王巖石　田志剛

(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)免疫學(xué)研究所,合肥230027)

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·專家述評·

免疫系統(tǒng)人源化小鼠的構(gòu)建及其應(yīng)用進展①

王巖石田志剛

(中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)免疫學(xué)研究所,合肥230027)

[摘要]人源化小鼠模型經(jīng)歷了近四十年的發(fā)展，已經(jīng)從難以實現(xiàn)重建到日趨成熟，隨著受者小鼠的免疫缺陷程度逐漸增加，人源化免疫系統(tǒng)的重建水平也得以提高。不僅受者小鼠的基因背景對重建水平至關(guān)重要，多種細胞因子補給策略也再一次實現(xiàn)了突破。伴隨模型構(gòu)建的逐漸完善，人源化小鼠已經(jīng)在諸如造血功能、感染性疾病、自身免疫病以及腫瘤學(xué)研究等多領(lǐng)域顯現(xiàn)出其獨特的用于體內(nèi)研究人類生理及病理的優(yōu)勢。人源免疫細胞發(fā)育過程均在小鼠體內(nèi)完成，受到小鼠基質(zhì)細胞的選擇和教育，但是由于種屬特異性的存在，使得人源化免疫系統(tǒng)往往在功能上受損，從人源化小鼠體內(nèi)得到的結(jié)論還不能完全反映出人體內(nèi)的情況。因此，仍需進一步完善人源化小鼠模型的構(gòu)建，為臨床治療前的研究提供有力的工具。

[關(guān)鍵詞]免疫系統(tǒng)；人源化小鼠；感染性疾??；腫瘤；造血；自身免疫病

王巖石(1987年-)，男，在讀博士，2010年畢業(yè)于南開大學(xué)生物科學(xué)專業(yè)，獲得理學(xué)學(xué)士學(xué)位，同年推薦免試進入中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院攻讀碩士學(xué)位，師從田志剛教授，2012年起攻讀博士學(xué)位，主要從事免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型方面的研究。

田志剛 (1956年-)，男，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院教授、博士生導(dǎo)師，現(xiàn)任中國科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院免疫學(xué)研究所所長。中國免疫學(xué)會理事長，中國免疫學(xué)會英文會刊(Cell Mol Immunol)執(zhí)行主編，中文會刊《中國免疫學(xué)雜志》主編。2001年國家杰出青年基金獲得者、2007年教育部創(chuàng)新團隊負責(zé)人、2008 和 2011 年國家基金委《天然免疫與重大疾病發(fā)生發(fā)展》創(chuàng)新群體負責(zé)人。2008年獲國家自然科學(xué)二等獎(首位)、2011年獲國家科技進步二等獎(第二位)。2015年獲何梁何利獎。主要從事天然免疫和肝臟免疫學(xué)研究，以通訊作者在Cell、Nat Immunol、Immunity、J Clin Invest、J Exp Med、PNAS、Nat Commun、Gastroenterology、Hepatology、J Allergy Clin Immunol、PloS Pathogen、J Hepatol等SCI收錄的國外雜志發(fā)表論文200余篇。

人類的免疫應(yīng)答需要在體內(nèi)進行，由于受到倫理限制，不能夠直接以人為實驗對象。嚙齒類動物是廣泛應(yīng)用于實驗研究的小動物模型，目前免疫系統(tǒng)發(fā)育分化及功能研究大多來源于這些模型，但是因為種屬特異性的存在，嚙齒類動物模型得到的結(jié)論并不能直接推導(dǎo)于人類免疫系統(tǒng)。人類的造血免疫功能研究、感染類疾病、自身免疫病以及腫瘤研究都難以實現(xiàn)體內(nèi)動態(tài)觀察。一些研究人員則以靈長類動物為替代對象，試圖彌補人類與嚙齒類動物之間巨大的種屬差異，但是因?qū)嶒瀸ο蟛僮鲝?fù)雜，經(jīng)濟成本高，并不利于推廣。黑猩猩、長臂猿等靈長類動物雖然能感染HIV，但是感染后并不發(fā)病，而且屬瀕危動物，逐漸被禁止使用。因此，亟需一種能夠應(yīng)用于人類免疫應(yīng)答的小動物模型，免疫系統(tǒng)人源化小鼠便應(yīng)運而生。免疫系統(tǒng)人源化小鼠是指在免疫缺陷小鼠植入人的造血細胞、淋巴細胞或組織而具有人的免疫功能的小鼠模型，為了解人類免疫系統(tǒng)及其免疫應(yīng)答的重要工具。本文將已有的免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型的構(gòu)建策略、改進方案、應(yīng)用情況及存在的問題等方面逐一進行綜述。

