邵 帥，戴 軍，杜 馨，王常高，林建國，蔡 ?。ê惫I(yè)大學(xué) 發(fā)酵工程教育部重點實驗室，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068）

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降解黃曲霉毒素B1菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化及降解機制

邵 帥，戴 軍，杜 馨，王常高，林建國，蔡 俊*
（湖北工業(yè)大學(xué) 發(fā)酵工程教育部重點實驗室，工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068）

摘 要：目的：鑒定一株降解黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）的霉菌HSK8，通過優(yōu)化其發(fā)酵條件提高AFB1降解率，并初步探索其降解機制。方法：通過形態(tài)學(xué)和內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）、18S rRNA和26S rRNA序列分析對該菌株進行鑒定，并通過單因素試驗對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，采用薄層層析對AFB1降解產(chǎn)物進行研究。結(jié)果：經(jīng)鑒定該株霉菌為夏孢生枝孢（Cladosporium uredinicola）。其發(fā)酵條件經(jīng)優(yōu)化確定為：發(fā)酵溫度28 ℃、裝液量75 mL/250 mL、接種量15%、發(fā)酵時間36 h、初始pH 8.0。薄層層析觀察到一個不同于AFB1的熒光斑點。結(jié)論：發(fā)酵條件優(yōu)化后，AFB1降解率從40.68%提升到68.96%，提高了69.52%；AFB1降解產(chǎn)物能在365 nm波長處發(fā)出藍色熒光。

關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素B1；鑒定；發(fā)酵條件；降解產(chǎn)物

引文格式：

邵帥,戴軍,杜馨,等.降解黃曲霉毒素B1菌株的發(fā)酵條件優(yōu)化及降解機制[J].食品科學(xué),2016,37(5):138-143.

SHAO Shuai,DAI Jun,DU Xin,et al.Optimization of fermentation condition for an AFB1-degrading strain and preliminary exploration of degradation mechanism[J].Food Science,2016,37(5):138-143.(in Chinese with English abstract)

黃曲霉毒素（aflatoxin，AF）是寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）和黃曲霉（A.fl avus）的典型次級代謝產(chǎn)物[1]，具有極強的毒性、致癌性和致畸性。除上述兩種曲霉外，模式曲霉（A.nominus）[2]、溜曲霉（A.tamarii）[3]和A.pseudotamarii[4]也被報道具有合成黃曲霉毒素的能力，但以寄生曲霉和黃曲霉為主。食品貯藏不當，極容易發(fā)霉變黃，產(chǎn)生黃曲霉毒素。在各類黃曲霉毒素中，黃曲霉毒素B1（AFB1）毒性最強，對人畜皆有很大的致癌、致突變、致畸性、肝毒性及免疫抑制性[5]。

生物法去除AFB1使得去除食品、飼料中的AFB1可在溫和的條件下進行，而同時又不影響食品和飼料中的營養(yǎng)[6]?；瘜W(xué)法和物理法的主要缺點在于要么反應(yīng)條件過于激烈、脫毒效果不理想，要么耗資大、破壞營養(yǎng)成分及適口性[7-8]，導(dǎo)致這兩類方法難以得到廣泛應(yīng)用。

自AFB1被發(fā)現(xiàn)初就有用生物法來去除AFB1的相關(guān)研究[9]。生物法基于微生物對真菌毒素或產(chǎn)毒真菌的作用從而去除AFB1，這些微生物包括酵母、絲狀真菌、細菌、藻類等，作用機制包括營養(yǎng)和空間競爭、反應(yīng)、抗生等[10]。國內(nèi)報道的降解AFB1的微生物有：假蜜環(huán)菌（Armillariella tabescens）[11]、施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）[12]、嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas sp.）[13]等；國外報道的有指孢霉（Dactylium dendroides NRRL2575）[14]、棒狀桿菌（Corynebacterium rubrum）、黑曲霉（Aspergillus niger）、綠色木霉（Trichoderma viride）、不明毛霉（Mucor ambiguus）[15]、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）[16]、紅躥紅球菌（Rhodococcus erythropolis）[17]、橙色黃桿菌（Flavobacterium aurantiacum）[9,18]等。其中一些降解AFB1的酶被分離純化和深入研究，比如黃曲霉毒素氧化酶[19-20]、錳過氧化物酶[21]、漆酶[22-23]及其他[24-25]。除微生物外，近年來還有文獻報道一些藥用植物也具有降解AFB1的能力[26-27]，Vijayanandraj等[26]研究表明植物中降解AFB1的活性物質(zhì)可能是生物堿。關(guān)于生物降解AFB1的文獻報道越來越多，這說明生物法降解AFB1成為研究的熱點。盡管如此，關(guān)于AFB1降解的應(yīng)用研究仍然很少[27-29]。

