江南， 許曉燕， 魏巍， 余夢瑤， 羅霞

(四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，中藥細胞與分子生物學(xué)實驗室，成都610041)

靈芝提取液延緩皮膚衰老的實驗研究

江南， 許曉燕， 魏巍， 余夢瑤， 羅霞*

(四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，中藥細胞與分子生物學(xué)實驗室，成都610041)

目的 觀察靈芝提取液延緩D-半乳糖致亞急性衰老小鼠皮膚衰老的作用。方法 以D-半乳糖致亞急性衰老小鼠為模型，同時背部涂抹靈芝提取液，治療42 d后，測定小鼠背部皮膚組織勻漿中超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量、脂褐質(zhì)(LF)含量、羥脯氨酸含量。結(jié)果 靈芝提取液低、中、高劑量均能不同程度提高皮膚中SOD活力，降低MDA含量，減少LF含量，提高小鼠皮膚中羥脯氨酸的含量(P<0.01，P<0.05)，且具有明顯的量效關(guān)系。結(jié)論 靈芝提取液具有延緩D-半乳糖所致衰老小鼠的皮膚衰老作用。

靈芝提取液；D-半乳糖；皮膚衰老；超氧化物歧化酶；丙二醛；脂褐質(zhì)；膠原蛋白

衰老是生物在生命過程中機體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能逐漸衰退的總現(xiàn)象，其發(fā)生和發(fā)展是多因素誘發(fā)和多層次變化的綜合結(jié)果(Kagan，2002)。皮膚位于體表，是人體最大的器官，也是機體最早顯現(xiàn)機體衰老的組織。皮膚衰老不僅影響容顏，還與許多皮膚病有病因?qū)W聯(lián)系，因此預(yù)防和延緩皮膚衰老已成為醫(yī)學(xué)和美容的研究熱點(Frolkins，1999)。

靈芝Ganodermalucidum是珍貴的藥用真菌，屬于擔(dān)子菌綱Basidiomycetes 多孔菌目Polyporales，在我國有著悠久的使用歷史。本實驗室前期的研究工作獲得了四川省農(nóng)作物品種審定的藥用植物品種“宇澤靈芝”(審定編號：2015008)，該品種具有明顯的抗氧化、清除自由基的功效。本文針對由“宇澤靈芝”提取制備獲得的化妝品用靈芝提取液(Q/SACMS.01-2015)，探討其在延緩皮膚衰老方面的作用，為靈芝化妝品的進一步應(yīng)用開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 化妝品用靈芝提取液，四川省中醫(yī)藥科學(xué)院提供(Q/SACMS.01-2015，批號：20150301)。

1.1.2 試驗動物 雌性KM小鼠70只，體質(zhì)量18～22 g，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實驗動物中心提供[實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(川)2013-19]。

1.1.3 藥品及試劑 D-半乳糖(成都市科龍化工試劑廠，批號：2015070501)；維生素E(湯臣倍健，批號：20141204E)；總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒(南京建成生物工程公司，批號：20150627)；丙二醛(MDA)測試盒(南京建成生物工程公司，批號：20150624)；羥脯氨酸測試盒(南京建成生物工程公司，批號：20150519)；脂褐質(zhì)(LF)ELISA檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物，批號：20150701A)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組、造模及給藥 60只KM小鼠隨機分為6組，每組10只：正常衰老組、衰老模型組、陽性藥(維E)組、靈芝低劑量組、靈芝中劑量組、靈芝高劑量組。適應(yīng)性飼養(yǎng)后進行實驗。除正常衰老組每日頸背部皮下注射0.3 mL生理鹽水外，其余各組每日頸背部皮下注射5%D-半乳糖0.3 mL，連續(xù)注射給藥42 d(丁玉琴，周紅梅，2005)。實驗前用脫毛劑將小鼠背部雙肩胛之間皮膚脫毛3 cm×3 cm。正常衰老組、衰老模型組每日背部涂抹生理鹽水20 μL，陽性藥(維E)組每日背部涂抹20%維E 50 μL，靈芝低、中、高劑量組每日背部分別以10%、20%、40%濃度的靈芝提取液50 μL涂抹。涂抹后，保鮮膜保護0.5 h，連續(xù)涂抹42 d。

1.2.2 標本取材方法 使用高瑞英等(2010)的方法，實驗第43天頸椎脫臼處死各組小鼠，同時處死6～8周齡青年小鼠10只，均取背部脫毛后皮膚組織塊約0.5 g，經(jīng)預(yù)冷生理鹽水漂洗，除去皮下脂肪和其他結(jié)締組織，濾紙拭干，稱定質(zhì)量，皮膚組織塊剪碎后放入勻漿管中，加入9倍質(zhì)量的預(yù)冷生理鹽水制成10%組織勻漿(在冰水中進行)備用。

