金玉蘭， 李婉麗， 李松， 李璽洋， 楊陽， 陳秋虹， 孫群*

(1. 四川大學輕紡與食品學院，成都610064； 2. 四川大學生命科學學院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，成都610064； 3. 廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心，南寧530022)

ISSR分子標記鑒定巴馬香豬

金玉蘭1， 李婉麗2， 李松2， 李璽洋2， 楊陽2， 陳秋虹3， 孫群2*

(1. 四川大學輕紡與食品學院，成都610064； 2. 四川大學生命科學學院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，成都610064； 3. 廣西壯族自治區(qū)分析測試研究中心，南寧530022)

結合線粒體基因和ISSR兩種DNA分子標記技術對巴馬香豬、環(huán)江香豬、藏豬、巴馬本地土豬和成華豬進行種類鑒定。研究從55條ISSR引物中篩選出1條帶型清晰、重復性好的引物53可以鑒別巴馬香豬、環(huán)江香豬、藏豬、巴馬本地土豬和成華豬。巴馬香豬與藏豬線粒體基因分析結果表明，藏豬具有特異的短串聯(lián)重復片段“TGTGTACGCA”，可用于進一步鑒別巴馬香豬與藏豬。ISSR分子標記與聚類分析結果顯示，引物53可以鑒別5種豬并成功鑒定了一份未知種類的巴馬產(chǎn)豬肉樣品。結果表明，ISSR分子標記與線粒體基因聯(lián)合分析可以快速準確鑒別巴馬香豬、環(huán)江香豬、藏豬、巴馬本地土豬和成華豬。

巴馬香豬；鑒定；線粒體基因；ISSR

我國是世界上豬品種資源最豐富的國家之一，擁有70多個地方豬品種。我國地方豬品種具有繁殖性能高、肉質好、耐粗飼、抗病力強等優(yōu)點，但由于受國外引進豬品種的競爭，地方豬品種的飼養(yǎng)量已經(jīng)大大減少，甚至有許多地方豬品種已處于瀕危狀態(tài)(歐陽解秀，王立賢，2013)。巴馬香豬起源于廣西壯族自治區(qū)巴馬瑤族自治縣，是國家級畜禽品種資源保護豬品種之一，屬于封閉近交繁殖品種，遺傳性能穩(wěn)定(張蓮英等，2011)。巴馬香豬具有肉質細嫩、清香可口、風味獨特等優(yōu)良特點，是制作烤乳豬、臘全豬和腌肉的上乘原料，頗受消費者喜愛。然而市場上銷售的巴馬香豬肉制品真?zhèn)坞y辨，目前對巴馬香豬的鑒別主要以外觀的描述為主，尚缺乏有效的基因檢測手段。為了維持巴馬香豬市場秩序，促進其產(chǎn)業(yè)發(fā)展，亟需探索一種快捷、準確地鑒別巴馬香豬肉制品真?zhèn)蔚姆肿訕擞浖夹g。

DNA分子標記技術是繼形態(tài)學、細胞學、生化等遺傳標記技術后能夠穩(wěn)定可靠反映物種遺傳特點的最新分子標記技術(王春俠，仇敬運，2007)。與核DNA相比，線粒體DNA具有結構簡單、嚴格遵守母系遺傳方式、進化速度快等特點，現(xiàn)已在動物的系統(tǒng)發(fā)生、物種鑒定和種群結構等研究中得到廣泛應用(劉超等，2003；張俊麗等，2010；李楠楠等，2012)。ISSR(inter-simple sequence repeat)分子標記的基本原理是以SSR(simple sequence repeat)的3’端或5’端錨定1～4個隨機堿基為引物進行PCR擴增，特異地擴增出具有反向排序的微衛(wèi)星區(qū)域間的DNA序列(Zietkiewiczetal.，1994)，具有成本較低、操作簡單、良好的穩(wěn)定性、重復性、豐富的多態(tài)性以及能較好地反映物種的遺傳結構和遺傳多樣性變化等特點。ISSR技術在動物遺傳學中主要應用于遺傳多樣性、資源鑒定與分類、親緣關系與系統(tǒng)發(fā)育的構建以及動物標記輔助選育等方面(Nagornyuk & Glazko，2007；韓曉磊等，2010；Zamani，2011)。Yang等(2013)在對5種貂(standard-pitchy mink，sapphire mink，brown mink，black mink，white mink)的基因多樣性進行ISSR分析時發(fā)現(xiàn)，5種貂具有較高的基因多樣性，UPGMA聚類分析將5種貂分為2組，其中standard-pitchy mink單獨聚為一類，其他4種聚為一類，說明品種間遺傳分化程度低。Maltagliati等(2006)用ISSR方法成功鑒定了2份未知屬于Valenciahispanica樣品。何榆林等(2014)利用ISSR分子標記成功地鑒定了陸川豬及其肉制品。因此ISSR分子標記是一種有效的種質資源鑒定方法。

