張性增強(qiáng)，使大鼠咬肌保持一定的張力，以便VEMP的記錄；大鼠頸部伸肌肌源性電位檢測的麻醉方法同咬肌，記錄電極置于頸部伸肌的中點，參考電極放置于顱頂，地線接于鼻尖；用自制固定瓶，將大鼠身體放入其中，頭部裸露在外，用自制固定帶固定其頭部，使其頭部轉(zhuǎn)向一側(cè)，確保頸部伸肌保持一定程度的張力；用Smart EP誘發(fā)電位儀(美國智聽公司)記錄咬肌電位，疏波短聲0.1ms，短聲刺激疊加次數(shù)128次，頻率1000Hz；由插入外耳道內(nèi)的ER3A耳機(jī)(型號MO15300)給聲，肌電圖信號放大100 k，帶通濾波30～3 000Hz，刺激重復(fù)率5 Hz，掃描時間50ms，疊加128次。刺激強(qiáng)度從100 dB SPL開始,每次下降10dB SPL，直到波形消失；在閾值強(qiáng)度進(jìn)行連續(xù)2次記錄,以驗證其重復(fù)性和穩(wěn)定性。

小型豬的咬肌近似正方形，位置表淺，肌纖維粗壯發(fā)達(dá)，起自顴骨，止于下頜支，該肌肉表面內(nèi)有面皮肌和面神經(jīng)走行，深面主要覆蓋下頜支[9]。小型豬頸部在解剖結(jié)構(gòu)上與人的有所差異，其脂肪組織較厚，椎間隙較窄，限制其頭部的活動范圍；其頸部伸肌在解剖結(jié)構(gòu)和生理上與人的胸鎖乳突肌類似，位于其頸部兩側(cè)，其起于肱骨嵴，止于枕骨和巖顳骨，其表面被較厚的脂肪組織所覆蓋，不易觸及，是頸部最為重要的肌肉，主要支配頭部的旋轉(zhuǎn)、抬頭頸部伸?。挥肧mart EP誘發(fā)電位儀(美國智聽公司)記錄咬肌和頸部伸肌誘發(fā)電位。使用開放聲場記錄。

3　結(jié)果

大鼠頸部伸肌的肌源性電位，第一個正向波P的潛伏期為6.45±0.23ms，振幅約1.64±0.49uv，100dB SPL、90dB SPL、80dB SPL引出率分別為100%、75%、58.3%，閾值為80dB SPL；咬肌肌源性電位，第一個正向波P的潛伏期為6.42±0.34ms，振幅約1.47±0.35uv，100dB SPL、90dB SPL、80dB SPL引出率分別為100%、66%、50%，閾值80dB SPL；小型豬頸部伸肌肌源性電位，第一個正向波P的潛伏期7.65±0.64ms，振幅1.66±0.34uv，100dB SPL、90dB SPL、80dB SPL引出率分別為100%、83%、58%，閾值80dB SPL；咬肌肌源性電位，第一個正向波P的潛伏期7.60±0.78ms，振幅1.31±0.28uv，100dB SPL、90dB SPL、80dB SPL引出率分別為100%、75%、50%，閾值80dB SPL。

圖1　A/B分別為小型豬、大鼠的ABR波形Fig.1 The normal ABR waveform (SPLdB) was detected in the mini pig and rat ,the threshold value was 25dB SPL

圖2　A為6月齡雌性小型豬從頸部伸肌部位記錄到的肌源性電位，第一個正向波P的潛伏期的時間約7.52ms，振幅約1.50uv左右，閾值約75dB SPL，第二個負(fù)向波N波的潛伏期的時間約為9.87ms；B為6月齡雌性小型豬咬肌的肌源性電位，第一個正向波P的潛伏期大約7.63ms，振幅約1.33uv，閾值約75dB SPL，第二個負(fù)向波N的潛伏期為11.63ms左右，從圖可以看出，咬肌部位記錄到的波形基線較為平穩(wěn)，重復(fù)性較好。Fig.2 A:neck extensor muscle evoked myogenic potential in female mini pigs of 6 months，The first forward wave Pof the latency is about 7.52ms,the amplitude is about 1.50uv,the threshold is about75dBSPL,thefirstnegativewave Nofthelatencyis9.87ms; B:masseter muscle evoked myogenic potential in female mini pigs of 6 months，The first forward wave P of the latency is about 7.63ms,the amplitude is about 1.60uv,the threshold is about 75dBSPL,thefirstnegativewave Nofthelatencyis11.63ms.

