湯加勇　趙　華?　何愛華　周繼昌　賈　剛　劉光芒　陳小玲　蔡景義（.四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，成都630；.深圳市慢性病防治中心分子生物學實驗室，深圳5800）

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豬硒蛋白P基因克隆、鑒定及組織mRNA相對表達量分析

湯加勇1趙華1?何愛華1周繼昌2賈剛1劉光芒1陳小玲1蔡景義1
（1.四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)研究所，成都611130；2.深圳市慢性病防治中心分子生物學實驗室，深圳518020）

摘要:本試驗旨在克隆、鑒定豬硒蛋白P基因（Sepp1），并探明其在豬不同組織中的mRNA相對表達量，為以豬為模型研究硒蛋白P（SelP）的功能奠定基礎。根據(jù)表達序列標簽（EST）序列設計引物，利用cDNA末端快速克?。?′-RACE）技術從豬肝臟總RNA中擴增出含開放閱讀框（ORF）至polyA片段，然后與EST序列進行拼接；采用熒光定量PCR技術考察Sepp1在豬9個組織中的mRNA相對表達量。結(jié)果顯示：1）擴增出共1 707 bp的片段，測序后與EST拼接獲得了2 109 bp的豬Sepp1序列，并提交至NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫，序列號為EF113596.2；該基因1 170 bp的ORF編碼區(qū)和對應的氨基酸殘基與人相應序列分別有83.72%和75.64%序列同源性，其編碼390個氨基酸，含有14個硒代半胱氨酸（Sec）殘基，分別位于第59、267、286、309、311、327、339、352、354、361、376、378、385和387位。2）Sepp1 mRNA在豬組織中廣泛分布，在肝臟中具有最高分布，依次為甲狀腺＞腎臟＞睪丸＞下丘腦＞脾臟＞垂體＞心臟＞肌肉。本試驗成功克隆、鑒定了豬Sepp1，檢測了其在豬不同組織中表達分布情況，為其進一步以豬為模型探討其功能奠定了基礎。

關鍵詞:豬；Sepp1；克?。粺晒舛縋CR

硒（Se）是哺乳動物新陳代謝所必需的基本微量元素，其在動物的健康生長、繁殖等方面起著重要作用。Se在動物體內(nèi)主要以硒蛋白的形式來發(fā)揮其多種生理功能，而硒蛋白又是一種特殊的蛋白質(zhì)，它是Se以硒代半胱氨酸（selenocysteine，Sec）形式結(jié)合到蛋白質(zhì)上的形成存在。Sec是第21種氨基酸，它由密碼子UGA編碼，而UGA在生物系統(tǒng)中是一終止密碼子，其識別需要特殊的機制。將UGA識別為指導Sec合成的密碼子，需要特殊因子的參與，如硒蛋白mRNA自身3′-非編碼區(qū)（3′-UTR）的Sec插入穩(wěn)定的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)硒代半胱氨酸插入序列（seleno cysteine insertion sequence，SECIS）［1-2］。在人體中分離得到了25種硒蛋白［3］，它們很多是作為細胞重要的抗氧化防御系統(tǒng)，起著清除氧自由基的作用，具有保護生物膜完整、解毒和增強機體免疫等功能［4］。硒蛋白P （SelP）是其中一種較為特殊的硒蛋白，它主要是由肝臟分泌到血漿中的一種含硒分泌性糖蛋白，人體血漿中約50%的Se是以SelP的形式存在［5］。高等哺乳動物中硒蛋白一般只有一個Sec殘基，而SelP是目前在高等生物中發(fā)現(xiàn)的唯一含多個Sec殘基的硒蛋白［6-7］。SelP被認為在生物體內(nèi)起轉(zhuǎn)運和儲存硒的作用［8］。