AFB1為含雙呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的香豆素衍生物，前人利用香豆素作為唯一碳源來進行AFB1降解菌的篩選已取得了良好效果[13]，湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院蔡俊教授研究室借用此方法篩得了一株絲狀真菌HSK8，經(jīng)鑒定為夏孢生枝孢（Cladosporium uredinicola），并對該株真菌的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，以期提高其對AFB1的降解率。同時對其降解機理也做了初步探索。

1　材料與方法

1.1菌種與培養(yǎng)基

一株以香豆素為唯一碳源篩得的絲狀真菌HSK8，由湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院蔡俊教授研究室提供，4 ℃保藏于土豆葡萄糖瓊脂（potato dextroseagar agar，PDA）培養(yǎng)基。

斜面培養(yǎng)基（g/L）：土豆200、葡萄糖20、瓊脂20；種子培養(yǎng)基（g/L）：土豆200、葡萄糖20，吐溫-80 1.0 mL；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖30、NaNO32.0、K2HPO4·3H2O 1.0、KCl 0.5、MgSO40.5、FeSO4·7H2O 0.01。

1.2試劑與儀器

AFB1以色列Fermentek公司；二氯甲烷（分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈（色譜級） 美國Fisher Scientific公司。

PHS-25 PH計 上海雷磁公司；3K15冷凍離心機德國Sigma公司；薄層層析（thin-layer chromatography，TLC）板 青島海洋化工廠分廠；LC-20AD高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司。

1.3方法

1.3.1菌種鑒定

菌種鑒定由中國典型培養(yǎng)物保藏中心（China Center for Type Culture Collection，CCTCC）執(zhí)行。內(nèi)容包括：微生物菌株的形態(tài)特征鑒定，內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列、26S rRNA基因序列和18S rRNA基因序列的測定與分析。

1.3.2生長曲線的測定

采用干質(zhì)量法對HSK8菌株生長曲線進行測定。將HSK8菌株接種于種子培養(yǎng)基中后，于28 ℃條件下、180 r/min恒溫培養(yǎng)，每4 h測定一次干質(zhì)量。以培養(yǎng)時間為橫坐標、菌體干質(zhì)量為縱軸繪制生長曲線。

1.3.3發(fā)酵溫度對AFB1降解率的影響

以10%的接種量將HSK8種子液轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別于25、28、31、34、37、40 ℃條件下培養(yǎng)48 h，轉(zhuǎn)速為180 r/min，裝液量為50 mL/250 mL。研究發(fā)酵溫度對AFB1降解率的影響。

1.3.4裝液量對AFB1降解率的影響

以10%的接種量將種子轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量梯度為：25、50、75、100、125 mL/250 mL。研究裝液量對AFB1降解率的影響。

1.3.5接種量對AFB1降解率的影響

接種量梯度分別為1%、3%、6%、9%、12%、15%，發(fā)酵溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，裝液量75 mL/250 mL，培養(yǎng)時間48 h。研究接種量對AFB1降解率的影響。

1.3.6發(fā)酵時間對AFB1降解率的影響

在發(fā)酵溫度28 ℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，裝液量75 mL/250 mL，接種量15%的條件下分別培養(yǎng)24、48、72、96、120、144 h。研究發(fā)酵時間對AFB1降解率的影響。

1.3.7初始發(fā)酵液pH值對AFB1降解率的影響

在上述最優(yōu)條件下，研究初始發(fā)酵液pH值對AFB1降解率的影響。初始pH值梯度設(shè)為：5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。

