孔德真，華東來，王秀珍，劉步倉，祝建波，王愛英

(新疆石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832000)

dGFP-GUS基因標(biāo)記新疆棉花黃萎病原菌的研究

孔德真，華東來，王秀珍，劉步倉，祝建波，王愛英

(新疆石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832000)

【目的】研究棉花黃萎病原菌的入侵機(jī)理?！痉椒ā恳詭в谐泵顾乜剐院Y選基因的PUCCATPH載體以及pCAMBIA1304載體作為骨架，構(gòu)建trpc啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GFP-GUS基因的新疆棉花黃萎病菌表達(dá)載體1304-P-ORF，導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101和AGL-1中。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)(ATMT)法分別轉(zhuǎn)入新疆棉花黃萎病原菌VD-1和VD-278中，對(duì)表達(dá)效果進(jìn)行檢測(cè)。【結(jié)果】篩選的潮霉素B濃度為30 μg/mL，農(nóng)桿菌AGL-1對(duì)黃萎病菌的轉(zhuǎn)化效率比GV3101高40%。T0代經(jīng)含有潮霉素B的PDA培養(yǎng)基篩選，獲得了T1代轉(zhuǎn)基因大麗輪枝菌VD-12株，VD-2 784株。通過GUS組織染色，在轉(zhuǎn)基因VD-1和VD-278的菌絲和孢子中均可觀察到GUS基因的表達(dá)。對(duì)轉(zhuǎn)基因黃萎菌進(jìn)行PCR分子檢測(cè)，均可檢測(cè)到GFP和潮霉素B基因。GUS-GFP和潮霉素B基因已成功轉(zhuǎn)入新疆棉花黃萎菌VD-1和VD-278中。【結(jié)論】建立了新疆棉花黃萎菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為進(jìn)一步利用GFP-GUS基因研究新疆棉花黃萎菌對(duì)棉花侵染的過程奠定基礎(chǔ)。

trpc啟動(dòng)子；農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化；GFP-GUS；棉花黃萎病菌

0 引 言

【研究意義】棉花黃萎病是由大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)引起的一種真菌性維管束系統(tǒng)病害[1]。當(dāng)生長(zhǎng)正常的植物被大麗輪枝菌侵染后，在植物木質(zhì)部的導(dǎo)管系統(tǒng)中大量繁殖，使植物水分運(yùn)輸蒸騰阻力增大，從而減少植物葉片組織中水分供應(yīng)，進(jìn)而使植物的光和速率和蒸騰速率減慢[2]。機(jī)械障礙和毒素作用現(xiàn)在已經(jīng)被認(rèn)為是黃萎病菌致病的兩個(gè)主要原因。但是在毒素作用中黃萎病菌產(chǎn)生的多糖蛋白是主要的萎蔫毒素，毒素通過刺激植物微管周圍的薄壁細(xì)胞，從而使植物細(xì)胞產(chǎn)生大量的代謝物，造成了植物正常代謝系統(tǒng)紊亂，最終導(dǎo)致了棉花植株的死亡[3]。雖然這兩種觀點(diǎn)已經(jīng)有很多試驗(yàn)證據(jù)證明了黃萎病菌的致病機(jī)理，但黃萎病菌如何侵入植物體，并且在植物體內(nèi)怎樣繁殖和生長(zhǎng)還不清楚，所以需要引入一種觀察和事實(shí)檢測(cè)定的方法，揭示棉花黃萎病菌和棉花之間的互作。 【前人研究進(jìn)展】GFP和GUS基因作為兩種最為常用的報(bào)告基因，已經(jīng)成功用于目的基因的表達(dá)定位，活細(xì)胞蛋白的定量觀察和動(dòng)力學(xué)研究等方面[4-5]。Andrie等[6]和Vallad等[7]利用sGFP基因，分別在馬鈴薯和萵苣中分離的大麗輪枝菌菌株中成功標(biāo)記了綠色熒光，依賴菌體上的綠色熒光，對(duì)病原菌侵染的不同階段進(jìn)行了觀察?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】由于黃萎病菌對(duì)植物的侵染是通過微管進(jìn)行擴(kuò)展的，致病力不同的黃萎病菌對(duì)植物的侵染過程是不同的，為了研究致病力不同黃萎病在植物中侵染過程，構(gòu)建了含有明顯標(biāo)記的真菌表達(dá)載體，通過標(biāo)記來研究病菌的侵染過程。報(bào)告基因dGFP-GUS是由植物表達(dá)載體pCAMBIA1304載體攜帶的融合表達(dá)基因，通過對(duì)植物表達(dá)載體的改造，去除了植物表達(dá)載體，在報(bào)告基因上游加入了黃萎病菌識(shí)別的，在黃萎病菌中啟動(dòng)報(bào)告基因，并且連有啟動(dòng)子和潮霉素B的開放閱讀框，構(gòu)建含有dGFP-GUS的真菌表達(dá)載體，通過點(diǎn)擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGL-1中。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化已從烏蘇地區(qū)分離的落葉型和非落葉型黃萎病菌Vd-1和Vd-278，得到已經(jīng)轉(zhuǎn)化成功的黃萎病菌，通過GUS組織染色，得到已經(jīng)轉(zhuǎn)化成功的黃萎病菌?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為研究大麗輪枝菌侵染棉花過程的組織學(xué)和致病機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及試劑