1人源化小鼠的發(fā)展歷史

免疫系統(tǒng)保護人類抵抗病原微生物的感染，但是由于缺乏合適的小動物模型，關(guān)于人類的免疫系統(tǒng)生理及病理的很多機制并未研究得十分清楚。小鼠是應(yīng)用最為廣泛的模式實驗動物，由于長期的進化差異，導(dǎo)致人類和小鼠產(chǎn)生種屬特異性。在小鼠體內(nèi)重建人源免疫系統(tǒng)，將為解決這一難題提供一個理想的小動物模型。早在1988年，Mccune等[1]發(fā)現(xiàn)在重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠中植入人胎肝干細胞、胎胸腺和胎淋巴結(jié)可以支撐人源T細胞和B細胞的重建。同時，“PBL-SCID”模型也誕生了，即在SCID小鼠中植入成熟人源免疫細胞以在小鼠體內(nèi)重建出具有功能的人源化免疫系統(tǒng)[2]，但是由于SCID小鼠的NK細胞對外源細胞的排斥作用，隨年齡增長出現(xiàn)小鼠T、B細胞，即發(fā)生“滲漏現(xiàn)象”等因素，均極大程度的限制了重建[3,4]。靶向突變重組活化基因Rag1或Rag2同樣可以使受者小鼠的T、B細胞缺陷，并且該小鼠不會發(fā)生滲漏現(xiàn)象，但過強的NK細胞和天然免疫細胞活性同樣制約著人源造血干細胞(HSCs)的植入能力。隨后通過SCID缺陷小鼠與NOD背景小鼠回交，產(chǎn)生了NOD/SCID小鼠，該小鼠NK細胞活性及天然免疫細胞的功能更低，可以更好地支持重建，所以在接下來的很長一段時間里，NOD/SCID小鼠被認為是用于人源化重建的最理想受者小鼠[5-7]。然而，當(dāng)研究者用造血干細胞進行免疫重建時，殘存的NK細胞和天然免疫細胞活性，仍然成為了難以跨越的障礙。在HSCs-NOD/SCID小鼠中，50%的hCD45陽性的人源白細胞都是hCD19陽性的B細胞，僅有很少的髓系細胞重建，并且?guī)缀鯖]有T細胞和NK細胞的重建[8]。為了探索殘存的NK細胞對臍血造血干細胞植入的影響，研究人員將NOD/SCID小鼠的NK細胞清除以后再植入臍血造血干細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重建水平大大提高，但是并沒有影響重建的細胞譜系分化[9]。我們實驗室對該模型中重建的B細胞進行了進一步的研究，發(fā)現(xiàn)不同臟器的人源化B細胞表現(xiàn)出不同的成熟階段，骨髓中以不成熟的IgM-IgD-CD24hiCD38hiB 細胞為主，而脾臟和外周血中則以成熟的CD5+IgM+IgD+CD24intCD38intCD19+B 細胞為主[10]。隨后，β2微球蛋白基因缺陷的小鼠通過與NOD/SCID小鼠雜交，獲得了一個新的用于人源化小鼠構(gòu)建的鼠種NOD/SCID/B2mnull，即便是更少的臍血造血干細胞的植入，也可以獲得相比于NOD/SCID小鼠更高的重建水平[11]。但是該小鼠仍殘存的NK細胞對人源化的T細胞和B細胞的成熟產(chǎn)生了很強的抑制作用[12]。IL-2受體伽瑪鏈(IL-2Rγ)缺陷小鼠的引入，使人源化小鼠模型的構(gòu)建進入了嶄新的歷史篇章。IL-2Rγ是細胞因子IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15、IL-21等傳遞信號所共同需要的受體成分，它的缺陷將直接導(dǎo)致T、B細胞發(fā)育受損，NK細胞完全缺失[13,14]。基于該基因缺陷所派生出來的幾種重度聯(lián)合免疫缺陷小鼠均大大的促進了人源化免疫系統(tǒng)的重建水平，如NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl(NSG),NODShi.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug(NOG)，129S4-Rag2tm1FlvIl2rgtm1Flv(BRG)，NOD.Cg-Rag1tm1MomIl2rgtm1Wjl(NRG)等[15-17]。以上幾種小鼠品系的建立均克服了殘存NK細胞的限制性問題，受者小鼠的三缺陷(T、B、NK細胞均缺陷)使得它們成為當(dāng)前最為理想的模型小鼠。用CD34陽性的臍血干細胞在NOG小鼠中進行重建，獲得了較NK細胞清除小鼠或者NOD/SCID/B2mnull小鼠更高的植入水平。在HSCs-NOG人源化模型中，不僅使CD45陽性細胞的重建獲得6倍于NOD/SCID小鼠的高植入水平，同時也出現(xiàn)了多譜系的細胞分化，這其中不僅包含了人源的T細胞、B細胞以及NK細胞，還出現(xiàn)了髓系細胞的重建[17]。后續(xù)的研究者為更加完善人源化免疫系統(tǒng)的重建，也采用了一系列的基因工程小鼠作為受者鼠，但大都基于上述三缺陷小鼠，我們將在“促進人源化重建的方案”一節(jié)中詳細闡述，在此不再贅述。

2人源化小鼠的重建策略

若要成功構(gòu)建人源化小鼠模型，諸多因素制約著重建效果，如供者材料的類型，植入的途徑，受者鼠的品系、年齡、實驗前處理等等。由于有大量的條件影響著人源化重建的效率，也很難直接比較出目前哪一個方案才是最優(yōu)的。因此，如果能嚴格的控制單一變量來進行重建，會使我們對重建過程有一個更好的理解。

2.1供者材料類型早期的人源化小鼠模型直接采用人的外周血淋巴細胞(PBL)作為供者來源，將其直接轉(zhuǎn)輸給SCID缺陷小鼠，構(gòu)建PBL-SCID人源化小鼠模型。在該模型中，不僅能夠得到多譜系的人源化免疫系統(tǒng)，而且能夠維持長時間的重建。由于植入的是異種來源的成熟T細胞，一個很致命的問題隨之產(chǎn)生，便是小鼠會隨時間推移而產(chǎn)生移植物抗宿主疾病(GVHD)[18]，這就極大地限制了功能性實驗所能開展的周期。為了克服這一困難，供者材料便被造血干細胞所替代，其來源也極其廣泛，包括臍帶血、骨髓、胎肝或者G-CSF處理過的成人外周血[19]。雖然可以獲得大量的G-CSF處理過的成人外周血造血干細胞，但實驗結(jié)果表明其是目前重建效率最低的造血干細胞，對該模型的使用也是最少的[20]。相對來說，臍帶血來源較為廣泛，并且一般作為醫(yī)療垃圾處理，不會對供者造成傷害。通常情況下，一份臍帶血可以分離獲得2×105～1×106個造血干細胞[20]。可見，一份臍帶血干細胞所能用于重建的小鼠非常有限，如果后續(xù)實驗分組較多，很難控制造血干細胞的單一來源因素。除此之外，重建效果也依賴于植入的細胞的量，更多的干細胞往往能夠獲得更高的重建水平。于是如何獲得大量均質(zhì)的造血干細胞也成為科學(xué)家亟需解決的問題。