圖3　A是成年雌性大鼠頸部伸肌的肌源性電位，第一個正向波P的潛伏期約6.45ms，振幅約1.50uv，閾值80dBSPL；B是雌性大鼠咬肌部位的肌源性電位，第一個正向波P的潛伏期約6.52ms，振幅約1.77uv，閾值80dBSPL。Fig.3 A:The neck extensor muscle evoked myogenic potentials in adult female rats，The first forward wave P latency is about 6.45ms,the amplitude is about 1.50uv,the threshold value is 80dBSPL; B:Female rats masseter muscle sites evoked myogenic potentials,the first positive P wave latency period is approximately 6.52ms,amplitude is about 1.77uv,threshold is 80dBSPL.

圖4　A1/A2為小型豬頸部伸肌及咬肌部位記錄VEMP時的擺放位置；B1/B2為在大鼠進(jìn)行頸部伸肌及咬肌部位記錄VEMP時的擺放位置。Fig.4 A1/A2 Pose of mini pigs when recording VEMP in the neck extensor and masseter muscle B1/B2 Pose of rats when recording VEMP in the neck extensor and masseter muscle

5　討論

臨床上，VEMP常用于評價一些神經(jīng)耳科學(xué)疾病，如聽神經(jīng)瘤、梅尼埃病、前庭神經(jīng)炎、上半規(guī)管裂綜合征、多發(fā)性硬化癥、良性陣發(fā)性位置性眩暈、前庭性偏頭痛以及其它外周或中樞性前庭疾?。籚EMP的振幅是評價前庭功能的一個重要指標(biāo)，但是其易受其他因素的干擾如：刺激聲的頻率與能量、年齡、肌力、表皮厚度甚至性別等[11,12,13]，所以采用同性、體重相等的實驗動物，以消除自身差異對VEMP的影響；周娜[14]等同樣發(fā)現(xiàn)個體間的振幅差異較大，而潛伏期無明顯差異，振幅是VEMP在臨床應(yīng)用上的一個比較重要的指標(biāo)，但受到兩側(cè)肌力差異的影響，進(jìn)而影響波幅準(zhǔn)確性的判斷[15,16]。雖然在臨床檢查過程中，使用表面肌電圖檢測胸鎖乳突肌肌張力的大小，并遵循國外學(xué)者[17]建議將表面肌電圖的靶向水平控制在30uv-50uv，但是迄今為止還沒有能夠完全建立一個標(biāo)準(zhǔn)方法來縮小這種差異[18,19]。在動物實驗過程中盡可能增加咬肌及頸部伸肌的肌張力，以有利于VEMP波形的記錄，但不可避免的造成振幅相關(guān)指標(biāo)的靈敏度和客觀性的降低。VEMP的振幅與檢測部位肌肉的表面肌電圖平均水平有明顯的正相關(guān)關(guān)系，檢測部位的肌張力直接影響VEMP的振幅的強(qiáng)弱[15,17]；在咬肌部位所記錄的振幅，小型豬的波幅低于大鼠，其原因可能有1）、小型豬受生理狀態(tài)的影響，一些前庭神經(jīng)纖維衰退及咬肌肌肉生理性萎縮，使神經(jīng)傳導(dǎo)速度變慢及肌肉的張力降低；2）、在小型豬整個測試過程較大鼠耗時長，長時間、高強(qiáng)度咬肌緊張較容易使咬肌肌肉產(chǎn)生疲勞，影響肌肉收縮，影響振幅的幅度。3）、大鼠為嚙齒雜食類動物，單位面積咬肌肌纖維密度大、數(shù)量多且單個肌纖維較粗；4）、在測試過程中，所使用的使咬肌肌張力增加的工具是我們自制的，存在人為的因素使小型豬咬肌肌張力降低；通過此實驗，發(fā)現(xiàn)無論是經(jīng)頸部伸肌或咬肌部位所誘發(fā)VEMP均需要使背景肌肉高度緊張，由于動物背景肌的解剖結(jié)構(gòu)與功能與人類有所差異，還沒有找到合適的方法使頸部伸肌高度緊張而頸部其他肌肉組織松弛，因此，這種方法記錄到的波形易受動物自身狀態(tài)的影響，造成基線不穩(wěn)、雜波干擾以及振幅變化較大，在實驗過程中應(yīng)盡力避免這種干擾，以確保波形良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性；由于小型豬頸部肌肉組織解剖復(fù)雜，皮表被較厚的脂肪組織覆蓋，因此，測試過程中易引起頸部伸肌張力性不足，記錄電極放置定位不清，造成記錄數(shù)據(jù)的差異較大，長時間的頸部背伸，還易造成實驗動物氣道的通氣不暢，引起打鼾、氣道分泌物增多甚至窒息；咬肌記錄VEMP時，動物的軀干及頸部俯臥于檢測臺上，始終處于休息松弛狀態(tài)，避免了一些肌電的干擾，得出的波形重復(fù)性較好、基線較為平穩(wěn)；本研究認(rèn)為，盡管從咬肌部位引出VEMP的振幅及部分刺激強(qiáng)度的引出率低于頸部伸肌，但從動物自身的安全性、圖形的重復(fù)性和穩(wěn)定性以及實驗操作簡易程度上來講，以小型豬咬肌作為VEMP的記錄部位所引出的波形優(yōu)于頸部伸肌。然而，從波形的重復(fù)性、波幅的大小、引出率以及潛伏期的綜合評比，我們在大鼠頸部伸肌記錄到的VEMP波形優(yōu)于咬肌，與一些學(xué)者的研究表述基本一致，究其原因我們推測可能與其記錄部位背景肌肉本身的解剖結(jié)構(gòu)及生理功能有關(guān)，也有可能與本研究的記錄方式有關(guān)，需要在以后的研究中進(jìn)一步探討。對于不同動物模型VEMP的振幅，由于記錄條件的限制，現(xiàn)階段沒有有效的方法去監(jiān)測其背景肌肉的肌電活動水平，為了使結(jié)果更可靠及客觀，應(yīng)同步記錄背景肌肉的張力水平；怎樣檢測背景肌肉的張力是咬肌肌源性誘發(fā)電位能否推廣應(yīng)用的關(guān)鍵所在。目前認(rèn)為波幅的絕對值的差異可能只是因為肌肉張力的影響，而與前庭功能是否正常無關(guān)；僅研究波幅絕對值的變化，在目前條件下是沒有意義的[4]。