農(nóng)桿菌GV3101、AGL-1，大麗輪枝菌菌株VD-1和VD-278均由新疆烏蘇地區(qū)棉區(qū)分離獲得，采用鑒定棉花大麗輪枝菌特異引物zhu-1/zhu-2(5’-CATCAGTCTCTCTGTTTATACCAACG-3’/5’-CGATGCGAGCTGTAACTACTACGCAA-3’)，大麗輪枝菌落葉型和非落葉型引物D-1/D-2(5’-CATGTTGCTCTGTTGACTGG-3’/5’-GACACGGTATCTTTGCTGAA-3’)和ND-1/ ND-2(5’-CAGGGGATACTGGTACGAGACG-3’/5’-ATGAGTATTGCCGATAAGAACA-3’)引物進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果為非落葉型大麗輪枝菌。質(zhì)粒PUCCATPH由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)李繼剛教授饋贈(zèng)，植物表達(dá)載體pCAMBIA1304由石河子大學(xué)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，在研究中構(gòu)建載體所需要的分子試劑均購自TaKaRa(Japan)公司；引物合成和序列的測(cè)定由北京華大基因公司完成。

1.1.2 基本培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

大腸桿菌用LB培養(yǎng)，37℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)過夜。農(nóng)桿菌用LB常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，200 r/min、28℃，振蕩培養(yǎng) 2 d?；九囵B(yǎng)基 MM[8]和誘導(dǎo)培養(yǎng)基 IM[9]用于農(nóng)桿菌的遺傳轉(zhuǎn)化培養(yǎng)。大麗輪枝菌用CM[10]和 Czapek 培養(yǎng)基的培養(yǎng)，25℃，150 r/min培養(yǎng)4～7 d?？股乜敲顾?Km)、利福平(Rif)和氨噻肟頭孢霉素(Cef)用量為 100 μg/mL；潮霉素(hyg)用量為30 μg/mL。