關(guān)于體外擴增造血干細胞的問題，已經(jīng)有較長的研究歷史，并有較多的實施策略[21,22]。但問題依然存在，如有些擴增條件會使干細胞獲得向某些特定細胞譜系發(fā)育的潛能，植入受者小鼠以后所重建的免疫系統(tǒng)是不完善或畸形的[21]。胎肝是另一個造血干細胞的來源，它的發(fā)育分化能力與臍帶血干細胞相當(dāng)，更主要的是，分離一份胎肝所獲得的干細胞總數(shù)要遠多于一份臍帶血，為能夠重建單一供者來源的免疫系統(tǒng)人源化小鼠提供了很好的保障。為了使造血干細胞有更接近生理的發(fā)育場所，科學(xué)家們構(gòu)建了BLT人源化小鼠模型，即通過手術(shù)的方法將人胎肝、胎胸腺組織植入免疫缺陷小鼠，并靜脈轉(zhuǎn)輸胎肝來源的造血干細胞、胎胸腺組織更好地支持人源T細胞的發(fā)育分化[23-25]。因其T細胞的良好發(fā)育，較多地被應(yīng)用于HIV感染的研究[26]。

2.2受者小鼠的選擇及預(yù)處理一般認為受者小鼠的免疫功能缺陷程度越高，能夠越好的支持重建。在將IL-2Rγ缺陷小鼠引入到人源化重建中以后，獲得了如BRG或NOG等T細胞、B細胞以及NK細胞的三缺陷小鼠，均很大程度地促進了重建水平。雖然它們在B細胞、DC細胞的重建中沒有表現(xiàn)出差異，但是NOD背景的NOG小鼠，因其更低的髓系細胞功能，顯示出更好的T細胞、NK細胞的重建能力。除背景以外，受者鼠的年齡也影響著重建水平，新生小鼠相比于成年鼠表現(xiàn)出更高的重建水平[27]。新生小鼠的細胞轉(zhuǎn)輸操作相對困難，常用的有臉部靜脈注射、肝內(nèi)注射、心內(nèi)注射等，而成年鼠的轉(zhuǎn)輸僅需尾靜脈注射便可，操作相對容易。除此之外，性別也被發(fā)現(xiàn)影響著重建水平，雌鼠的重建能力要顯著高于雄鼠[28]，那么用成年雌鼠實驗，獲得更好的重建效果而又避免了新生鼠麻煩的操作也是一個不錯的選擇。除此之外，細胞轉(zhuǎn)輸前的小鼠處理也是一個尤為重要的因素。根據(jù)日本CIEA發(fā)布的操作流程，要在轉(zhuǎn)輸前一天對受者小鼠進行輻照，成年鼠輻照劑量2～2.5 Gy，新生鼠則是1 Gy。操作時，應(yīng)根據(jù)實際情況進行調(diào)整，如小鼠體重小于18 g，再以該劑量進行實驗，則會大大提高死亡率。

3人源化小鼠的改進方案

一個理想的免疫系統(tǒng)人源化小鼠不僅要有人源的多譜系免疫細胞，還應(yīng)該使各細胞亞群的比例和定位也與人類接近，更重要的是要具有功能。由于進化上的差異，小鼠的細胞因子往往不能很好地作用于人的造血細胞，因此在發(fā)育和功能上往往是受損的，那么如何克服這一困難，科學(xué)家們在人源細胞因子補給上做了大量的努力和嘗試，使人源化小鼠模型獲得了巨大的進步。

3.1注射可溶性細胞因子最早的細胞因子補給策略便是給受者小鼠直接注射可溶性人源細胞因子蛋白。我們實驗室通過對PBL-NOD/SCID人源化小鼠模型注射人催乳素，同時促進了T細胞和B細胞重建，并提高了細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答能力[29]。在同一人源化小鼠模型中，我們通過注射重組人IL-15，發(fā)現(xiàn)T細胞重建水平、增殖能力以及細胞因子分泌能力均顯著提高[30]。對SCID小鼠同時補充人TPO、IL-3和GM-CSF，無論是在成人骨髓重建模型還是臍帶血重建模型，都能顯著促進重建水平[31,32]。隨著后續(xù)的重建模型中受者小鼠的品系不斷進步，細胞因子的重要作用也逐漸突顯出來。因為NOG小鼠本身可以支持較高水平的人源化重建，細胞因子的作用也逐漸被聚焦到重建較差的NK細胞、髓系細胞和較弱的適應(yīng)性免疫應(yīng)答等方面。Tanaka等[33]更關(guān)注G-CSF對髓系細胞的作用，他們在已經(jīng)重建4～6個月的HSC-NOG小鼠中注射人源G-CSF，5 d以后便觀察到中性粒細胞、單核細胞和樹突狀細胞都得以增多。

雖然外周血造血干細胞重建效率較低，Andre等[34]在PBSCs-NOG小鼠模型中外源補充人IL-7，不僅提高了植入水平，還可以促進多譜系的細胞分化，達到等同于臍血干細胞的重建水平。目前NK細胞的體內(nèi)研究通常依賴小鼠模型，但是由于NK細胞的很多生物學(xué)特性在人和小鼠中有著較大的差異，那么建立擁有人類NK細胞的人源化小鼠模型就顯得十分必要。很多研究小組在BALB/c-rag-/-γc-/-(BRG) 小鼠中做的人源化嘗試均表現(xiàn)出較差的NK細胞重建能力。Huntington等[35]認為小鼠的IL-15對人的細胞弱反應(yīng)性是癥結(jié)所在，他們外源施加人IL-15給人源化重建的小鼠，但是促進效果微乎其微，當(dāng)以IL-15-IL-15Ra復(fù)合體形式給予，NK細胞的增殖和分化都得到了大幅度提升。

對于細胞而言，它的分化、發(fā)育、增殖乃至活化，均受到多個細胞因子信號的協(xié)同作用，所以單一的細胞因子補充在某些特定情況下也許并不足夠。Connie等[36]對NOD/SCID小鼠中進行次級重建的人源化小鼠模型連續(xù)兩周注射人SCF、IL-3、GM-CSF、TPO，淋巴細胞和髓系細胞的發(fā)育分化均得到了較大的促進。Ding等[37]構(gòu)建了HSCs-NOD/SCID小鼠，并且在4周以后給予人源FLT3L,DC細胞的數(shù)目和功能都得以顯著提高[37]。當(dāng)然，并非給予越多的細胞因子效果就越好，選擇什么細胞因子、給予途徑、給予頻率、給予方式等都需要仔細考量和多次嘗試，最終確定最佳的重建方案。

