李寧，劇建格，于宏偉，賈英民（.河北農業(yè)大學食品科技學院，河北保定0700；2.河北科技大學，河北石家莊05008）

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抗菌肽產生菌Brevibacillus laterosporus S62- 9最適發(fā)酵條件的優(yōu)化

李寧1，劇建格1，于宏偉1，賈英民2，*
（1.河北農業(yè)大學食品科技學院，河北保定071001；2.河北科技大學，河北石家莊050018）

摘要：探討側孢短芽孢桿菌S62-9的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件對產抗菌肽的影響，通過單因素試驗，確定了3個顯著因素，采用正交試驗對產抗菌肽的發(fā)酵培養(yǎng)基組成進行了優(yōu)化，并確定了最佳發(fā)酵條件。結果表明，S62-9產抗菌肽的最佳培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件：糊精1%、蛋白胨2%、CaCl20.15%、Tween-201.5%；起始pH為7.0，裝液量為40mL/300mL，以3%的接種量于37℃，250r/min搖床培養(yǎng)22h。在此條件下產抗菌肽較優(yōu)化前相比提高了59.9%。

關鍵詞：側孢短芽孢桿菌；抗菌肽；發(fā)酵條件；優(yōu)化

由細菌產生的抗菌肽是近年來人們廣泛研究的一種生物防腐劑。能夠產生抗菌肽的細菌種類繁多，將其作為天然生物防腐劑用于食品工業(yè)的多集中在乳酸鏈球菌素（nisin）[1-2]。側孢短芽孢桿菌是細菌素的一個新來源[3]，其產生的抗菌肽具有耐熱性高、抑菌譜廣等優(yōu)點，在食品保藏中具有廣闊的應用前景[4-5]，國外相關的研究報道較少[6-7]。國內有關側孢短芽孢桿菌發(fā)酵產抗菌肽的研究也愈來愈廣泛[8-10]。本試驗以營養(yǎng)肉湯（NB）為基礎培養(yǎng)基，通過單因素試驗及正交試驗，以期最終獲得側孢短芽孢桿菌S62-9產抗菌肽的最佳培養(yǎng)基組成和最佳發(fā)酵條件。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株

側孢短芽孢桿菌S62-9（Brevibacillus laterosporus S62-9）：由本實驗室保存。

1.1.2主要培養(yǎng)基

1）斜面培養(yǎng)基：蛋白胨1 %，牛肉膏0.3 %，NaCl 0.5 %，瓊脂1.5 %～2 %，pH調至7.2～7.4，121℃20 min；

2）種子培養(yǎng)基：蛋白胨1 %，牛肉膏0.3 %，NaCl 0.5 %，pH調至7.2～7.4，121℃20 min；

3）發(fā)酵培養(yǎng)基：糊精1%、蛋白胨2%、CaCl20.15%、Tween-20 1.5 %，pH調至7.2～7.4，121℃20 min。

1.2方法

1.2.1抑菌活性的測定

抗菌肽抑菌活性的測定采用瓊脂擴散法[11]。以S. aureus為指示菌，用無菌生理鹽水將其稀釋到107cfu/mL，取1 mL指示菌菌懸液置于直徑為90 mm的標準平板中，再準確吸取20 mL冷卻至40℃～50℃的營養(yǎng)瓊脂倒入板中混勻，使之形成均勻一致的指示菌平板。用直徑6 mm打孔器在指示平板上打孔，向孔中加入發(fā)酵上清液50 μL，置于37℃恒溫靜置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用游標卡尺測量透明圈直徑（mm）。

1.2.2產抗菌肽發(fā)酵條件的優(yōu)化[12-13]

利用斜面培養(yǎng)基活化菌株S62-9，37℃培養(yǎng)18 h，后接種一環(huán)于種子培養(yǎng)基中（裝液量50 mL/300 mL），37℃、200 r/min培養(yǎng)18 h制成種子液，以2 %接種發(fā)酵培養(yǎng)基進行搖瓶發(fā)酵（裝液量為50 mL/300 mL），37℃、200 r/min培養(yǎng)20 h。

1.2.2.1培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的優(yōu)化

在發(fā)酵培養(yǎng)基中，依次添加不同碳源、氮源、無機鹽以及表面活性劑，測定抑菌活性，以不加的基礎培養(yǎng)基為對照（CK），設對照的抑菌直徑為100 %。確定出單因素組分和添加量。在單因素試驗的基礎上，設糊精、蛋白胨、Tween-20和CaCl24個因素，每個因素設3個水平，進行搖瓶發(fā)酵試驗，通過L9（34）正交試驗確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，尋找最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分[11-12]。正交試驗因素水平表如下：