1.2 方 法

1.2.1 含有trpc啟動(dòng)子潮霉素B開放閱讀框和trpe啟動(dòng)子的克隆與鑒定

在以質(zhì)粒DNA PUCCATPH為模板，克隆含有潮霉素 B的反應(yīng)體系如下：1 μL質(zhì)粒DNA，5 μL 10×TaqDNA聚合酶Buffer，4 μL dNTP，上游引物ORF-F(5’-CGAGCTCGGTCGACAGAAGATGATATTGAA-3’)和下游引物 ORF-R (5’-CAAGCTTGCAGGGGCTGGTGACGGAATTTT-3’)各1 μL(虛線標(biāo)注部分為SacⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn))，TaqDNA聚合酶 1 μL，ddH2O補(bǔ)齊，總體積為50 μL，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，進(jìn)入循環(huán)94℃變性30 s，63℃退火45 s，72℃延伸2 min，30個(gè)循環(huán)，72℃終延伸7 min；啟動(dòng)子的克隆按照上述程序反應(yīng)，trpc啟動(dòng)子上游引物Ptrpc-F(5’-CAAGCTTGGTCGACAGAAGATGATATTGAA-3’)和下游引物(5’-CCCATGGGGATCGAGGCTTGGGTAGAATAG-3’)，虛線標(biāo)注部分為HindⅢ和NocⅠ酶切位點(diǎn)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，在1%的瓊脂糖凝膠電泳中對(duì)目的片段進(jìn)行檢測(cè)，切下目的條帶，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒對(duì)目的片段純化回收，將目的片段連接到pMD19-T載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，利用藍(lán)白斑篩選的方法挑選陽性菌落獲得的重組質(zhì)粒命名為構(gòu)建成pMD19-T：ORF和pMD19-T：Ptrpc。

1.2.2 含有Ptrpc啟動(dòng)子和潮霉素B抗性的表達(dá)載體的構(gòu)建

測(cè)序正確的質(zhì)粒pMD19-T：ORF和PMD19-T：trpc，分別采用SacⅠ和HindⅢ、HindⅢ和NocⅠ酶切回收ORF和Ptrpc。將pCAMBIA1304-35S-GFP-GUS-OCS載體用HindⅢ和NocⅠ雙酶切后回收質(zhì)粒大片段，將回收質(zhì)粒的大片段和回收的啟動(dòng)子小片段經(jīng)T4連接酶相互連接后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過抗生素篩選和酶切鑒定，成功構(gòu)建載體Ptrpc-GFP-GUS-OCS。然后將Ptrpc-GFP-GUS-OCS載體用SacⅠ和HindⅢ雙酶切回收質(zhì)粒大片段，將回收的載體大片段和回收的小片段經(jīng)T4DNA連接酶相互連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過抗生素篩選和酶切鑒定，構(gòu)建棉花黃萎菌表達(dá)載體：1304-P-ORF。

1.2.3 潮霉素B對(duì)野生型大麗輪枝菌的抑制測(cè)定

將野生型棉花黃萎病菌VD-1和VD-278活化，接種于PDA培養(yǎng)基上，在25℃下培養(yǎng)8 d，采用0.5 cm的打孔器，打取菌餅接種在濃度為0、10、20、30、40、50、70、100 μg/mL的潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)培養(yǎng)皿中放置3個(gè)，在25℃下培養(yǎng)8 d，每個(gè)濃度重復(fù)3次，進(jìn)行觀察記錄。

1.2.4 棉花黃萎病菌的純化和培養(yǎng)

將棉花黃萎病菌株VD-1和VD-278接在PDA平板培養(yǎng)基上，在25℃、暗培養(yǎng)10 d后，采用微生物單孢分離的方法對(duì)兩株菌進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2.5 不同農(nóng)桿菌對(duì)新疆棉花黃萎病菌轉(zhuǎn)化效率的影響

構(gòu)建真菌表達(dá)載體1304-P-ORF后，將表達(dá)載體采用電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入兩種農(nóng)桿菌GV3101和AGL-1中，用于棉花黃萎病菌的遺傳轉(zhuǎn)化，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化真菌的方法參照kang等[11]和Mullins 等[12]方法進(jìn)行，在兩種菌轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)時(shí)選用的介質(zhì)為微孔濾膜(上海新亞水溶性微孔濾膜0.45 μm)。在25℃共培養(yǎng)5 d后，在濾膜的表面長(zhǎng)出具有潮霉素B抗性的白色菌落，將白色菌落挑取，轉(zhuǎn)接到含有相同濃度潮霉素B的PDA平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)。分別記錄這兩種農(nóng)桿菌獲得的新疆棉花黃萎病菌陽性轉(zhuǎn)化子的個(gè)數(shù)。