表1　小型豬與大鼠不同部位引出的潛伏期、振幅之間的比較Table 1 Comparison between the latency and amplitude of the different parts of the mini pig and rat.*Compare among groups P<0.05.

VEMP的潛伏期是評價前庭功能的一個重要指標(biāo)，在VEMP的動物模型中，第一個正向波所引出頻率最高（100dB/SPL，約100%引出）[11,12]，應(yīng)用意義也最大，故本實驗只關(guān)注該正向波。在強(qiáng)短聲誘發(fā)的小型豬不同部位（咬肌、頸部伸?。┘≡葱噪娢坏牡谝粋€正向波潛伏期范圍為7-9ms，與本研究在小型豬的頸部伸?。ū垲^?。┥险T發(fā)的肌源性電位的潛伏期范圍是一致的。大鼠在咬肌部位及頸部伸肌部位記錄到的第一個正向波的潛伏期為6-8ms。兩種實驗動物在咬肌部位及頸部伸肌部位記錄到的第一個正向波的潛伏期，沒有統(tǒng)計學(xué)差異。兩種實驗動物在80dBSPL的引出率上頸部伸肌部位的引出率高于咬肌。通過兩種實驗動物之間的比較發(fā)現(xiàn)，在小型豬咬肌部位記錄到的VEMP的潛伏期與人的較為接近，小型豬VEMP的潛伏期低于人的，而高于大鼠的，這與其神經(jīng)通路的長短及神經(jīng)纖維的直徑有關(guān)，在強(qiáng)短聲誘發(fā)的小型豬VEMP的第一個正向波潛伏期范圍為7-9ms，大鼠VEMP的記錄到的第一個正向波的潛伏期約為6-8ms，潛伏期代表由外周－腦干－咬肌運(yùn)動神經(jīng)核各受體激活的時間[20]，小型豬和人的潛伏期較長可能與球囊信號向中樞神經(jīng)傳遞過程所消耗的時間較多有關(guān)，在臨床上潛伏期增加可能是外周前庭功能減退所致及有髓神經(jīng)纖維衰老變性后的低傳導(dǎo)率有關(guān)；根據(jù)Cazals和Didier等[21.22]的研究，聲刺激大鼠前庭神經(jīng)的潛伏期為1 ms，前庭核團(tuán)的潛伏期為3ms，如果咬肌肌源性電位來自前庭，那么其正波潛伏期應(yīng)至少大于4 ms，而小于人體數(shù)據(jù)的11 ms[4,23]。本研究中記錄的大鼠頸部伸肌和咬肌肌源性電位的潛伏期就正好位于6-8ms內(nèi)。