目前，雖然在人和鼠中已經(jīng)通過試驗探索了部分SelP的功能，但對SelP而言，在以人為模型的研究中由于不易獲得有效的研究材料，使得其功能及其在代謝中的作用機理尚沒有精確的科學闡明，其生物學功能也還有待于進一步的深入研究；豬與人類在營養(yǎng)代謝、生理結(jié)構(gòu)和功能、基因同源性等方面具有較高的相似性，它已成為研究人類醫(yī)學問題的一種理想模型。因此，以豬為模型研究SelP的生物學功能具有重要意義，然而豬中完整的硒蛋白P基因（Sepp1）序列還未見報道。本試驗擬克隆豬Sepp1，對其基因序列進行生物信息學分析，并對其mRNA在豬不同組織中的分布情況進行分析，為進一步以豬為模型研究SelP的生物學功能奠定基礎。

1　材料與方法

1.1主要儀器設備

Tetrad 2梯度PCR儀（Bio-Rad）、5804R臺式高速冷凍離心機（Eppendorf）、Milli Q Plus超級純水儀（Millipore）、凝膠成像系統(tǒng)GelDoc XR（Bio-Rad）、電泳儀及水平電泳槽（Bio-Rad）、Nanodrop2000微量核酸分析儀（Thermo）、7900HT熒光定量PCR儀（ABI），文中提及的其他設備、器械均為國產(chǎn)。

1.2主要試劑、克隆菌株及質(zhì)粒

主要試劑：TRIzol Reagent購自Invitrogen公司；PrimeScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、DNA分子量標準均購自大連寶生物工程有限公司；One-step SYBR Green熒光定量試劑盒購自QIAGEN公司；引物由上海生工生物公司合成；DNA凝膠回收試劑盒、快速質(zhì)粒小量提取試劑盒均購自OMEGA Bio-Tek公司。

克隆菌株及質(zhì)粒：大腸桿菌（Escherichia coli）TOP10為本實驗室保存，克隆載體pMD19-T購自大連寶生物工程有限公司。

1.3Sepp1的克隆與分析

通過NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫查詢豬表達序列標簽（expressed sequence tag，EST），獲得1段疑似Sepp1的序列片段（GenBank登錄號：CX065456.1），根據(jù)該片段設計Sepp1快速克隆的上游引物F1：ATCAACAAGAAGAAAACCAAACAGA，下游引物：3′-site adapter primer，采用cDNA末端快速克隆（3′-RACE）技術擴增含完整3′-端全長的Sepp1。采集新鮮“杜×長×大”（DLY）豬肝臟組織，采用TRIzol法提取總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和核酸測定儀檢測其質(zhì)量。以質(zhì)量合格的總RNA為模板，以Oligo（dT）- 3′-site primer為引物，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成第1鏈cDNA。然后以cDNA為模板，以F1和3′-site adapter primer引物對擴增獲得含完整開放閱讀框（ORF）至polyA的Sepp1序列。PCR反應條件為94℃變性5 min，35個循環(huán)（94℃30 s，57℃30 s，72℃2 min），然后72℃延伸10 min，4℃保存。對PCR產(chǎn)物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，對目的片段進行膠回收（具體步驟按膠回收試劑盒說明書操作），然后將回收片段連接到pMD19-T載體上（具體步驟按克隆試劑盒說明書操作），轉(zhuǎn)入TOP10感受態(tài)細胞，然后涂布含Amp 的LB平板，37℃倒置培養(yǎng)過夜。通過PCR對轉(zhuǎn)化子進行陽性鑒定，對陽性轉(zhuǎn)化子進行劃線純化并搖菌，再送上海英駿生物技術有限公司測序。利用NCBI Blast、SCEISearch 2.18等在線分析軟件對克隆的基因序列進行分析并與EST序列進行拼接，確認后提交NCBI GenBank。

1.4Sepp1在豬不同組織中的相對表達量分析

DLY公豬（體重約60 kg）6只，屠宰后新鮮收集肝臟、腎臟、肌肉、甲狀腺、垂體、下丘腦、心臟、睪丸、脾臟等組織，切割成1 g左右大小，裝入1.5 mL離心管中（無RNA酶，Axygen，USA），液氮中保存待測。采用TRIzol法提取總RNA，用于定量分析。采用ABI Primer Express 3.0軟件設計定量引物對，Sepp1定量引物對為：AACCAGAAGCGCCAGACACT和TGCTGGCATATCTCAGTTCTCAGA，看家基因Actb定量引物對為：CCCAAAGCCAACCGTGAGAA和CCACGTACATGGCTGGGGTG。引物送上海生工生物公司合成。