目前，對巴馬香豬的研究主要集中在遺傳多樣性和親緣關系(陳丙波等，2003)；另一方面，用ISSR分子標記鑒定哺乳動物肉制品源性的研究不多，特別是對巴馬香豬肉源性真?zhèn)蔚蔫b別研究更少。巴馬香豬與巴馬本地土豬和環(huán)江香豬親緣關系較近，肉源真?zhèn)尾灰讌^(qū)分，本研究采用線粒體基因和ISSR兩種DNA分子標記建立一種可靠、快速鑒別巴馬香豬與巴馬本地土豬和環(huán)江香豬的方法，同時將該方法推廣到成華豬和藏豬進行驗證。研究結果對于巴馬香豬品牌的保護和市場的規(guī)范具有重要意義，也對巴馬香豬等地方豬品種的資源保護提供重要的遺傳依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉樣品分類及數(shù)量(表1)：巴馬香豬(n=5)，環(huán)江香豬(n=3)，巴馬本地土豬(n=3)，藏豬(n=2)，成華豬(n=3)，1份巴馬產(chǎn)豬肉樣。每種樣品均取自原產(chǎn)地及純種養(yǎng)殖場，可以保證樣品的純種性和真實性。

實驗所用55個ISSR引物(表2)：其中引物1～34來自何榆林等(2014)，引物35～43來自Maltagliati等(2006)，引物44～55來自Yang等(2013)。自行設計了擴增巴馬香豬與其他豬種線粒體差異基因位點的引物A：上游引物5’-AACAAGGTGCTATTC-AGTC-3’，下游引物5’-TCTTTAGGATCTGGAGGG-3’。

表1 實驗樣品種類、編號及來源Table 1 Details of the pig breeds tested in the study

表2 ISSR引物序列Table 2 ISSR primer sequence

1.2 儀器與設備

PCR儀(Bio-Rad PTC-200)，瓊脂糖凝膠電泳儀(Bio-Rad Powerpace Basic)，凝膠成像分析儀(Universal Hood Ⅱ，Bio-Rad)，超微量蛋白核酸分析儀(BioDrop μLite)。

1.3 方法

1.3.1 樣品DNA提取及純度檢驗 稱取生鮮豬肉樣品0.5 g，液氮研磨，按照說明書提取DNA(天根血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit)。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并通過超微量蛋白核酸分析儀檢測所提取的DNA質量以及OD260nm和OD280nm濃度，測定DNA純度OD260nm/OD280nm。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR 反應及產(chǎn)物檢測 反應體系：模板DNA 1.5 μL、引物1 μL、2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、ddH2O補足至25 μL。

反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，退火45 s(引物A的退火溫度為55 ℃，引物53的退火溫度為51 ℃)，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR反應產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。線粒體基因分析中的PCR產(chǎn)物送Invitrogen公司進行直接測序。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析 ISSR電泳成像后，利用Quantity One對擴增片段進行UPGMA聚類分析，并比較個體間的相似性。

2 結果

2.1 ISSR分子標記鑒別巴馬香豬結果與分析

2.1.1 ISSR分子標記結果 實驗對5種豬肉全基因組進行了PCR擴增和帶型分析，在55個ISSR引物中篩選出了1個多態(tài)性好、條帶清晰的引物——引物53：5’-(ATG)6-3’，可用于區(qū)別巴馬香豬、環(huán)江香豬、巴馬本地土豬、藏豬和成華豬。如圖1所示，引物53在環(huán)江香豬(B1、B2、B3)和藏豬(D1、D2)的樣品中擴增獲得1條1 300 bp左右的特異性條帶，而巴馬香豬沒有該條帶。同樣地，該引物在巴馬本地土豬(C1、C2、C3)和成華豬(E1、E2、E3)中能夠擴增出1條700～800 bp的特異性條帶，而巴馬香豬沒有此條帶。說明此引物能夠將巴馬香豬與環(huán)江香豬、巴馬本地土豬、藏豬和成華豬區(qū)分開。ISSR分子標記結果顯示，未知肉樣C’的條帶與巴馬香豬的條帶一致，因此可以初步判定C’為巴馬香豬樣品。