1.2.6 PCR鑒定轉(zhuǎn)化陽性的黃萎病菌

轉(zhuǎn)基因菌株的DNA提取[13]，以提取的轉(zhuǎn)基因菌株的DNA為模板，對(duì)GFP和潮霉素基因進(jìn)行檢測(cè)，GFP所用的正向引物(5'-GACAAACAAAAGAATGGAATCA-3')反義引物：(5'-TCAAGAAGGACCATGTGG-3')；PCR擴(kuò)增潮霉素B檢測(cè)引物的900序列進(jìn)行分子驗(yàn)證，所用的正向引物(5’-GCAGACAGGAACGAGGACAT-3’)反義引物(5’-GCTCCATACAAGCCAACCAC-3’)。

1.2.7 轉(zhuǎn)基因棉花黃萎病菌GUS組織化學(xué)檢測(cè)

挑取少許繼代4～5次長(zhǎng)勢(shì)良好的轉(zhuǎn)基因黃萎病菌菌塊放于Eppendorf管中，加入一定量的GUS染色液，使染色的菌落組織快完全浸沒在液體中，在37℃下保溫染色4～5 h后，在顯微鏡下觀察染色結(jié)果。選取呈現(xiàn)藍(lán)色較深的菌株繼續(xù)培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 含有trpc啟動(dòng)子潮霉素B開放閱讀框和trpc啟動(dòng)子的克隆與真菌表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)質(zhì)粒PUCCATP報(bào)導(dǎo)的基因序列，通過TaqDNA聚合酶擴(kuò)增trpc啟動(dòng)子和開放閱讀框ORF基因。經(jīng)克隆測(cè)序后分析表明，克隆得到的啟動(dòng)子和開放閱讀框的大小和核苷酸序列與原載體上的一致，全長(zhǎng)為480 bp和2 000 bp。首先把trpc啟動(dòng)子連接到植物表達(dá)載體pCAMBIA1304-35S-OCS上。經(jīng)過轉(zhuǎn)化、PCR鑒定和連接載體的雙酶切后，經(jīng)電泳檢測(cè)得到了與預(yù)測(cè)大小相同的目的條帶。然后把連接開放閱讀框ORF的質(zhì)粒和已連接啟動(dòng)子的質(zhì)粒，采用雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑選10個(gè)克隆經(jīng)過夜搖菌提取質(zhì)粒雙酶切后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)獲得預(yù)期大小的目的片段。表明成功地構(gòu)建了真菌表達(dá)載體1304-P-ORF。該載體在真菌中的篩選標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾谺，是含有構(gòu)巢曲霉 trpc啟動(dòng)子，章魚堿合成酶基OCS基因作為終止子。將質(zhì)粒1 304-P-ORF轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101和GAL-1對(duì)轉(zhuǎn)化的菌落通過PCR鑒定，證明目的基因已轉(zhuǎn)入。擴(kuò)繁菌落，用于以下后續(xù)試驗(yàn)的遺傳轉(zhuǎn)化。圖1～3

M：DNA markerⅢ；1：陽性對(duì)照；2、3：質(zhì)粒酶切

M：DNA marker 5K；6：陽性對(duì)照；1-5：質(zhì)粒酶切

2.2 潮霉素對(duì)黃萎病菌菌落生長(zhǎng)速度的影響

將直徑0.5 cm的黃萎病菌菌餅接種于8種不同的潮霉素濃度的PDA培養(yǎng)基中(3次重復(fù))，在25℃的恒溫箱中培養(yǎng)8 d后，測(cè)定每個(gè)濃度下的菌落直徑。研究表明，隨著培養(yǎng)基中潮霉素B的濃度逐漸升高，菌落的生長(zhǎng)速率逐漸減小。當(dāng)潮霉素B的濃度達(dá)到30 μg/mL時(shí)，菌落停止生長(zhǎng)，在這個(gè)濃度下兩種棉花黃萎病菌的生長(zhǎng)完全受到了抑制。表1