3.2構(gòu)建病毒載體病毒載體是一種常見的分子生物學(xué)工具，可以將遺傳物質(zhì)帶入細胞，從而實現(xiàn)外源基因的表達。由于腺病毒載體的感染效率高，荷載量高，不產(chǎn)生插入突變，普遍認為是較為理想的體內(nèi)基因傳遞工具[38]。Pek等[39]采用直接注射人IL-15或用腺病毒載體過表達人IL-15都能夠幫助促進NK細胞的發(fā)育和成熟，但是兩者的效果相比，沒有顯著差別。雖然這些手段均可以提高NK細胞的重建水平，但是NK細胞的比例還是相對較低，而且遠遠低于正常人的生理水平。

借助慢病毒載體的基因傳遞方式可以完成外源基因在宿主細胞基因組的整合，促進目的基因的表達，即使細胞分裂，目的基因依然可以在子代細胞繼續(xù)表達[40]。研究人員用攜帶人源IL-7基因的慢病毒載體在Rag2-/-γc-/-小鼠中過表達人IL-7分子，在長達6個月的觀察期內(nèi)，小鼠血清中人IL-7的含量一直維持較高水平。IL-7的過表達顯著促進了外周血中T細胞和B細胞的比例，但是對整體的免疫重建水平的提高作用微乎其微，而且也并沒有影響到T細胞亞群的分化[41]。

雖然通過病毒載體攜帶外源基因進入宿主體內(nèi)實現(xiàn)體內(nèi)的過表達是一個很高效的方式，但是依然存在很多問題亟待解決。比如若要獲得足夠的病毒載體，通常需要大量而復(fù)雜的病毒包裝工作和病毒純化工作；腺病毒載體本身可能引起人源細胞的免疫應(yīng)答，甚至導(dǎo)致一定的病理損傷，而使得從實驗對象上看到的表型并不能反映正常生理條件下的情況；慢病毒載體的整合能力則更是一把雙刃劍，不確定的整合位點將對宿主產(chǎn)生不可預(yù)知的傷害，甚者可能是致死性的。所以基于種種考慮，利用病毒載體作為基因傳遞的工具還是受到很多限制的，那么找到一種更簡單、更高效的基因傳遞方式顯得尤為重要。

3.3高壓注射基因表達質(zhì)粒高壓注射是一種廣泛應(yīng)用于體內(nèi)基因過表達的技術(shù)手段，最成功的應(yīng)用便是在嚙齒類動物的肝細胞中導(dǎo)入外源基因的過表達載體，操作要領(lǐng)一般遵循在5～7 s內(nèi)，從小鼠尾靜脈注入等同于其體重8%～10%的載體溶液[42]。Chen等[43]運用高壓注射手段解決人源化重建中細胞因子不足的問題。首先，他們在人源化小鼠中高壓注射人IL-15 和Flt3l表達載體，NK細胞的重建水平顯著提高，并且誘導(dǎo)出的NK細胞能夠正常表達活化性受體和抑制性受體，能夠被誘導(dǎo)引起NK細胞依賴的肝臟損傷，并且體外具有殺傷靶細胞的能力，表明重建的NK細胞是具有功能的。除此之外，他們還嘗試表達更多種類的細胞因子，觀察它們對免疫重建的影響。如過表達人GM-CSF和IL-4,M-CSF促進樹突狀細胞、單核巨噬細胞重建,或者人EPO和IL-3促進紅細胞重建。有了促進重建人源化NK細胞的方案，為后續(xù)開展人NK細胞病理和生理的研究提供了模型。

在他們后續(xù)的研究中，發(fā)現(xiàn)在瘧原蟲感染過程中，人NK細胞能夠與被感染的紅細胞相互作用并殺傷靶細胞，進而找到對此過程起到關(guān)鍵作用的分子LFA-1[44]。在對過表達人GM-CSF和IL-4,M-CSF的小鼠模型所展開的后續(xù)工作中，他們發(fā)現(xiàn)除了可以提高樹突狀細胞的重建能力，對T細胞和B細胞的成熟也起到了促進作用，由此適應(yīng)性免疫應(yīng)答在該小鼠模型中能夠成功被誘導(dǎo)[45]。在M-CSF過表達的小鼠模型中，成熟的單核細胞和組織居留的巨噬細胞都可以成功發(fā)育，并對流感病毒感染或者分支枝桿菌感染起到增強的保護效果[46]。

在高壓注射表達細胞因子的人源化小鼠模型中，某種細胞因子針對不同細胞種類的特定功能得以突顯出來，成為研究細胞因子功能的有力工具。相比于單純注射可溶性細胞因子，質(zhì)粒在受者體內(nèi)可以維持相對較長時間，一次注射就可以達到表達目的，而細胞因子鑒于其半衰期較短，往往需要反復(fù)注射，增加了操作的復(fù)雜性和經(jīng)濟成本。但是高于生理水平的表達細胞因子也許并不一定反映的是生理條件下的真實情況，甚至可能導(dǎo)致免疫細胞的耗竭。如果能夠?qū)λ磉_的細胞因子表達時相、表達劑量精密調(diào)控，將對重建多譜系的人源化免疫系統(tǒng)起到非常重要的作用。

3.4構(gòu)建基因工程小鼠對受者小鼠進行基因改造用于模型構(gòu)建，最大程度降低了各種操作手段中人為因素等造成的系統(tǒng)誤差，由此得到的成功構(gòu)建的小鼠模型將更加穩(wěn)定。Richard A Flavell研究小組運用基因敲入技術(shù)在免疫系統(tǒng)人源化重建方面做出了一系列優(yōu)秀的工作[47-50]。他們將人源目的基因敲入小鼠相應(yīng)基因的位點以替代其表達，并且所選擇的目的細胞因子一般具有以下幾個特點：①小鼠的細胞因子不作用或弱作用于人源細胞；②人源細胞因子不作用或弱作用于小鼠細胞以確保人源細胞的競爭優(yōu)勢；③人源細胞因子不單純由造血細胞產(chǎn)生；④小鼠不會因為細胞因子的缺失而致死，或者敲入的人源細胞因子通過交叉反應(yīng)足以挽救小鼠[47]。