圖1 引物53擴增出的5個品種豬肉的電泳圖譜Fig. 1 Electrophoresis fingerprinting of amplification products from pork of five different breeds

2.1.2 UPGMA聚類分析 為了進一步了解巴馬香豬和其他4種豬的親緣關系，對巴馬香豬、環(huán)江香豬、巴馬本地土豬、藏豬和成華豬進行聚類分析(圖2)。UPGMA結果顯示，5個豬種分為2個類群，成華豬和巴馬本地土豬為一個類群，藏豬、環(huán)江香豬和巴馬香豬為一個類群。根據(jù)《中國豬品種志》(《中國家畜家禽品種志》編委會，《中國豬品種志》編寫組，1986)，巴馬香豬和環(huán)江香豬同屬于華南型香豬，藏豬屬于高原型地方豬，均屬于小型豬。說明通過UPGMA聚類能很好地區(qū)分不同品種的豬。在小型豬類群中，巴馬香豬聚為一類，而藏豬和環(huán)江香豬聚為一類?？梢钥闯霭婉R香豬因其特殊的封閉式近親繁殖方式使得其分化程度低，從發(fā)育樹中可以看到未鑒別的C’與巴馬香豬聚為一類，與上述的指紋圖譜中得到的結果一致，可以判定C’為巴馬香豬肉樣，也說明引物53能夠有效地鑒別巴馬香豬與其他4種豬。

2.2 用線粒體基因區(qū)別巴馬香豬和藏豬

ISSR分子標記的PCR擴增電泳圖譜中，與巴馬香豬相比，藏豬的1 300 bp左右的特異性條帶比較模糊。為了進一步鑒別巴馬香豬與藏豬，將NCBI數(shù)據(jù)庫中巴馬香豬和藏豬線粒體基因進行初步比對，與巴馬香豬相比，藏豬在簡短重復序列的重復數(shù)量上有差異。針對該差異設計引物擴增線粒體基因組的差異位點，擴增的片段為線粒體基因組第663至第1 489位堿基，片段大小約800 bp。擴增產(chǎn)物由Invitrogen公司直接測序比對，結果如表3所示。研究發(fā)現(xiàn)，在擴增的區(qū)域中，與巴馬香豬比較，藏豬具有特異的短串聯(lián)重復序列“TGTGTACGCA”(圖3)。因此，可以利用此差異位點區(qū)分藏豬與巴馬香豬。

圖2 ISSR分析中5種豬肉的UPGMA聚類分析Fig. 2 Cluster analysis of the ISSR band patterns of pork of different breed with Quantity One software表3 線粒體基因組差異位點Table 3 Loci difference in mtDNA

樣品重復片段位置長度/bp重復數(shù)重復序列A1444～6971025CGTGTACGCAA2457～7191026CGTGTACGCAA3455～6971024CGTGTACGCAA4456～7221026CGTGTACGCAA5455～7111025CGTGTACGCAD1587～645106TGTGTACGCA456～7191020CGTGTACGCAD2586～646106TGTGTACGCA457～7001018CGTGTACGCA

3 討論

巴馬香豬為珍稀的地方優(yōu)勢品種豬，2005年國家質量監(jiān)督檢疫總局發(fā)布公告，宣布巴馬香豬為國家地理標志產(chǎn)品并實施保護。常用的屠宰指標和失水率、色澤、剪切力等肉質指標因受飼養(yǎng)環(huán)境和生物

個體差異不能可靠地鑒定巴馬香豬品種。DNA分子標記技術可以反映物種分子水平上的差異，而現(xiàn)有的對巴馬香豬的研究主要集中在遺傳多態(tài)性的分析。吳豐春等(2000)對巴馬小型豬群體結構進行的隨機擴增多態(tài)DNA分析顯示，廣西巴馬小型豬個體間相似系數(shù)為0.78～0.96，其多態(tài)性頻率僅為27.7%，顯著低于一般品種豬的水平。說明巴馬小型豬個體的選育程度和個體相似程度較高，具有較好的遺傳一致性和遺傳穩(wěn)定性。劉中祿等(2001)應用PCR-RFLP、PCR-SSCP和PCR直接測序對中國3種實驗用小型豬(西雙版納近交系小耳豬、廣西巴馬小型豬和貴州小型豬)線粒體DNA D-loop多態(tài)性分析觀察單鏈構象多態(tài)性和序列多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)3種豬之間mtDNA多態(tài)性貧乏，說明其親緣關系近且母系起源進化上具有一致性，因此上述方法不能作為3種實驗用小型豬品種品系的鑒定依據(jù)。