采用QIAGENT公司One-step SYBR Green RT-PCR Kit進行一步法實時熒光定量分析（ABI 7900HT），熒光定量PCR反應體系為10 μL，包含5.0 μL 2×SYBR Green Mix（含RT-mix）、總RNA 100 ng、上及下游引物混合液各1 μL（2 μmol/ L），每個樣重復2次。RT-PCR反應條件為95℃變性30 s，48℃反轉(zhuǎn)錄40 min，40個循環(huán)（95℃5 s，60℃34 s），溶解曲線（95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s）。本試驗采用ΔCt相對定量方法來對不同組織基因表達量進行分析，具體方法為：以看家基因Actb作為參比基因，每一個樣品中，ΔCt值是目標基因和參比基因Ct值的差值（ΔCt＝Cttarget-Ctreference），以腎臟組織中目標基因表達量為標準，假定其表達量為1，其ΔCt值定為ΔCtR，其他組織樣品中目標基因ΔCt值減去ΔCtR值的差值即為ΔΔCt（ΔCt-ΔCtR），根據(jù)基因PCR擴增是2n擴增的原理，則目標基因在其組織樣品中的相對表達量為2-ΔΔCt。數(shù)據(jù)以平均值±標準誤表示。

2　結(jié)果與分析

2.1Sepp1的克隆與分子生物學分析

以豬肝臟總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA，利用F1和3′-RACE的方法擴增獲得了1 條1 700 bp左右的目的條帶（圖1-A）。該片段經(jīng)TA克隆到pMD19-T載體后，送上海英俊公司測序確定，然后與EST序列進行拼接，獲得一段2 109 bp的cDNA序列，其含有完整的ORF和polyA結(jié)構(gòu)，經(jīng)分析確定其為豬Sepp1，然后提交NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫，序列號為：EF113596. 2。Sepp1經(jīng)SECISearch 2.18軟件分析，具有典型的硒蛋白特有的3′-UTR SECIS發(fā)夾結(jié)構(gòu)（圖1-B）。經(jīng)NCBI Blast比對分析該基因的ORF區(qū)長1 170 bp，編碼390個氨基酸，含有14個Sec殘基，分別位于第59、267、286、309、311、327、339、352、354、361、376、378、385和387位，其中大部分位于C端。人SelP（NP-005401）含10個Sec，小鼠SelP（AAA42129. 2）含10個Sec，牛SelP （BAA84781.1）含12個Sec，這幾個物種SelP的Sec大部分（90%以上）都分布在C-端［3，6-7］。采用SingalP 3.0 server在線軟件（www.cbs.dtu.dk/ services/ singalP/）對豬SelP進行信號肽預測，結(jié)果顯示其在21和22位氨基酸有可能的信號肽切割位點（圖1-C）。豬Sepp1的ORF編碼區(qū)與人、小鼠、牛Sepp1的ORF區(qū)的同源性分別為：83.72%、76.31%、87.02%。豬SelP的氨基酸序列與人、小鼠、牛SelP的氨基酸序列的同源性分別為：76.15%、68.70%、82.14%，序列比對見圖2。

圖1　豬Sepp1的克隆及基因序列分析Fig.1 Cloning and gene sequence analysis of porcine Sepp1

2.2Sepp1在豬不同組織中的相對表達量分析

采用RT-PCR對豬肝臟、腎臟、肌肉、甲狀腺、垂體、下丘腦、心臟、睪丸、脾臟共9個組織進行了Sepp1的相對表達量分析，以腎臟組織的表達量為1，其他組織相對腎臟組織的相對表達量分析結(jié)果見圖3。Sepp1在豬9個組織中均有mRNA表達，在肝臟中相對表達量最高，其次是甲狀腺；在肝臟和甲狀腺中的相對表達量均高于腎臟組織，分別是腎臟組織的6.8倍和1.7倍；在其余幾個組織中的相對表達量均低于腎臟組織，在肌肉中的相對表達量最低，只有腎臟組織中相對表達量的0.01。Sepp1在豬9個組織中的相對表達量依次是肝臟＞甲狀腺＞腎臟＞睪丸＞下丘腦＞脾臟＞垂體＞心臟＞肌肉。