因為人源化小鼠的髓系細胞重建較差，而IL-3和GM-CSF是對髓系細胞發(fā)育分化和發(fā)揮功能很重要的兩種細胞因子，他們在Rag2-/-γc-/-小鼠的基礎(chǔ)上構(gòu)建了人IL3/GM-CSF基因敲入小鼠，但是結(jié)果卻表明這兩個細胞因子在髓系細胞重建方面的促進作用并不是非常顯著[47]。有趣的是，同樣的基因也通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)引入到NOG小鼠體內(nèi)，多譜系的髓系細胞卻能夠被促進發(fā)育分化[51]。雖然兩種基因工程小鼠帶有相同的人源基因，后者卻有著更高的髓系重建水平，可能小鼠自身的天然免疫系統(tǒng)活性差異是問題的關(guān)鍵所在。Richard A Flavell 小組在Rag2-/-γc-/-小鼠基礎(chǔ)上構(gòu)建了人TPO基因敲入小鼠，在該小鼠中進行的人源化重建水平得以提高，多譜系免疫細胞發(fā)育分化，血小板的數(shù)目也有所提高[48]。尤其值得指出的是，小鼠自身的TPO雖然被替代，但是其巨核細胞并未受到影響，也就是說小鼠的TPO基因被替代，功能卻沒有完全被替代。將M-CSF引入到Rag2-/-γc-/-小鼠的相應(yīng)基因位點用于人源化的構(gòu)建，骨髓、脾臟、外周血、肺臟、肝臟和腹腔中更有效地重建出人源單核細胞和巨噬細胞，并且它們有著更強的遷移、吞噬和活化能力[52]。除此之外，他們團隊還通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)在Rag2-/-γc-/-小鼠中引入人源信號調(diào)節(jié)蛋白阿爾法(SIRPα)基因，通過負調(diào)受者小鼠巨噬細胞的吞噬功能顯著提高了人源化的水平[49]。在生理條件下，CD47-SIRPα這一個分子對通過傳遞“請勿吃掉我”信號來抑制巨噬細胞的吞噬作用[53]，對于造血干細胞、紅細胞以及血小板等起到重要的維持作用[54]。

雖然這些基因敲入小鼠對于人源化免疫系統(tǒng)的重建起到了不同程度的促進作用，但是仍沒有任何一個小鼠模型能夠產(chǎn)生完整的并且有功能的髓系免疫系統(tǒng)。最近Richard A Flavell 團隊創(chuàng)建了一個較以往工作最為復(fù)雜的基因工程小鼠，它基于前期研究成果，整合了人源M-CSF、IL-3/GM-CSF、TPO和SIRPα在同一只Rag2-/-γc-/-受者小鼠上，并將它根據(jù)是否帶有人SIRPα基因分別取名MISTRG或者MITRG。這兩種小鼠最大程度地支持人源化造血生成和髓系生成，有趣的是，還促進了NK細胞的重建，其重建水平在以往任何模型中都是難以達到的[50]。

Billerbeck等[55]通過轉(zhuǎn)基因的技術(shù)在NSG小鼠中表達人SCF、GM-CSF和IL-3，簡稱NSG-SGM3小鼠。正如他們所預(yù)期的，髓系細胞的重建水平顯著提高，尤其是樹突狀細胞(DC)的重建優(yōu)勢尤為明顯。有趣的是，在轉(zhuǎn)基因小鼠中，具有抑制性功能的調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的重建也顯著被提高了。隨后，該研究小組在NSG小鼠基礎(chǔ)上構(gòu)建表達人SF、IL-3和GM-CSF的小鼠模型，簡稱NSG-3GS小鼠。同樣的，在該小鼠中，人源化髓系細胞顯示出較大的重建優(yōu)勢[56]。有研究者在NSG小鼠中表達膜結(jié)合型人SCF和KITL，也達到了促進髓系細胞重建的目的[56]，但是在該模型中，我們并沒有看到與MISTRG小鼠模型中同樣能夠促進NK細胞重建的現(xiàn)象，這可能歸咎于在他們的人源化小鼠模型中單核細胞和巨噬細胞的重建相對較差，不能產(chǎn)生足夠的人IL-15支持NK細胞重建。

就基因工程小鼠而言，無論是新生小鼠還是成年小鼠，在造血干細胞植入之初便能夠提供人源化細胞因子，并且可以一直穩(wěn)定提供。因此，對于一個造血干細胞發(fā)育過程中各個關(guān)鍵節(jié)點，基因工程小鼠所提供的細胞因子均可以覆蓋，這一優(yōu)勢，對其他的外源細胞因子補給方式來說是難以達到的。

4人源化小鼠模型的應(yīng)用

免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型的構(gòu)建初衷便是更好地解決人類免疫生理及病理中的問題，從誕生之初，研究者們便不斷嘗試借助該模型在造血功能、感染性疾病、自身免疫病以及腫瘤學(xué)等領(lǐng)域有所新的發(fā)現(xiàn)和突破。但是由于起步較晚，困難較多，很長一段發(fā)展歷程都圍繞如何更好地構(gòu)建模型展開，實際應(yīng)用尤其在臨床疾病方面的研究進展比較緩慢。

4.1造血及免疫系統(tǒng)研究利用人源化小鼠模型研究造血是在所有應(yīng)用領(lǐng)域最為成熟的，因為在不斷的嘗試更好地重建人類免疫系統(tǒng)的同時，也對影響某些細胞亞群發(fā)育所必需的因素探究的比較清楚，比如前面所提到的細胞因子的補充，大多獲得了較好的促進重建的效果。Chen等[57]在利用細胞因子促NK細胞重建的人源化小鼠模型中，進一步發(fā)現(xiàn)一群同時表達NK細胞和髓系細胞標志(CD56+CD33+CD36+)的亞群，它可以丟失髓系標志而獲得NK細胞功能性受體表達最終發(fā)育為成熟NK細胞，揭示了NK細胞發(fā)育可能源于髓系前體細胞。