DNA分子標記技術中，ISSR分子標記已被證明是分析基因多樣性的一種高效、經(jīng)濟的方式，現(xiàn)已廣泛應用于種類鑒定和遺傳關系分析。ISSR分子標記在種類鑒定方面與其在植物研究中的應用相比，在動物中特別是哺乳動物的研究中還處于起步階段(林杰君等，2012)。何榆林等(2014)利用ISSR分子標記鑒定陸川豬及其肉制品中篩選出3個ISSR引物能夠鑒別陸川豬和巴馬香豬，與本實驗有相似之處，但沒有進一步研究巴馬香豬與其他豬品種的鑒別方法。本研究選擇了不同的小型豬樣本(巴馬香豬、環(huán)江香豬、藏豬)和普通豬樣本(巴馬本地土豬和成華豬)，從55條ISSR引物中成功篩選出1條有效引物能夠鑒別巴馬香豬和其他4種豬。通過聚類分析發(fā)現(xiàn)，普通豬樣本聚為一類，而小型豬樣本聚為一類，因此UPGMA聚類分析能夠有效地驗證ISSR擴增結果。綜上所述，結合ISSR分子標記和線粒體基因分析可快速準確地鑒定巴馬香豬、環(huán)江香豬、藏豬、巴馬本地土豬和成華豬。研究結果對保障巴馬香豬品種純正，規(guī)范巴馬香豬市場和推動巴馬香豬產(chǎn)業(yè)化進程有重要意義，同時有助于巴馬香豬養(yǎng)殖開發(fā)標準化體系的建立。ISSR分子標記成功鑒別巴馬香豬有利于調動地方保種的積極性，并為我國珍稀豬品種遺傳資源的保護工作提供參考。

圖3 巴馬香豬與藏豬線粒體基因短串聯(lián)重復序列比較Fig. 3 Comparison of tandem repeat sequence between Bama miniature pig and Tibetan pig

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Species Authentication of Bama Miniature Pig through Inter-simple Sequence Repeat

JIN Yulan1， LI Wanli2， LI Song2， LI Xiyang2， YANG Yang2， CHEN Qiuhong3， SUN Qun2*

(1. College of Light Industry， Textile and Food Engineering， Sichuan University， Chengdu 610064，China;2. College of Life Sciences， Key Laboratory of Bio-resource and Eco-environment of Ministry of Education， Sichuan University，Chengdu 610064， China; 3. Guangxi Zhuang Autonomous Region for Analysis and Test Research， Nanning 530022， China)

In this study， species identification of Bama miniature pig was carried out by DNA fingerprinting of meats from Tibetan pig， Huanjiang miniature pig， Bama native pig， and Chenghua pig through inter-simple sequence repeat (ISSR) and mitochondrial DNA (mtDNA) analysis. One clear and repeatable primer pair named No. 53 was selected from 55 primers， which successfully separated Bama miniature pig from the other four pigs. To further differentiate Bama miniature pig and Tibetan pig， specific tandem repeat sequence of Tibetan pig ‘TGTGTACGCA’ was found out in the mtDNA. According to the results of ISSR and UPGMA cluster analysis， primer No. 53 was able to attribute to the identification of the five different pigs and one unknown pig. Therefore， ISSR coupled with UPGMA and mtDNA analysis represented an effective tool in species identification.

Bama miniature pig; identification; mitochondrial gene; inter-simple sequence repeat (ISSR)

10.11984/j.issn.1000-7083.20160017

2016-01-11 接受日期：2016-04-05 基金項目：廣西科學研究與技術開發(fā)計劃項目(12118011-2B)

金玉蘭(1992—)， 碩士， 主要研究領域為食品科學， E-mail:jin199271@126.com

*通信作者Corresponding author， 女， 教授， 博士， 研究方向為食品安全， E-mail:qunsun@scu.edu.cn

Q959.8； Q78

A

1000-7083(2016)04-0569-05