陳俊宇，索　琪，黃連弟，黃歆梅，劉　劍*，劉金莎

(1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033；2.吉林大學臨床醫(yī)學院；3.吉林大學第二醫(yī)院；4.吉林大學護理學院)

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Nrf2在阿特拉津誘導小鼠心臟氧化應激中的作用

陳俊宇1，2，索琪3，黃連弟2，黃歆梅4，劉劍3*，劉金莎1*

(1.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院，吉林 長春130033；2.吉林大學臨床醫(yī)學院；3.吉林大學第二醫(yī)院；4.吉林大學護理學院)

摘要：目的觀察阿特拉津(ATR)處理后小鼠心臟組織中過氧化產物的含量及Nrf2信號通路的活化，探討ATR導致的心臟組織氧化應激損傷及保護機制。方法以玉米油溶解ATR，將32只雌性BALB/C小鼠隨機分為0 mg/kg、5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg ATR劑量組，灌胃處理28 d，于第29 d處死小鼠取心臟組織勻漿并提取總蛋白，生化和Western blot方法檢測心肌組織中過氧化產物含量、Nrf2信號通路相關蛋白的表達及抗氧化酶活性。結果ATR暴露小鼠心肌組織中NO、MDA含量增高；Nrf2及Keap1表達降低；Ⅱ相解毒酶表達增高；SOD、CAT、GSH-PX含量增加。結論ATR暴露可誘導小鼠心臟組織活性氧生成增多，Nrf2/ARE通路激活，通過上調Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶進行抗氧化防御。

關鍵詞：阿特拉津；小鼠；心臟；氧化應激；Nrf2

(ChinJLabDiagn,2016,20:0355)

阿特拉津(atrazine,ATR )是全球使用范圍最廣的除草劑之一，化學名為2-氯-4-二乙胺基-6-異丙胺基-1，3，5-三嗪，廣泛用于包括玉米，高粱，甘蔗等農作物中控制雜草和禾本科植物[1,2]。在中國目前估計每年使用量已超過幾百萬公斤，并造成了嚴重污染。ATR具有生物蓄積作用，被美國環(huán)境保護機構規(guī)定為可能的人類致癌物，同時被廣泛認為是一種激素干擾物。最近幾年，關于ATR誘發(fā)氧化應激損傷的研究逐漸引起學者們的重視[3]。

目前，據報道在多種物種如鯽魚、大鼠等體內發(fā)現了ATR可以提高活性氧的濃度[4,5]。在肝臟、睪丸、附睪等多種組織中印證了ATR引起還原型谷胱甘肽(glutathione，GSH)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)濃度增高，抗氧化酶活性增高[6,7]，但是ATR對心臟組織是否能引起氧化應激反應的研究比較少見。

本實驗通過小鼠為期28天的ATR經口給藥，檢測心臟組織勻漿的氧化應激狀態(tài)和氧化酶活性，分析Nrf2通路的變化情況，探討ATR是否導致心臟組織的氧化應激損傷及心臟自我保護的分子機制。

1材料與方法

1.1動物分組及處理

4周齡雌性BALB/C小鼠購自吉林大學白求恩醫(yī)學院實驗動物中心，隨機分4組，每組8只。ATR以玉米油溶解，對照組以玉米油灌胃，設低、中、高三個實驗組，ATR劑量分別為5 mg·kg-1、25 mg·kg-1

和125 mg·kg-1[8]，小鼠恒定溫度、恒定濕度飼養(yǎng)于該動物中心，自由進食飲水，實驗周期28天，第29天腹主動脈取血處死小鼠，立即取心臟組織。

1.2主要試劑及儀器

ATR購于美國sigma公司，純度為99%。NO、MDA、SOD、CAT、GSH-PX生化檢測試劑盒購于南京建成有限公司。Nrf2通路相關抗體購于美國Proteintech Group公司。羊抗兔IgG單克隆抗體及ECL試劑盒購于美國promega公司。其余試劑購于美國sigma公司。凝膠成像系統(tǒng)(2500R，中國Tanon)，電泳儀(AE-8800，美國Bio-rad)，分光光度計(VIS-7220，北京第二光學儀器廠)等儀器均為吉林大學基礎醫(yī)學院前列腺疾病防治研究中心實驗室提供。

1.3生化法檢測GSH-PX、MDA的濃度及CAT、SOD、NO的活性

取心臟組織100 g加入1 ml PBS冰上研磨，制備10%心臟組織勻漿，bradford法測定蛋白濃度，-20℃保存。先后按試劑盒說明書檢測GSH-PX、MDA含量及CAT、SOD、NO活性。

1.4western blot方法檢測NQO1、Nrf2、HO1、KEAP1蛋白表達

研磨心臟組織(液氮中)，裂解蛋白，12 000 r離心40 min，上清為勻漿，定量后取30 μg，加緩沖液，99℃水浴，SDS-PAGE電泳分離蛋白，100 V轉膜1 h，封閉后TBST洗膜，封閉一抗、二抗，ECL發(fā)光法顯色拍照。β-actin為內參，GIS凝膠成像分析系統(tǒng)分析目的蛋白光密度值，計算相對光密度(A)值。1.5統(tǒng)計學分析