除細胞因子外，T細胞發(fā)育需經(jīng)歷陽性選擇和陰性選擇，NK細胞需經(jīng)歷教育等過程都將對細胞功能產(chǎn)生重要影響。人的T細胞在小鼠胸腺中經(jīng)歷選擇，未能獲得HLA限制性，為了解決這個問題，Shultz等[58]將HLA-A2基因轉(zhuǎn)入NSG小鼠，通過轉(zhuǎn)輸造血干細胞重建人免疫系統(tǒng)，值得注意的是，重建的CTL細胞顯示出更高的功能性成熟，在應(yīng)對EB病毒感染時，表現(xiàn)出更強的HLA限制性的細胞毒活性。除此之外，普通NOG小鼠中重建出的人源T細胞，用抗CD3、CD28抗體刺激既不會產(chǎn)生增殖也不會分泌IL-2，用多種抗原刺激小鼠，往往只能產(chǎn)生抗原特異性的IgM，而少有IgG的產(chǎn)生[59]，這都說明免疫細胞雖然能夠在小鼠中完成發(fā)育，但是人鼠體內(nèi)微環(huán)境的差異導(dǎo)致發(fā)育出來的細胞功能受損。將人MHCⅡ分子HLA-DR通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入NOG小鼠并進行人源化免疫重建，體液免疫應(yīng)答能力顯著增強，在血清中可以檢測到抗原特異性的IgG的產(chǎn)生[60]。

人源化小鼠模型除了對已知細胞亞群的發(fā)育過程、功能性分子的探究，對新細胞亞群的發(fā)現(xiàn)及功能研究也起到了重要的作用。ILC細胞是新近發(fā)現(xiàn)的一類天然免疫細胞，它隨血液循環(huán)并在周身分布，在抵抗感染、炎癥過程和組織重塑等方面發(fā)揮著重要的作用[61,62]。目前的研究主要以小鼠和少量臨床資料為實驗對象，關(guān)于人類ILC細胞在體內(nèi)的發(fā)育分化過程及功能研究仍留有大量空白。Bernink等[63]在NSG-HIS小鼠模型的結(jié)腸中檢測到人ILC3(Lin-CD127+cKit+NKp44+)和ILC1(Lin-CD127+cKit-NKp44-),并且在DSS誘導(dǎo)腸炎模型中檢測到ILC1的比例增加。最近，同一小組在人源化小鼠的外周血、脾臟、肺臟和小腸均檢測到Lin-CD161+cKit-NKp44-的ILC1細胞，并且轉(zhuǎn)輸實驗證明ILC1能夠向ILC3進行轉(zhuǎn)化[64]。可見，人源化小鼠已經(jīng)為人類ILC細胞的發(fā)育及功能研究提供了很好的模型，隨著研究的深入，將來可能對ILC各個細胞亞群的基礎(chǔ)生物學(xué)特性和免疫功能研究提供更多的幫助。

4.2感染性疾病研究由于很多病毒只感染人類，常規(guī)的小鼠實驗并不能作為理想的動物模型，免疫系統(tǒng)人源化小鼠的出現(xiàn)在一定程度上解決了這一難題。伴隨著人源化小鼠模型構(gòu)建日趨成熟，諸多感染類疾病也開始有了新的研究進展，較為典型的如HIV病毒、EB病毒、登革熱病毒等等。

HIV的感染嚴重威脅著人類的健康，利用HIV感染人源化小鼠模型發(fā)現(xiàn)，單純的抗病毒治療或中和抗體治療都很難清除潛伏感染的病毒，而用潛伏激活子聯(lián)合中和抗體治療，有效地控制了血漿中病毒反彈現(xiàn)象[65]。同樣利用人源化小鼠模型，無論在急性還是慢性HIV感染中，利用單克隆抗體特異清除pDC均顯著降低了IFN-I和ISG的表達，并伴隨病毒復(fù)制的增加[66]。新近一項研究表明，人源化小鼠中持續(xù)性感染HIV可以導(dǎo)致ILC3細胞的大量減少，并發(fā)現(xiàn)該過程依賴pDC、IFN-I和CD95/FasL這條途徑，無論是清除pDC還是阻斷IFN-I或者CD95/FasL信號通路都可以挽救ILC3的減少[67]，這或許將對臨床治療HIV感染起到一定的指導(dǎo)作用。

EB病毒是一種特異性感染人的雙鏈DNA病毒，被感染者通常終身攜帶病毒，并不需要治療。然而有時EB病毒的感染會引發(fā)淋巴瘤，威脅著人類的健康[68]。由于缺少動物模型，給相關(guān)研究帶來一定困難。對人源化小鼠進行EB病毒感染，可以產(chǎn)生淋巴瘤癥狀，伴隨高病毒血癥、白細胞增多、血小板減少等癥狀，并導(dǎo)致2/3小鼠死亡[69]。EB病毒感染通常會引起霍奇金淋巴瘤(HL)和非霍奇金淋巴瘤(NHL)，研究者發(fā)現(xiàn)一個有趣的現(xiàn)象，在人源化小鼠中感染EB病毒時，若小鼠以B淋巴細胞為主[71,72]，則易于發(fā)生非霍奇金淋巴瘤，相反，若以T淋巴細胞為主，則傾向發(fā)生霍奇金淋巴瘤[70]。

登革熱病毒是一種依賴蚊蟲傳播的感染性疾病，不同人的感染癥狀差異也較大，從亞臨床癥狀到急性發(fā)熱甚至重度登革熱休克綜合征。Jaiswal等利用登革熱病毒感染NSG-HLA-A2人源化小鼠，同時看到了體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答，但是缺憾的是產(chǎn)生的抗體仍以IgM為主[71,72]。所以能夠盡快完善人源化免疫系統(tǒng)的功能，將會使人源化小鼠的應(yīng)用向前再推進一步。