表1正交試驗因素水平表Table 1 Orthogonal test factor level table

1.2.2.2發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

在優(yōu)化后的培養(yǎng)基基礎上，分別選擇不用的起始pH、發(fā)酵溫度、接種量以及溶氧量，其它條件不變，進行搖瓶發(fā)酵試驗，測定抑菌活性。

2　結果與分析

2.1發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1不同碳源的影響

不同碳源對產抗菌肽的的影響如表2所示。

碳源是培養(yǎng)基的主要成分之一，適合的碳源對菌體的生長以及抑菌肽的的產生具有重要作用。分別選取2種單糖（葡萄糖、甘露醇）、3種雙糖（麥芽糖、蔗糖和乳糖）和2種多糖（糊精和殼聚糖）以1 %的添加量進行研究。由表2可以看出，甘露醇和麥芽糖對抑菌肽的產生有抑制作用，而糊精卻有利于抗菌肽的產生。

表2不同碳源對產抗菌肽的的影響Table 2 Effect of different carbon source on production of antibacterial peptide

糊精添加量對產抗菌肽的影響如圖1所示。

圖1糊精添加量對產抗菌肽的影響Fig.1 Effect of dextrin on antibacterial pepide

通過進一步試驗（圖1）可知，1%的糊精添加量抑菌活性最高。但隨添加量的增加，反而抑制了抑菌活性。

2.1.2不同氮源的影響

不同氮源對產酶的影響如表3所示。蛋白胨添加量對產抗菌肽的影響如圖2所示。

表3不同氮源對產酶的影響Table 3 Effect of different nitrogen source on production of antibacterial peptide

由表3可知，各種氮源對抗菌肽的產生均有一定的促進作用，其中蛋白胨對產抗菌肽有較大影響，而KNO3和NH4SO4對抗菌肽的產生也有一定的促進作用。圖2表明，抑菌活力隨著蛋白胨添加量的增加而升高，當增加到3.0 %時，抑菌活力有所下降。

2.1.3無機鹽的影響

無機鹽對產抗菌肽的影響如圖3所示，CaCl2對產抗菌肽的影響如圖4所示。

圖2蛋白胨添加量對產抗菌肽的影響Fig.2 Effect of peptone on antibacterial pepide

圖3無機鹽對產抗菌肽的影響Fig.3 Effect of inorganic salt on antibacterial pepide

圖4 CaCl2對產抗菌肽的影響Fig.4 Effect of CaCl2on antibacterial pepide

無機鹽在微生物的生長繁殖和代謝過程中是不可缺少的，并對細胞內外的pH，氧化還原電位和滲透壓具有調節(jié)作用。

由圖3和圖4可知，CaCl2對抗菌肽的產生有明顯的促進作用，且添加量在0.01%～0.15%時，抑菌活性隨CaCl2添加量的增加逐漸升高，0.15%濃度時抑菌活性最大。隨著CaCl2濃度繼續(xù)增加，抑菌活性反而逐漸下降。2.1.4表面活性劑的影響

在培養(yǎng)基中加入表面活性劑Tween-80、Tween-20有利于抗菌肽的產生。結果如圖5、圖6所示。

兩種表面活性劑均對產抗菌肽有促進作用，添加1.0 %的Tween-20時抑菌活性最高。作為乳化劑，Tween可降低細菌菌體與培養(yǎng)基之間的表面張力，從而改善微生物細胞膜的通透性，提高了細胞膜的通透性、刺激了抗菌肽的產生。

圖5表面活性劑對產抗菌肽影響Fig.5 Effect of surfactants on antibacterial pepide

圖6 Tween-20添加量對產抗菌肽的影響Fig.6 Effect of Tween-20 on antibacterial pepide

2.1.5培養(yǎng)基組成的正交試驗

在單因素試驗結果基礎上，設計正交試驗來綜合考慮糊精、蛋白胨、CaCl2和Tween-20對產抗菌肽的影響，見表3、表4。

表3 L9（34）正交試驗結果Table 3 Results of orthogonal test L9（34）

表4正交試驗方差分析Table 4 Variance analysis of Orthogonal test

由表3中的極差值可知，CaCl2對產抗菌肽的影響最大，其次是糊精，蛋白胨及Tween-20影響最小。產抗菌肽的最優(yōu)組合是A2B1C2D3，即1 %糊精、2 %蛋白胨、0.15 % CaCl2和1.5 % Tween-20。根據(jù)單因素及正交試驗結果，確定培養(yǎng)基的優(yōu)化配比為：1 %糊精、2 %蛋白胨、0.15 %CaCl2以及1.5 % Tween-20。

2.2發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1初始pH的影響

由于搖瓶中培養(yǎng)基的pH在發(fā)酵過程中一直在變化，不易控制。方便起見，試驗中只考慮培養(yǎng)基起始pH對產抗菌肽的影響。分別設定發(fā)酵液起始pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，固定其它發(fā)酵條件，進行搖瓶發(fā)酵試驗，測定抑菌活性。初始pH的對產抗菌肽影響如圖7所示。

圖7初始pH的對產抗菌肽影響Fig.7 Effect of initial pH on antibacterial pepide

由圖7可知，發(fā)酵培養(yǎng)基的適宜起始pH在7.0～8.0范圍內，抑菌活性較高。pH不僅會對發(fā)酵液或代謝產物產生物理化學的影響，還會對產物穩(wěn)定性產生影響。因此確定發(fā)酵液的初始pH為7.0。