1.2.3 皮膚超氧化物歧化酶活力、MDA含量測定參照T-SOD試劑盒說明書測定超氧化物歧化酶(SOD)活力。參照MDA試劑盒說明書測定MDA含量。

1.2.4 皮膚LF含量測定 參照LF試劑盒說明書測定LF含量。

1.2.5 皮膚羥脯氨酸、膠原蛋白含量的測定 取各組小鼠背部皮膚組織，去除皮下脂肪和結(jié)締組織后，乙醚干燥后，稱取80～100 mg組織塊，剪碎，加6 mol·L-1HCL 1 mL，放入磨口試管中加蓋，95 ℃水解5 h，參照羥脯氨酸試劑盒說明書測定羥脯氨酸含量。樣品中膠原蛋白的含量用膠原蛋白中羥脯氨酸含量除以13%進行計算(邵鄰相，趙鐵軍，2003)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗的詳細數(shù)據(jù)用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，組間比較用單因素方差分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 靈芝提取液對小鼠皮膚中SOD活力、MDA含量、LF含量的影響

與青年小鼠組比較，正常衰老組小鼠皮膚中的MDA含量升高(P<0.05)，LF含量增加(P<0.01)，說明隨著正常的生長發(fā)育，小鼠皮膚出現(xiàn)了老化現(xiàn)象。而與正常衰老組比較，D-半乳糖造成的衰老模型小鼠皮膚中的SOD活力明顯下降(P<0.01)，MDA含量顯著升高(P<0.01)，LF含量提高(P<0.05)，說明通過連續(xù)大劑量給小鼠注射D-半乳糖，造成了穩(wěn)定的衰老模型。在此衰老模型基礎(chǔ)上，給予小鼠陽性藥(維E)和不同劑量的靈芝提取液涂抹，均能不同程度提高皮膚中的SOD活力，降低MDA含量，減少LF含量(P<0.01，P<0.05)，且靈芝提取液具有明顯的量效關(guān)系(表1)。

表1 靈芝提取液對小鼠皮膚中超氧化物歧化酶活力、丙二醛含量、 脂褐質(zhì)含量的影響Table 1 Effect of Ganoderma lucidum extract on the activity of superoxyde dismutase, the content of malondialdehyde and lipofuscin in skin tissue of mice

注： 與正常衰老組比較，*P<0.05，**P<0.01; 與衰老模型組比較，#P<0.05，# #P<0.01; 下同。

Notes： compared with control group，*P<0.05，**P<0.01; compared with model group，#P<0.05，##P<0.01; the same below.

2.2 靈芝提取液對小鼠皮膚中羥脯氨酸、膠原蛋白含量的影響

與青年小鼠組比較，正常衰老組小鼠皮膚中的羥脯氨酸、膠原蛋白含量顯著減少(P<0.01)，說明隨著正常生長，小鼠皮膚出現(xiàn)老化現(xiàn)象；而與正常衰老小鼠比較，以D-半乳糖造成的衰老模型小鼠，皮膚中的膠原蛋白含量明顯下降(P<0.05)。在此基礎(chǔ)上，陽性藥(維E)和高劑量靈芝提取液的涂抹均能提高小鼠皮膚中膠原蛋白的含量(P<0.05)(表2)。

表2 靈芝提取液對衰老小鼠皮膚中羥脯氨酸、膠原蛋白含量的影響Table 2 Effect of Ganoderma lucidum extract on the content of hydroxyproline and vollagen in skin tissue of mice

3 討論

皮膚衰老的特征是失去彈性和柔軟性，出現(xiàn)皺紋、干燥角化、色素過量沉積等。自由基學(xué)說(陳瑾，李榮亨，2004)認為，皮膚衰老是由于年齡增加，體內(nèi)如SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase)等抗氧化酶活性降低，清除自由基能力下降，自由基在體內(nèi)大量堆積，引起脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物MDA增多。MDA與體內(nèi)一些生物大分子交聯(lián)形成Schiff堿，即LF。LF難溶于水，不易被排除，大量堆積于皮膚細胞內(nèi)出現(xiàn)老年斑。因此，MDA和LF可作為皮膚衰老的評價指標。皮膚是否保持光滑細嫩則主要取決于真皮下的膠原蛋白含量。羥脯氨酸是膠原蛋白的特有氨基酸之一，約占膠原蛋白全部氨基酸殘基的13.4%，是維持膠原蛋白纖維穩(wěn)定性的重要單元，通常羥脯氨酸的含量隨著皮膚衰老而降低，是反映膠原蛋白纖維變化的敏感生化指標。隨著衰老的發(fā)生發(fā)展，自由基大量增加可引起膠原蛋白交聯(lián)、老化，皮膚失去彈性。