1.3.8AFB1降解率的測定

AFB1降解率的測定參考Teniola等[30]的方法。發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液（950 μL）與AFB1（50 μL，終質(zhì)量濃度1 μg/mL）混合，37 ℃條件下暗處反應(yīng)24 h。反應(yīng)混合液用等體積（1 mL）的二氯甲烷旋渦振蕩萃取3 次，萃取液于50 ℃條件下真空干燥。之后用1 mL色譜甲醇溶解殘余物，并用有機相濾膜（0.22 ?m）過濾，混勻進樣。以滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基（950 μL）添加AFB1（50 μL）為對照組，對照組處理同上。高效液相色譜條件為：色譜柱：C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-水（1∶3∶6，V/V）；流速：1 mL/min；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；檢測波長：370 nm和254 nm雙波長檢測。AFB1降解率按下式計算。

1.3.9TLC檢測AFB1及其降解產(chǎn)物

對上述的樣品濃縮后于TLC上點樣，點樣量以AFB1（50 ng）為準。展開劑為：氯仿-丙酮（85∶15，V/V）。展開完畢后，將薄層板自然風(fēng)干，然后于254 nm和365 nm波長紫外燈下檢測。通過與AFB1標準品及上清組進行對照，觀察實驗組AFB1殘余含量，以及其他物質(zhì)的熒光特性。以此初步探索HSK8降解AFB1的機制。

2　結(jié)果與分析

2.1菌種鑒定

圖1　HSK8形態(tài)學(xué)特征Fig.1 Morphological properties of HSK8

如圖1所示，HSK8的形態(tài)特征為：菌落粉狀，反面黑綠色。分生孢子頂生或側(cè)生，形成分枝的孢子鏈，橢圓形，淡橄欖綠色。

經(jīng)BLAST驗證，HSK8的ITS序列與夏孢生枝孢（Cladosporium uredinicola（GenBank登錄號KJ913698.1））、尖孢枝孢（Cladosporium oxysporum isolate PJ12-36（GenBank登錄號KC137278.1）、Cladosporium sp.B08（GenBank登錄號HQ696043.1））具有99%的相似度；26S rRNA基因序列與珊瑚狀枝孢菌（Cladosporium coralloides strain F-J555-1.1（GenBank登錄號JQ388759.1）、Cladosporium sp.SF-6101（GenBank登錄號KM458634.1）、Cladosporium sp.CB1（GenBank登錄號KM232484.1））也具有99%的相似度；18S rRNA序列與布氏枝孢Cladosporium bruhnei strain USN 11（GenBank登錄號JN397376.1）具有100%相似度。根據(jù)以上分析結(jié)果，HSK8菌株鑒定為夏孢生枝孢（Cladosporium uredinicola）。

2.2HSK8生長曲線

圖2　28 ℃條件下HSK8于種子培養(yǎng)基中生長曲線Fig.2 Growth curve of HSK8 in seed broth at 28 ℃

由圖2可知，HSK8在0～24 h生長非常緩慢，24 h后開始進入對數(shù)生長期，于37 h后進入穩(wěn)定期。鑒于真菌生長較慢，選擇了34 h作為菌種生長時間。

2.3發(fā)酵溫度對HSK8降解AFB1的影響

圖3　發(fā)酵溫度對AAFFBB1降解率的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on AFB1degradation efficiency

由圖3可知，25～34 ℃范圍內(nèi)AFB1降解率變化并不大，而對菌體生物量（干質(zhì)量）有顯著性影響，37 ℃和40 ℃條件下，發(fā)酵液一直處于澄清狀態(tài)，無明顯菌體生長現(xiàn)象，說明C.uredinicola不宜在較高溫度下生長。在不嚴重影響微生物生長的情況下，選擇降解率最高（40.68%）的28 ℃作為發(fā)酵溫度。

2.4裝液量對HSK8降解AFB1的影響

圖4　裝液量對AAFFBB1降解率的影響Fig.4 Effect of medium loading volume on AFB1degradation efficiency