盡管VEMP能客觀的評價前庭功能的狀態(tài)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床中，但是仍存在許多問題需要進(jìn)一步探究；首先，現(xiàn)已證實VEMP來源于球囊，但是與其它前庭器官的關(guān)系究竟如何，目前還不是十分的清楚；其次，尚缺乏特異性球囊功能障礙的動物模型，在動物實驗方面受到一定的限制；再次，目前動物實驗還沒對VEMP檢查規(guī)范化形成統(tǒng)一的認(rèn)識。因此，VEMP的檢查（尤其是動物VEMP的檢查），我們還有相當(dāng)多的工作要做。

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·聽覺研究新模型專輯·

Vestibular-evoked myogenic potentials recorded from miniature pigs and rats

LI Ya1*,YUAN Shuolong2*,ZHANG Yue2,PAN Hongmei4,REN Lili2,ZHANG Liang4,SHI Xi1，QIAO Yuehua3
1Xuzhou Medical College listening Center 2Department of Otolaryngology,Head & Neck Surgery,Institute of Otolaryngology,Chinese PLA General Hospital,Beijing 100853,China.3Clinical hearing center of Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College 4Key Laboratory of Pig Industry Sciences (Ministry of Agriculture),Chongqing Academy of Animal Science
Corresponding author:QIAO YuehuaEmail:oto8558@163.com

【Abstract】Objective To report vestibular evoked myogenic potentials from different recording sites (neck extensor muscle and masseter muscle) in mini pigs and rats.Methods Potentials were recorded from neck extensor muscles or masseter muscles in normal adult Bama mini pigs and rats anesthetized with 3% pentobarbital sodium and Sumianxin II using 1000 Hz tone bursts.Results At 80 dB SPL,the latency,amplitude and response rate of the first positive wave P was 6.45± 0.23 ms,1.45±0.49 uv and 58%,respectively,from rat neck extensor muscles; 6.38±0.34 ms,1.57±0.35 uv and 50% from rat masseter muscles; 7.65±0.64 ms,1.66±0.34 uv and 58% from mini pig neck extensor muscles; and 7.65±0.64 ms,.31± 0.28 uv and 50% from mini pig masseter muscles.Conclusion VEMP can be recorded from neck extensor and masseter muscles in mini pigs and rats.Within a given species,VEMP amplitude and response rate are dependent on the site of recording,while latency is not.Analysis of the responses suggests that the optimal VEMP recording site is the masseter muscle in mini pigs but cervical extensor muscles in rats.At the same recording site,the latency and amplitude of VEMP are slightlybook=28,ebook=37greater in mini pigs than in rats.

【Keywords】vestibular evoked myogenic potentials; mini pig; rat; masseter muscle myogenic potential;

收稿日期：（2016-01-26）

通訊作者：喬月華,Email:oto8558@163.com

作者簡介：李亞，碩士，研究方向：耳科學(xué)基礎(chǔ)研究

基金項目：國家973計劃重大科學(xué)研究計劃干細(xì)胞項目（2012CB967900）；國家973計劃重大科學(xué)問題導(dǎo)向項目（2011CBA01000);國家自然科學(xué)基金青年項目（81400472）;重慶市基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項目（11611、14440）;江蘇省六大人才高峰2014-WSN-043;中國博士后基金2015M571818;江蘇省高等學(xué)校大生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃201510313003Z，

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.01.006

【中圖分類號】R339.16

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1672-2922（2016）01-27-5