本試驗采用D-半乳糖所致的衰老小鼠模型，試驗結(jié)果證實，模型小鼠皮膚中的SOD活力明顯下降(P<0.01)，MDA含量顯著升高(P<0.01)，LF含量增加(P<0.05)，皮膚中的膠原蛋白含量明顯下降(P<0.05)，說明通過連續(xù)大劑量給小鼠注射D-半乳糖，造成了穩(wěn)定的衰老小鼠模型。通過連續(xù)涂抹靈芝提取液與陽性藥(維E)，均能不同程度提高皮膚中SOD活力，降低MDA含量，減少LF含量(P<0.01，P<0.05)，提高皮膚組織中膠原蛋白含量(P<0.05)，說明靈芝提取液有較強的抗氧化和清除自由基作用，具有營養(yǎng)皮膚、延緩皮膚衰老的功效。

隨著全球人口老齡化趨勢的發(fā)展，抗皮膚衰老化妝品深受產(chǎn)品開發(fā)者的重視和消費者的歡迎。添加中藥材提取物的抗皮膚衰老化妝品具有功效持久穩(wěn)定、作用溫和、副作用小等優(yōu)點(胡侃等，2008)，因此，研究開發(fā)含有中藥材提取物的抗皮膚衰老化妝品成為當(dāng)前國內(nèi)外化妝品研發(fā)的熱點之一。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載靈芝可“久食輕身不老，延年神仙”，中醫(yī)長期以來將其作為滋補強壯、固本扶正的名貴藥材，人體試驗研究發(fā)現(xiàn)，靈芝具有明顯抗衰老、抗氧化作用(王英，2003)。在國家公布的《已使用化妝品原料名稱目錄(2015版)》中，靈芝也位列其中。本研究以獲得新品種審定的“宇澤靈芝”這一特色菌類藥材資源為對象，通過分離提取獲得具有抗衰作用的提取物，為開發(fā)抗衰化妝品新產(chǎn)品打下堅實的基礎(chǔ)。而“宇澤靈芝”提取物中的主要抗衰成分及其作用機制則有待進一步研究。

陳瑾， 李榮亨. 2004. 衰老的自由基機制[J]. 中國老年學(xué)雜志， 24(7)： 677-679.

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GanodermalucidumExtract can Resist Skin Tissue Senility

JIANG Nan， XU Xiaoyan， WEI Wei， YU Mengyao， LUO Xia*

(Sichuan Academy of Chinese Medicine Science， Celluar and Molecular Lab， Chengdu 610041， China)

Objective To investigate the effect and mechanism ofGanodermalucidumextract on resisting the skin tissue senility of D-galactose caused mice subacute senility. Methods The mice models with D-galactose caused subacute senility were smeared withG.lucidumextract on their backs. The contents of superoxide dismutase (SOD)， malondialdehyde (MDA)， lipofuscin (LF) and hydroxyproline in the skin tissue homogenates from the mice back were then examined after 42 days. ResultsG.lucidumextract could obviously enhance the skin SOD activity of the subacute senile mice， decrease MDA and LF content， and increase the hydroxyproline amount. ConclusionG.lucidumextract can effectively resist the skin senility of D-galactose caused the mice subacute senility.

Ganodermalucidumextract; D-galactose; skin senility; superoxide dismutase; malondialdehyde; lipofuscin; collagen

2016-05-20 接受日期：2016-06-08

四川省公益性科研院所基本科研項目“具有抗衰功效的靈芝化妝品原料的系統(tǒng)研究”(A-2015N-14); 四川省精深加工研究崗位建設(shè)項目[批準號：川農(nóng)業(yè)(2009)75號]; 四川省重大科技計劃項目“以川產(chǎn)藥材為主要原料的中藥相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化”(14ZC2234); 四川省科技基礎(chǔ)條件平臺項目： 四川省農(nóng)業(yè)微生物資源共享平臺(中醫(yī)藥院)(15010302)； 菌類藥材整合式全產(chǎn)業(yè)鏈創(chuàng)新研發(fā)服務(wù)示范， 四川省科技廳科技服務(wù)業(yè)示范項目(2016GFW0186); 四川省中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究專項“特色菌類藥材化妝品-靈芝雪融霜的開發(fā)研究”(2016C006); 四川省“十三五”農(nóng)作物及畜禽育種攻關(guān)項目： 突破性道地藥材新品種選育與育種材料創(chuàng)新(16ZC2867)

江南(1976—)， 女， 博士， 副研究員， 主要研究領(lǐng)域為菌類藥材開發(fā)及應(yīng)用， E-mail：jnan12@sina.com

*通信作者Corresponding author， E-mail：287748567@qq.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20160133

Q417； Q95-33

A

1000-7083(2016)04-0585-03