圖3 1304-P-ORF載體構(gòu)建示意

表1 不同潮霉素濃度對(duì)黃萎菌病菌落生長(zhǎng)抑制情況

Table 1 The inhibitory effect of differentverticillumdahliacolony growth under the different concentrations of hygromycin

黃萎菌菌株VD-Strain潮霉素濃度Concentrationofhygromycin(μg/mL)0102030405070100VD-12 9±0 021 5±0 060 8±0 030±00±00±00±00±0VD-2782 8±0 021 5±0 030 6±0 070±00±00±00±00±0

2.3 農(nóng)桿菌AGL-1和GV1303對(duì)黃萎病菌轉(zhuǎn)化效率的影響

農(nóng)桿菌的類型直接影響黃萎病菌的轉(zhuǎn)化效率。能夠轉(zhuǎn)化絲狀真菌的農(nóng)桿菌有很多種包括AGL-1、EHA105、LBA1100、LBA4401、GV3101等，它們之間對(duì)轉(zhuǎn)化受體的毒性有著明顯地差異。一般而言，農(nóng)桿菌對(duì)轉(zhuǎn)化的受體材料具有一定的選擇性，農(nóng)桿菌毒性越強(qiáng)，對(duì)材料中T-DNA的插入效率也越高，但對(duì)受體材料的毒害越強(qiáng)，在進(jìn)行篩選時(shí)，受體材料的成活率也越低，從而對(duì)受體的轉(zhuǎn)化效率降低。應(yīng)用潮霉素B和羧芐青霉素篩選時(shí)，農(nóng)桿菌的抗性越強(qiáng)，最終農(nóng)桿菌斑干擾轉(zhuǎn)化子的純度和增加篩選轉(zhuǎn)化子的難度。研究表明，農(nóng)桿菌菌株AGL-1對(duì)兩種非落葉型新疆棉花黃萎病菌的轉(zhuǎn)化效率顯著高于農(nóng)桿菌菌株GV3101。圖4

2.4 轉(zhuǎn)基因黃萎病菌的分子鑒定

以轉(zhuǎn)接4～5代的陽性黃萎病菌VD-1和VD-278遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，以GFP和潮霉素B基因特異性引物進(jìn)行PCR分子檢測(cè)，結(jié)果表明：4個(gè)轉(zhuǎn)化子中均擴(kuò)增出擴(kuò)增出243 bp左右的特異性GFP基因片段以及900 bp的特異性潮霉素B基因片段，野生菌株中沒有擴(kuò)增出相應(yīng)的基因片段，證明GFP-GUS融合基因和潮霉素B抗性基因已整合到轉(zhuǎn)化子基因組中。將轉(zhuǎn)化子繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，選取部分菌落的菌絲和孢子進(jìn)行GUS染色，研究表明，GFP-GUS融合基因已經(jīng)被整合到棉花黃萎病菌的基因組中，并能夠在構(gòu)巢曲霉色氨酸啟動(dòng)子(Ptrpc)調(diào)控下正常表達(dá)。圖5

M:DNA marker 5K；1、2、4、5：潮霉素B基因；5、7-9：GFP基因PCR結(jié)果；3：未轉(zhuǎn)化菌株；a、b未轉(zhuǎn)化菌絲和孢子染色結(jié)果；c、d轉(zhuǎn)基因孢子和菌絲染色結(jié)果