4.3自身免疫病研究自身免疫病的研究也是人源化小鼠較早應(yīng)用的領(lǐng)域之一，20世紀90年代，通過CB17-SCID小鼠轉(zhuǎn)輸Ⅰ型糖尿病患者的PBMCs，可以觀察到胰島抗原特異性抗體的產(chǎn)生；轉(zhuǎn)輸風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者滑膜液細胞或PBMCs，可產(chǎn)生風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)抗體。但是這些模型轉(zhuǎn)輸?shù)募毎鶠槿说某墒霻細胞，不利于研究人的免疫系統(tǒng)功能，也不能用于研究宿主體內(nèi)發(fā)育而來的耐受性細胞的改變。CTLA-4成為了新近腫瘤生物治療中的明星分子，利用抗CTLA-4單克隆抗體有效活化抗腫瘤效應(yīng)性T細胞[73]。然而除了抗腫瘤的效果外，病人還表現(xiàn)出皮炎、結(jié)腸炎、肝炎、胰腺炎和垂體炎等病癥，對其發(fā)病機制和病理情況缺少進一步的研究[74]。Vudatlu等[75]人利用胎肝造血干細胞構(gòu)建人源化小鼠，在抗CTLA-4抗體處理小鼠中可以檢測到抗核抗體，并發(fā)生體重下降和肝炎等病癥，作者發(fā)現(xiàn)，除T細胞過度增殖活化外，Treg細胞到病理部位的募集、與抗原遞呈細胞的作用也大大受損。個體之間的發(fā)病機制往往也存在差異，針對個人的人源化小鼠會更有意義，Kalscheuer等[76]從成人骨髓分離造血干細胞用于人源化重建，正常人來源的可以成功發(fā)育出包含Treg在內(nèi)的T細胞并產(chǎn)生較好的宿主耐受性，而1型糖尿病病人來源的干細胞重建出更多具有活化性和記憶性表型的T細胞，揭示了發(fā)病機制可能源于造血干細胞的內(nèi)在因素。這種“個人免疫系統(tǒng)人源化小鼠”表現(xiàn)出更強的針對性，對其他免疫系統(tǒng)功能失調(diào)導(dǎo)致的疾病機制研究也提供了很好的模型。

4.4腫瘤學(xué)研究當(dāng)前的腫瘤學(xué)研究主要依賴免疫缺陷小鼠的荷瘤模型，對于人的體內(nèi)免疫細胞、免疫分子等功能研究尚缺較好的動物模型。最近，人的IL-2基因被導(dǎo)入NOG小鼠用以促進免疫系統(tǒng)重建，有趣的是，大量重建出CD3-CD56highCD16+/-表型的NK細胞，不僅表現(xiàn)出與正常人外周血NK細胞相當(dāng)?shù)募毎绢w粒和細胞因子分泌能力，在對荷載的K562細胞應(yīng)答中也表現(xiàn)出較強的抗腫瘤效應(yīng)[77]。除對造血功能的生物學(xué)研究，對淋巴瘤的相關(guān)闡釋是人源化小鼠做出巨大貢獻的領(lǐng)域之一，因其可以看到疾病的異質(zhì)化，能夠反映特定病人的情況，相比于普通小鼠模型有著巨大優(yōu)勢[78]。HTLV-1是20世紀70年代后期發(fā)現(xiàn)的第一個人類逆轉(zhuǎn)錄病毒，雖然大多數(shù)感染個體終生攜帶，而約5%的感染者經(jīng)過潛伏期發(fā)展為T細胞淋巴瘤，脊髓病變或下肢癱瘓[79-81]。在NOG小鼠骨髓腔注射人CD133陽性干細胞成功構(gòu)建IBMI-huNOG人源化小鼠后，利用HTLV-1感染4～5月后，可誘導(dǎo)外周CD4陽性T細胞快速增多并產(chǎn)生類似T細胞淋巴瘤的分葉核細胞。在該模型中，不僅看到病毒感染的T細胞具有偏好性，主要以CD4陽性T細胞為主并與CD25的表達相關(guān)，也看到感染過程中細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答均參與抵抗病毒[82]。通過對荷載霍奇金淋巴瘤的人源化小鼠注射抗CCR4單克隆抗體，也能成功介導(dǎo)人源化NK細胞發(fā)揮較強的抗體依賴的細胞毒效應(yīng)(ADCC)，該模型對于體內(nèi)研究NK細胞抗腫瘤效應(yīng)提供了一個有力的模型[81]。同樣的效應(yīng)也被另一個研究小組在ATLL、CTCL細胞系荷瘤小鼠中觀測到[83]。成功的病毒感染模型將對臨床治療靶點、疫苗研發(fā)策略等提供開發(fā)和評估平臺。人源化小鼠模型具有很強的應(yīng)用性，對于很多生理、病理現(xiàn)象能夠提供體內(nèi)細胞及分子水平的機制闡釋，對于新型病毒研究、病毒疫苗研發(fā)、臨床治療策略的評估等均有一定的借鑒意義。

5人源化小鼠仍存在的問題及展望

人源化小鼠模型已經(jīng)走過了近四十年的歷程，中間經(jīng)歷了幾次里程碑式的發(fā)展階段，也讓我們對人源化小鼠模型有了更堅定的信念。盡管如此，當(dāng)前的模型仍存在很多亟待解決的問題。雖然受者小鼠的免疫缺陷程度越來越高，然而當(dāng)前仍主要局限于淋巴細胞的缺陷，天然免疫細胞對植入的干細胞仍有較強的抑制作用；T細胞在小鼠胸腺中發(fā)育，陽性選擇的過程是依賴小鼠MHC分子的，不僅使細胞免疫受損，B細胞產(chǎn)生抗體的功能也顯著降低，不能發(fā)生亞型轉(zhuǎn)換；雖然在BLT模型中外源植入的人胎胸腺組織可以克服這一難題，但是免疫系統(tǒng)趨于以細胞免疫為主，體液免疫功能極低；如前所述，科學(xué)家們已經(jīng)采用了各種各樣的辦法補充人源細胞因子，在一定程度上恢復(fù)了人源免疫細胞的功能，但是細胞因子并非萬能，細胞發(fā)育過程還需要與基質(zhì)細胞相互作用，發(fā)揮效應(yīng)功能需要趨化因子、黏附分子、共刺激分子等多因素的協(xié)同作用，免疫效應(yīng)功能結(jié)束還需要免疫調(diào)節(jié)機制等環(huán)節(jié)都難于在目前的任一人源化小鼠模型中實現(xiàn)。