圖2　豬、牛、人、小鼠SelP氨基酸序列比對Fig.2 Alignment of the amino acid sequence of SelP among cattle，human，mouse and pig

圖3　豬Sepp1在豬不同組織中的相對表達量Fig.3 The relative expression level of Sepp1 in various tissues of pigs

3　討　論

未知序列基因的克隆可根據(jù)其在不同物種間序列同源性比較，選擇同源性較高的序列片段設計兼并引物，PCR擴增獲得部分片段并測序分析，然后根據(jù)獲得的部分基因片段信息，設計引物，采用5′-RACE和3′-RACE等方法，獲得基因的完整序列。隨著豬表達序列標簽數(shù)據(jù)庫等生物信息數(shù)據(jù)庫的急劇豐富，利用在線生物信息學軟件查詢獲得目標基因EST序列片段，特別是5′-EST序列信息，在此基礎上設計引物，采用傳統(tǒng)5′-RACE和3′-RACE等方法克隆獲得基因片段并進行序列鑒定和分析，成為克隆豬硒蛋白基因的強有力手段。本試驗采用傳統(tǒng)PCR方法結(jié)合EST生物信息學分析等技術手段克隆并鑒定豬中的Sepp1，并將其提交NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫，序列號為：EF113596.2。分析豬Sepp1 CDS編碼區(qū)和人Sepp1 CDS區(qū)有83.72%的同源性。經(jīng)SECISearch 2.18軟件分析，豬Sepp1具有硒蛋白基因特有的典型3′-UTR SECIS莖-環(huán)發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

硒蛋白是一種特殊蛋白質(zhì)，是Sec以編碼密碼子UGA的形式摻入到合成的蛋白質(zhì)中，即Sec合成進入蛋白質(zhì)則是由密碼子UGA介導的翻譯行為，在沒有特殊識別因子存在時，UGA是一個終止信號；而在有特殊識別因子時，該密碼子則指導Sec合成摻入到蛋白質(zhì)分子中，故Sec被認為是第21種氨基酸［9］。SelP的氨基酸序列中含有10～17 個Sec殘基［6-7］，人和小鼠的SelP含有10個Sec殘基，牛的含12個Sec殘基。本研究中對豬Sepp1編碼的氨基酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)其含14 個Sec殘基。SelP是一種胞外糖蛋白，是血漿硒最主要的存在形式，占血漿總硒含量的50%（人）或60%（鼠）［5-6］。采用SingalP 3.0 server在線軟件（www. cbs. dtu. dk/ services/ singalP/）對豬SelP進行信號肽預測，發(fā)現(xiàn)其在21和22位氨基酸之間有可能的信號肽切割位點，說明該蛋白質(zhì)為分泌性胞外蛋白。

硒蛋白的Sec是由UGA編碼的，UGA有雙重功能，既可以編碼Sec，同時也可以起到終止密碼子的作用，使蛋白質(zhì)翻譯終止，2種作用相互競爭［10］。豬SelP存在14個UGA編碼的Sec，故理論上應該在任意一個Sec/ UGA處翻譯終止，產(chǎn)生多個亞型。已有報告發(fā)現(xiàn)大鼠SelP有至少4個亞型，蛋白質(zhì)翻譯在第2個、第4個、第7個和第10 個Sec/ UGA處終止產(chǎn)生的N端相同，C端不同的亞型［11］。人SelP至少也有2種亞型，分別是在第2個Sec處終止只含有1個Sec的小亞型和含有10個Sec的全長SelP［12］。Takahashi等［13］的研究發(fā)現(xiàn)，SelP不同亞型之間的功能不一樣，僅含1個Sec的小亞型有還原氧化型的低密度脂蛋白，起抗動脈硬化的作用，而位于C端的9個Sec則起轉(zhuǎn)運和儲存硒的作用。豬SelP是否也具有多個亞型尚不清楚。