3 討 論

棉花黃萎病菌(Verticilliumdahliae)不能識(shí)別CaMV35S啟動(dòng)子，植物表達(dá)載體不能直接用于黃萎病菌的遺傳轉(zhuǎn)化[14]。目前，常見的真菌啟動(dòng)子有構(gòu)巢曲霉的 GPD 啟動(dòng)子、trpc啟動(dòng)子和偃麥草核菌(PyrenopHora tritici-repentis)的 ToxA 啟動(dòng)子等[15]。實(shí)驗(yàn)中采用trpc啟動(dòng)子，NOS終止子、HygB為篩選標(biāo)記、綠色熒光蛋白GFP和GUS為報(bào)告基因，以植物表達(dá)載體pCAMBIA1304為框架構(gòu)建成真菌表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法把GFP-GUS和抗性篩選基因HygB插入到黃萎菌基因組中，并在黃萎菌中成功的表達(dá)。表明構(gòu)巢曲霉色氨酸啟動(dòng)子Ptrpc能被黃萎菌所識(shí)別。

棉花黃萎病菌為一種土傳真菌病害，侵染植物主要從根部或傷口進(jìn)入體內(nèi)，病原菌在植物體內(nèi)的移動(dòng)主要是依靠植物的水分運(yùn)輸系統(tǒng)，孢子隨著植物水分和養(yǎng)分的運(yùn)輸，移動(dòng)到植物的每個(gè)組織中。迄今為止，國內(nèi)外對(duì)V.dahliae致病性研究多采用紙缽撕底蘸根法、針刺接種法或其它相類似的方法[16-19]，這些方法只能從棉花發(fā)病的表型上判斷黃萎病菌對(duì)植株的致病性，不能從機(jī)理上解釋棉花發(fā)病的原因。從生菜、馬鈴薯、棉花中分離的黃萎病菌已經(jīng)被成功的用熒光所標(biāo)記[19]。新疆棉花黃萎病菌屬于大麗輪枝菌，在不同地區(qū)已經(jīng)產(chǎn)生了許多生理小種，研究使用的非落葉型菌株VD-1和VD-278是近期從新疆北疆棉花生產(chǎn)病區(qū)分離并鑒定的菌株，VD-1為菌核型，VD-278為中間型，可作為新疆北疆棉花抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)菌株之一。高興喜等[20]進(jìn)行了對(duì)木霉用農(nóng)桿堿性菌株AGL-1遺傳轉(zhuǎn)化成功，而章魚堿性農(nóng)桿菌LBA4404卻轉(zhuǎn)化失敗。Eynck等采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將 pGV04 載體成功地轉(zhuǎn)入大麗輪枝菌，獲得了穩(wěn)定表達(dá)GFP的大量轉(zhuǎn)化子[21]。在多數(shù)前人研究大麗輪枝菌主要針對(duì)落葉型黃萎病菌，對(duì)非落葉型黃萎病菌研究較少。因此，研究通過用農(nóng)桿菌AGL-1和GV3101介導(dǎo)的孢子轉(zhuǎn)化體系將綠色熒光蛋白GFP和GUS基因轉(zhuǎn)入新疆非落葉型黃萎病菌VD-1和VD-278，成功獲得了陽性轉(zhuǎn)化子，發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌AGL-1對(duì)新疆非落葉型黃萎病菌的轉(zhuǎn)化效率顯著高于GV3101。這表明農(nóng)桿菌的毒性和其轉(zhuǎn)化寄主之間的相互識(shí)別和感應(yīng)，可以在提高轉(zhuǎn)化效率時(shí)選擇農(nóng)桿菌的類型。

研究構(gòu)建的綠色熒光標(biāo)記載體1304-P-ORF通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，其T-DNA區(qū)可穩(wěn)定整合到新疆棉花黃萎病菌菌株VD-1和VD-278的基因組中，挑選GFP-GUS表達(dá)量高與野生菌株致病性相似的、并能進(jìn)行性穩(wěn)定的遺傳表達(dá)，通過GUS組織染色，被標(biāo)記菌株的菌絲體和分生孢子呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色。轉(zhuǎn)GFP-GUS基因的黃萎病菌的獲得為深入研究棉花黃萎病入侵的機(jī)理奠定了基礎(chǔ)，能夠較為直觀的了解新疆非落葉型黃萎菌的致病過程，為黃萎病菌在大田防治中提供一個(gè)理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