由圖4可知，裝液量25 mL/250 mL對應(yīng)的AFB1降解率最高（44.36%），但經(jīng)過48 h的發(fā)酵，菌體都黏在瓶底，剩余可流動的液體很少，這不利于以后活性物質(zhì)的提取。從圖4還可以看到，隨著裝液量的提高，發(fā)酵液p H值不斷降低，這可能與溶氧有關(guān)。堿性環(huán)境（pH≥8.0）中AFB1的內(nèi)酯環(huán)易被打開而導(dǎo)致熒光特性消失，并形成水溶性鹽[31-32]，不利于后期的降解機制研究。為了消除發(fā)酵液pH值對C.uredinicola降解AFB1的影響，一般在與AFB1反應(yīng)前將發(fā)酵液pH值調(diào)至≤7.5（若最初≤7.5則不調(diào)節(jié)），對照組也調(diào)至相同pH值（下同）。文獻[16,26]報道的降解率雖然很高，卻常常忽略高pH值環(huán)境對AFB1的降解作用，所以在本研究中，發(fā)酵液的pH值也作為一個參考因素。圖中AFB1降解率并不隨裝液量變化而梯度變化可能也是受發(fā)酵液pH值的影響。75 mL/250 mL時所對應(yīng)的降解率與25 mL/250 mL時的相差不多，且pH值適中，綜合考慮，把75 mL/250 mL作為發(fā)酵裝液量。125 mL/250 mL裝液量所對應(yīng)的發(fā)酵液黏稠，在萃取過程中出現(xiàn)比較嚴重的乳化現(xiàn)象，嚴重影響萃取過程，也阻礙了對降解AFB1的活性物質(zhì)的進一步分析，所以該組數(shù)據(jù)不作考慮。

2.5接種量對HSK8降解AFB1的影響

圖5　接種量對AAFFBB1降解率的影響Fig.5 Effect of inoculum size on AFB1degradation efficiency

如圖5所示，接種量對AFB1降解率的影響是很明顯的，6%、12%和15%的接種量條件下降解率相對較高，且相差不多。其中以15%的接種量對應(yīng)的降解率最高，為43.14%，其發(fā)酵液pH值也相對較低，可能是因為培養(yǎng)基溶氧已達不到龐大的生物量的需求而導(dǎo)致酸性物質(zhì)的產(chǎn)生，綜合考慮，將15%選為發(fā)酵的接種量。15%接種量偏大，生產(chǎn)上不太實際，僅作為搖瓶發(fā)酵用，在后期的放大實驗中會對該因素做進一步優(yōu)化。

2.6發(fā)酵時間對HSK8降解AFB1的影響

如圖6a所示，發(fā)酵時間對AFB1的降解率影響并不大，但發(fā)酵液pH值變化明顯，基本上呈上升趨勢。在3～6 d的時候發(fā)酵液變得特別黏稠，萃取時出現(xiàn)輕微的乳化現(xiàn)象。為了考慮到乳化現(xiàn)象對AFB1萃取的影響以及發(fā)酵液pH值的控制，對3 d后的實驗結(jié)果不予考慮，同時對發(fā)酵時間進行更細化的優(yōu)化，其結(jié)果如圖6b所示，發(fā)酵36 h時對AFB1降解效果最好，達到70.31%。

圖6　發(fā)酵時間對AAFFBB1降解率的影響Fig.6 Effect of fermentation time on AFB1degradation efficiency

2.7初始pH值對HSK8降解AFB1的影響

圖7　初始pH值對AAFFBB1降解率的影響Fig.7 Effect of initial pH on AFB1degradation efficiency

如圖7所示，初始pH 8.0（不調(diào)節(jié)pH值）時AFB1降解率達到最高68.96%，與發(fā)酵時間優(yōu)化后的結(jié)果類似。還可以看出，無論初始pH值高低，發(fā)酵完畢的發(fā)酵液pH值都約為7.5，可見微生物對環(huán)境有很強的適應(yīng)性。

2.8降解機理初探

圖8　AAFFBB1的TTLLCC檢測Fig.8 Detection of AFB1by TLC

由圖8可知，實驗組在接近點樣點處有一新的熒光斑點，而AFB1斑點的亮度相對標準品則暗了許多，這說明AFB1被降解，且生成了一新的熒光物質(zhì)。另外，產(chǎn)物的遷移率（Rf＝0.038）相對AFB1（Rf＝0.381）要小很多，而所用的展開劑是弱極性的，這一點說明產(chǎn)物的極性要明顯強于AFB1。