2.2.2培養(yǎng)溫度的影響

溫度對微生物生長繁殖的有較大影響[14]。將發(fā)酵溫度分別設定為25、30、37℃和42℃，固定其它發(fā)酵條件，進行搖瓶發(fā)酵試驗，測定抑菌活性。培養(yǎng)溫度對產抗菌肽的影響如圖8所示。

圖8培養(yǎng)溫度對產抗菌肽的影響Fig.8 Effect of culturing temperature on antibacterial pepide

從圖8可知，菌株S62-9在37℃時抗菌肽活性最高，因此確定37℃為產抗菌肽的最適發(fā)酵溫度。

2.2.3最佳接種量的確定

接種量分別設定為1 %、2 %、3 %、4 %、5 %和6 %，固定其它發(fā)酵條件，進行搖瓶發(fā)酵試驗，12 h后測定抑菌活性。接種量對產抗菌肽的影響如圖9所示。

圖9接種量對產抗菌肽的影響Fig.9 Effect of inoculation on antibacterial pepide

由圖9可知，當接種量達到3 %時，抗菌肽的活性最高。因此，確定S62-9發(fā)酵產抗菌肽的最佳接種量為3 %。

2.2.4溶氧量的影響

適量的氧氣供給有利于菌體的生長和代謝，供氧不足或供氧過多都會嚴重地影響微生物的生理代謝。在搖瓶條件下，溶解氧的高低可以通過改變三角瓶的裝液量和搖床轉速來控制。結果如圖10和圖11。

側胞短芽孢桿菌S62-9是兼性厭氧菌，提高培養(yǎng)基中的溶氧量有利于抗菌肽的合成，鑒于搖床的承受能力，確定轉速為250 r/min，液量為40 mL/300 mL最利于抗菌肽的產生。

3　結論

圖10轉速對產抗菌肽的影響Fig.10 Effect of shaking rate on production of antibacterial peptide

圖11裝液量對產抗菌肽的影響Fig.11 Effect of liquid volume on production of antibacterial pepide

本試驗通過單因素試驗及正交試驗，獲得側胞短芽孢桿菌S62-9產抗菌肽的最佳培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件：糊精1 %、蛋白胨2 %、CaCl20.15 %、Tween-20 1.5 %；起始pH為7.0，裝液量為40 mL/300 mL，以3 %的接種量于37℃，250 r/min搖床培養(yǎng)22 h。在此條件下產抗菌肽較優(yōu)化前相比提高了59.9 %。結果表明，對發(fā)酵產抗菌肽影響最顯著的是CaCl2，當濃度在0.01 %～0.15 %時，抗菌肽活性隨添加量的增加而升高，但當濃度大于0.15 %時，抑菌活性反而下降。其原因可能是因為Ca2+是抗菌肽合成酶必不可少的輔助因子，對抗菌肽的生物合成起到調節(jié)作用。Ca2+濃度在一定范圍內能夠促進抗菌肽的合成，而高濃度Ca2+不利于抗菌肽的合成。該結果與童應凱等人的研究結果一致[15]。糊精對發(fā)酵產抗菌肽影響顯著，可能是菌株利用糊精速度緩慢，可在代謝過程中形成酸性環(huán)境；而在菌體生長后期，仍有足夠的碳源從而有利于抗菌肽的積累。本試驗中培養(yǎng)基起始pH對發(fā)酵產抗菌肽具有較大的影響，初始pH在7.0～8.0范圍時發(fā)酵液中抗菌肽的抑菌活性較高，pH過高或過低均不利于抗菌肽的產生。

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Studies on the Fermentation Conditions of Antibacterial Peptide from Brevibacillus laterosporus S62-9

LI Ning1，JU Jian-Ge1，YU Hong-Wei1，JIA Ying-min2，*
（1. College of Food Science and Technology，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，Hebei，China；2. Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，Hebei，China）

Abstract：The optimal medium compositions and the optimal cultural conditions of antibacterial peptide produced by Brevibacillus laterosporus S62-9 were discussed. Different factors were investigated such as the ingredients of medium，temperature，pH，inoculating amount and medium capacity on production of antibacterial peptide in order to optimize fermentation condition of S62-9. The optimal results were dextrin 1 %，peptone 2 %，CaCl20.15 %，Tween-20 1.5 %. Through shake-flask experiments，the best culture conditions were pH 7.0，40 mL/300 mL，250 r/min and 3 % inoculation，37℃for 22 h. Cultured in this condition，the yield of antibacterial peptide increased 59.9 % compared with initial fermentative conditions.

Key words：Brevibacillus laterosporus；antibacterial peptide；fermentation conditions；optimization

收稿日期：2014-10-27

*通信作者：賈英民（1961—），男（漢），教授，博士生導師，從事食品微生物研究。

作者簡介：李寧（1980—），女（漢），副研究員，在讀博士研究生，研究方向：食品微生物。

基金項目：河北省自然基金項目“側孢短芽孢桿菌抗菌肽對食源性金黃色葡萄球菌的抑菌機理研究”（C2014208137）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.046