構(gòu)建了含有GFP-GUS融合基因的真菌表達(dá)載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入兩株致病性不同的非落葉型黃萎病菌，陽性轉(zhuǎn)化子的孢子和菌絲，通過GUS組織化學(xué)染色，都能表現(xiàn)出藍(lán)色，表明GUS-GFP融合基因成功的整合到新疆棉花黃萎病菌的基因組中，并能穩(wěn)定的遺傳表達(dá)。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化兩株非落葉型的新疆黃萎病菌時(shí)，選用啟動(dòng)子的表達(dá)、篩選抗生素的濃度、農(nóng)桿菌的類型等諸多因素影響非落葉型黃萎病菌。弱毒菌株一般都為非落葉型黃萎病菌，現(xiàn)在在病原菌中又出現(xiàn)了中間型的菌株，在弱毒株轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)毒株的過程中，中間型的菌株成為一個(gè)過渡類型，其轉(zhuǎn)變過程是多方面因素決定的，但是轉(zhuǎn)變機(jī)理未知，通過轉(zhuǎn)基因的非落葉型黃萎病菌能直觀的了解菌株之間的轉(zhuǎn)化過程。

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Fund project:Ministry of Agriculture transgenic major projectsenvironmental safety assessment of transgenic cotton technology(2016ZX08011)

dGFP-GUSGenes Tagged ofVerticilliumDahliaeof Cotton in Xinjiang

KONG De-zhen, HUA Dong-lai ,WANG Xiu-zhen, LIU Bu-cang, ZHU Jian-bo, WANG Ai-ying

(CollegeofLifeScience,ShiheziUniversity,ShiheziXinjiang832000,China)

【Objective】 In order to analyze theVerticilliumdahliaeingression mechanism.【Method】A novel vector 1304-P-ORF was constructed from the plasmids of PUCCATPH, pCAMBIA1304, which includedGFP-GUSgene driven by the trpc promoter, which induced wild-type agrobacterium tumefaciens AGL-1 and GV3101.Vector 1304-P-ORF was transformed intoVerticilliumdahliaestrain VD-1 and VD-278 by agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (ATMT).【Result】The result showed that screening concentration of hygromycin was 30 mg/ml, and agrobacterium AGL-1 to conversion efficiency was 40% higher than GV1301 toVerticilliumdahliae. 2 independent strains of T1generation of transgenic VD-1 and 6 independent strains of T1generation VD-278 were screened on PDA medium containing hygromycin.GUSenzyme could be detected in spore and hyphae ofVerticilliumdahliaeby tissue staining.GFPand hygromycin genes were confirmed by PCR amplification by using DNA of transgenic strains, which indicated thatGFP-GUSand hygromycin genes had been successfully transformed into transgenic strains.【Conclusion】The study laid foundations for further using ofGFP-GUSgene and genetic transformation system of XinjianngVerticilliumdahliae, which will benefit a lot in further study ofVerticilliumdahliaeinfection of cotton.

Ptrpc promoter; ATMT;GFP-GUS; cottonVerticilliumdahliae

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.01.001

2015-05-08

農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)“轉(zhuǎn)基因棉花環(huán)境安全評(píng)價(jià)技術(shù)”(2016ZX08011)

孔德真(1987-)，男，甘肅臨夏人，碩士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境生物技術(shù)，(E-mail)kongdezhen1746@163.com

王愛英(1972-)，女，山東成武人，副研究員，研究方向?yàn)榄h(huán)境生物技術(shù)以及安全性評(píng)價(jià)，(E-mail)way-sh@126.com

S435.62

A

1001-4330(2016)01-0001-08