SelP是一種富Se蛋白，它能夠結(jié)合肝素并通過肝素結(jié)合于細胞膜，被廣泛認為有運輸硒、抗氧化、結(jié)合重金屬等功能［8，14］。硒蛋白P主要表達部位是肝臟，但在其他組織部位也有表達［7］，由肝臟產(chǎn)生的SelP分泌到血漿中，而由其他組織細胞產(chǎn)生的SelP則分泌到細胞間隙［15］。本研究也發(fā)現(xiàn)豬Sepp1的mRNA在肝臟中具有最高豐度，其次為甲狀腺和腎臟。

4　結(jié)　論

①本試驗成功克隆了豬Sepp1，并提交NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫，序列號為EF113596.2。

②豬硒蛋白P為分泌性蛋白，其氨基酸序列中含有14個Sec殘基，在21和22位氨基酸位點具有可能的信號肽切割位點。

③RT-PCR結(jié)果顯示，Sepp1在豬各種組織中均有表達，其中在肝臟中具有最高的mRNA分布，隨后依次是甲狀腺＞腎臟＞睪丸＞下丘腦＞脾臟＞垂體＞心臟＞肌肉。

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（責任編輯武海龍）

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Cloning，Identification and Tissue mRNA Relative Expression Level Analysis of Porcine Selenoprotein P Gene

TANG Jiayong1ZHAO Hua1?HE Aihua1ZHOU Jichang2JIA Gang1LIU Guangmang1CHEN Xiaoling1CAI Jingyi1
（1. Animal Nutrition Institute，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China；2. Molecular Biology Lab，Shenzhen Center for chronic Disease Control，Shenzhen 518020，China）

Abstract：The objective of this experiment was to clone and identify porcine selenoprotein P gene（Sepp1），and investigate its mRNA relative expression level in porcine tissues for further study of its roles using pig models. Total RNA was extracted from pig liver for 3′-RACE with primer designed according to a Sepp1-like EST sequence，and assembled with the EST sequence. We further investigated the mRNA relative expression level in 9 tissues of pigs by the qPCR technology. The results showed as follows：1）1 707 bp cDNA fragment of the Sepp1 containing the open reading frame（ORF）till to its poly（A）tail was isolated，and a 2 109 bp full length cDNA was acquired. The sequence of porcine Sepp1 was submitted to NCBI GenBank with accession number of EF113596.2. The 1 170 bp ORF share an 83.72%identity to that of human，while their amino acid sequences had 75.64%identity. The ORF of porcine Sepp1 encode 390 amino acids，which has 14 selenocysteine（Sec）encoded by TGA codon，the Sec residues located at positions of 59，267，286，309，311，327，339，352，354，361，376，378，385 and 387 from N- to C-terminal of the mature SelP. 2）The Sepp1 mRNA was wildly expressed in various tissues and exhibited the highest mRNA distribution in liver，followed by thyroid，kidney，testis，hypothalamus，spleen，pituitary，heart and muscle. In conclusion，the porcine Sepp1 is cloned and identified；also its mRNA distribution in porcine tissues is investigated in present study，which offers an effective alternative to further study its biology roles using pig models.［Chinese Journal of Animal Nutrition，2016，28（3）：858-863］

Key words：pig；Sepp1；clone；RT-qPCR

Corresponding author?，associate professor，E-mail：zhua666@126.com

通信作者:?趙 華，副研究員，碩士生導師，E-mail：zhua666@126.com

作者簡介:湯加勇（1981—），男，四川樂山人，實驗師，碩士，研究領域為營養(yǎng)與分子生物學。E-mail：410699653@qq.com

基金項目:國家自然科學基金面上項目（30871844，31272468）；四川隆達畜牧科技有限公司項目（2015SCLD001）

收稿日期:2015-09-20

doi：10.3969/ j.issn.1006-267x.2016.03.027

中圖分類號:S828

文獻標識碼:A

文章編號:1006-267X（2016）03-0858-06