基因工程小鼠是當(dāng)前用于較高水平人源化重建的主力軍，尤以Richard A Flavell 團隊的MISTRG/MISTG小鼠為代表，可以重建出最為完善的功能性髓系免疫系統(tǒng)，然而中性粒細胞的終末分化、從骨髓中的遷出、在外周的存活等問題仍沒有很好的解決；在干擾了小鼠自身紅細胞的同時，人源紅細胞又很難重建，小鼠的生存狀態(tài)難以保證；該模型對天然免疫系統(tǒng)的重建有著顯著的促進作用，但是對適應(yīng)性免疫系統(tǒng)沒有作用，導(dǎo)致適應(yīng)性免疫應(yīng)答很弱。多細胞因子的替代確實起到了較為顯著的促進人源化重建的作用，但是離完美無瑕還相去甚遠。細胞因子網(wǎng)絡(luò)的強大作用不能夠僅僅通過替換幾個關(guān)鍵因子，就達到完全等同于正常人免疫系統(tǒng)的終極目標，而且細胞因子也并不是決定人源化重建水平的唯一限制因素。 除此之外，基因工程小鼠可以終生提供人源細胞因子，目前還沒有可控制細胞因子基因表達的開啟和關(guān)閉的小鼠模型，很難看到某一細胞因子于造血過程的某一具體節(jié)點的作用。

人源化免疫系統(tǒng)在小鼠中得到越來越好的重建，然而并沒有對宿主實現(xiàn)完全耐受，如在BLT模型中，人的T細胞是由移植的人胎胸腺所介導(dǎo)的選擇，其對宿主細胞產(chǎn)生攻擊進而誘發(fā)GVHD(移植物抗宿主疾病)[78,84,85]。即使只移植造血干細胞實現(xiàn)免疫系統(tǒng)人源化，干細胞發(fā)育過程完全依賴小鼠基質(zhì)細胞，在重建6個月以后也會發(fā)生GVHD的現(xiàn)象。除此之外，人源巨噬細胞還可以吞噬小鼠的紅細胞和血小板，嚴重影響宿主生活狀態(tài)。由此可見，以往的工作一般著眼于如何使小鼠更好的接納人源細胞，那么現(xiàn)在也需要關(guān)注人源細胞對宿主的耐受。

另一個關(guān)鍵問題便是在NOG小鼠中較難重建淋巴結(jié)，而淋巴結(jié)對于適應(yīng)性免疫應(yīng)答起到至關(guān)重要的作用。我們實驗室與Barbier等均對新近發(fā)現(xiàn)的小鼠肝臟引流淋巴結(jié)進行了描述[86,87]，但是對其免疫功能仍知之甚少，尤其對于人肝臟引流淋巴結(jié)更是缺少體內(nèi)功能研究。但是在人源化小鼠模型中，腸系膜淋巴結(jié)較易重建，而其他部位如腹股溝淋巴結(jié)、腋窩淋巴結(jié)、臂淋巴和肝臟淋巴結(jié)等均難以重建，通常以少量甚至沒有人源淋巴細胞的情況出現(xiàn)，這就給淋巴結(jié)相關(guān)功能研究造成了阻礙。有研究者通過在Rag-/-γc-/-小鼠中過表達胸腺基質(zhì)淋巴細胞生成素(TSLP)幫助誘導(dǎo)LTi細胞，進而重塑淋巴結(jié)[88]。更早一些的一項研究，利用淋巴毒素β受體的激動劑可以幫助淋巴毒素α缺陷小鼠的淋巴結(jié)重塑[89]。這些基于小鼠的研究，或許對人源化小鼠的淋巴結(jié)及相關(guān)淋巴組織形成有借鑒意義。

由于當(dāng)前的人源化小鼠模型仍不完善，基于此的應(yīng)用仍以探索性為主，鮮有對臨床起到重要指導(dǎo)意義并付諸行動的研究出現(xiàn)。隨著越來越多新的細胞因子被發(fā)現(xiàn)，新的技術(shù)被采用，在接下來的研究中，免疫系統(tǒng)人源化小鼠一定會向著更加完善，更具功能的方向飛速發(fā)展，日趨完善的免疫系統(tǒng)人源化小鼠模型必將成為人類免疫系統(tǒng)生理和病理研究中的有力工具。

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[收稿2016-01-18]

(編輯倪鵬)

Construction and application of humanized immune system mice

WANGYan-Shi,TIANZhi-Gang.

InstituteofImmunology,UniversityofScience&TechnologyofChina,Hefei230027，China

[Abstract]Humanized mice have been developed for nearly 40 years though it was hard to construct available model at beginning.With more immunodeficiency of the host mice,the reconstructed humanized immune system (HIS) reached higher levels.Not only was the background of the hosts essential for the reconstruction,but also several strategies for administration or over-expression of human cytokines in the host mice achieved big breakthroughs.As the humanized mice model is becoming more improved,it has been used in various areas,such as hematopoiesis,infectious diseases,autoimmune diseases,cancer and so on.Now,human immune cells could be almost complementally biologically developed in the niche of the mice,however,due to species-specificity,the humanized immune cells were usually functionally impaired.So,what we learnt from the humanized mice could not reflect the whole immunological process in humans.Thus,the investigation for improving humanized mice model will be continued in order to provide a more promising platform for pre-clinical therapeutics.

[Key words]Immune system;Humanized mice;Infectious diseases;Tumor;Hematopoiesis;Autoimmune diseases

中圖分類號R392

文獻標志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0289-10

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.001

①本文受國家973基礎(chǔ)科學(xué)項目(No. 2013CB944902)資助。