Lee等[31]曾指出內(nèi)酯環(huán)的破壞會導(dǎo)致AFB1熒光特性的消失，也有一些文獻報道了具有熒光特性的AFB1降解產(chǎn)物，如Aflatoxicol可由Dactylium dendroides NRRL2575[14]、Corynebacterium rubrum、Aspergillus niger、Trichoderma viride、Mucor ambiguus[15]轉(zhuǎn)化AFB1得到；劉大嶺實驗組發(fā)現(xiàn)假蜜環(huán)菌胞內(nèi)酶可降解AFB1得到一具熒光特性產(chǎn)物[11]。Parker等[32]研究發(fā)現(xiàn)堿可以使AFB1熒光特性消失，而添加酸后，AFB1的熒光特性又得到恢復(fù)。因此從圖8可以判斷AFB1降解產(chǎn)物的內(nèi)酯環(huán)是完整的，并未被破壞，猜測有可能是AFB1的雙吡喃環(huán)發(fā)生改變。

3　結(jié) 論

通過形態(tài)學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育研究分析確定HSK8為夏孢生枝孢（Cladosporium uredinicola）。通過單因素試驗法優(yōu)化，其發(fā)酵條件最終確定為：裝液量75 mL/250 mL、發(fā)酵時間36 h、初始pH 8.0、接種量15%、發(fā)酵溫度28 ℃，并且AFB1降解率從40.68%提高到了68.96%，提高了69.52%。在以上這些發(fā)酵條件中，發(fā)酵時間對AFB1降解率的影響最大，特別是在發(fā)酵時間為36 h條件下，AFB1降解率有了很大的提升。最后，經(jīng)薄層層析檢測樣品發(fā)現(xiàn)了AFB1的一個降解產(chǎn)物，該產(chǎn)物能于365 nm波長處發(fā)出熒光，該特性能說明其內(nèi)酯環(huán)未被破壞，同時其相對較小的Rf值還說明該產(chǎn)物的極性要比AFB1要大。接下來HSK8降解AFB1的發(fā)酵工藝的優(yōu)化將繼續(xù)進行，進一步提高AFB1降解率。同時對AFB1降解機理的研究也將更深入地進行，為以后的應(yīng)用做鋪墊。

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E-mail：caijun@mail.hbut.edu.cn

Optimization of Fermentation Condition for an AFB1-Degrading Strain and Preliminary Exploration of Degradation Mechanism

SHAO Shuai,DAI Jun,DU Xin,WANG Changgao,LIN Jianguo,CAI Jun*
(Hubei Collaborative Innovation Center for Industrial Fermentation,Key Laboratory of Fermentation Engineering,Ministry of Education,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

Abstract:In this study,a mould isolated for degrading aflatoxin B1was reported.Morphological studies coupled with internal transcribed spacer(ITS),18S ribosomal RNA gene sequence,26S ribosomal RNA gene sequence analyses indicated that the mould was Cladosporium uredinicola.Through single-factor experiments,the fermentation conditions were determined as follows:temperature 28 ℃,medium loading volume 75 mL/250 mL,inoculumamount 15%(V/V),fermentation time 36 h,initial pH 8.0.Under these conditions,the AFB1degradation efficiency was 68.96%,a 69.52% increase over that before optimization(40.68%).On the thin-layer chromatography(TLC)plate,a new dot was found which exhibited blue fluorescence at 365 nm.

Key words:aflatoxin B1(AFB1); identification; fermentation condition; degradation product

中圖分類號：TS201.3

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）05-0138-06

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605025 10.7506/spkx1002-6630-201605025.http://www.spkx.net.cn 10.7506/spkx1002-6630-201605025.http://www.spkx.net.cn

*通信作者：蔡?。?968—），男，教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程，食品科學(xué)與工程，農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程。

作者簡介：邵帥（1991—），男，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵工程。E-mail：1458674697@qq.com

基金項目：湖北省自然科學(xué)基金重點項目（2009CDA059）

收稿日期：2015-04-08