2結果

2.1NO、MDA含量增高

檢測心臟組織的氧化應激狀態(tài)發(fā)現：相對于對照組，低劑量組ATR(5mg/kg)的心臟組織勻漿中MDA水平增高，高劑量組ATR(125mg/kg)的心臟組織勻漿中NO增高(P<0.05)，MDA含量明顯增高(P<0.01)，提示ATR在小鼠心臟組織中誘導活性氧生成增加，見表1。

表1　心臟組織內MDA及NO含量

*：與對照組相比P<0.05

2.2Nrf2及Keap1表達變化

本實驗為進一步分析ATR誘導活性氧增加后心臟組織的保護性變化，通過western blot法檢測Keap1和Nrf2的蛋白表達情況，結果顯示實驗組 ATR處理后，5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg劑量組Nrf2的表達比對照組中降低，各實驗組的Keap1的蛋白表達均降低(P<0.05)，如圖1。

*：與對照組相比P<0.05; **：與對照組相比P<0.01

2.3Ⅱ相解毒酶表達增高

為了探討Nrf2激活后Ⅱ相解毒酶的激活情況，我們檢測了心臟組織中HO1和NQO1的表達情況。結果顯示：相對于對照組，各實驗組中ATR處理后的心臟組織中HO1含量均增加，各劑量組NQO1的含量增加，以上均具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，如圖2。

2.4SOD、CAT、GSH-PX活力變化

上述實驗發(fā)現Nrf2通路被激活，同樣為了探討心臟組織中抗氧化酶的活性，我們通過生化法檢測發(fā)現：實驗組(5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg)SOD和GSH-PX均較對照組水平增高，其中25 mg/kg和125 mg/kg 劑量組SOD明顯增高，125 mg/kg劑量組CAT活力同樣增高(P<0.05)，見表2。

*：與對照組相比P<0.05

劑量(mg/kg)SOD(u/mgprot)CAT(u/mgprot)GSH-PX(u/mgprot)052512537.24±10.6857.89±12.8*69.14±5.10**62.87±9.9**3.41±1.805.39±2.648.54±0.649.33±1.35*88.24±21.07132.73±27.65*121.59±18.54*128.58±29.71*

*：與對照組相比P<0.05;**：與對照組相比P<0.01

3討論

ATR是在地表水和地下水中常見的污染物。事實上，農業(yè)徑流和灌溉用水是ATR污染的主要來源[9]。大量的研究發(fā)現，ATR具有神經系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、內分泌系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等多系統(tǒng)毒性、氧化應激損傷及腫瘤促發(fā)作用[10-13]。最近幾年，ATR誘發(fā)多組織產生氧化應激損傷已引起研究者們的重視。本實驗ATR以每日灌胃的形式給藥4周齡雌性BALB/C鼠，以玉米油為對照組，以濃度為5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg的ATR為實驗組，飼養(yǎng)28天后處死小鼠，分析小鼠心臟組織的活性氧濃度和抗氧化防御系統(tǒng)狀態(tài)。

高濃度的活性氧(reactive oxygen species,ROS)是破壞包括脂質膜、蛋白質和核酸等細胞結構的重要介質，稱之為氧化應激損傷[14]。盡管細胞中存在抗氧化防御系統(tǒng)，可以抵消一定的ROS產生的氧化損傷，但在整個生命周期累積與氧自由基相關的DNA 、蛋白質和脂質的損傷在一些年齡依賴性疾病的發(fā)展中發(fā)揮了關鍵作用，如癌癥，動脈硬化，關節(jié)炎，神經退行性疾病和其他疾病。為了探討ATR在體內對卵巢組織的影響，本實驗檢測并分析了ATR劑量組和對照組中活性氧的水平。本實驗主要檢測了丙二醛(Malonaldehyde，MDA)和一氧化氮(NO)。NO是主要的活性氧之一，MDA代表著細胞的脂質過氧化反應水平。結果顯示：與對照組相比，5 mg/kg 的ATR給藥28天后小鼠心臟組織勻漿中MDA水平增高，在125 mg/kg的高劑量ATR作用下NO含量增高，MDA含量明顯增高，說明ATR導致小鼠發(fā)生氧化應激損傷。

細胞對抗氧化損傷的主要防御機制之一就是NF-E2相關因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factors 2，Nrf2)信號轉導通路[15]。生理狀態(tài)下，Nrf2與接頭蛋白Keap1(Kelch-like ECH-associated protein 1)相結合，使Nrf2被隔絕在細胞質。當氧化應激傳感器Keap1遇到活性氧后，Nrf2解離釋放[16]。Nrf2進入細胞核與ARE結合，參與調控抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的轉錄，保護細胞免受氧化損傷。

本實驗首先通過western blot檢測ATR作用28天后大鼠心臟組織中的Nrf2與Keap1蛋白含量，分析活性氧增多后，Nrf2信號轉導通路的激活情況。發(fā)現ATR處理后，5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg劑量組Nrf2的表達比對照組降低(P<0.05)，各實驗組的Keap1的蛋白表達均降低(P<0.05)。說明ATR可影響Nrf2信號通路的調控。

ARE的活化由Nrf2和Keap1緊密調控，Nrf2進入細胞核后，結合于ARE位點，激活下游的抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶等細胞保護基因。Ⅱ相解毒酶的主要代表是血紅素氧合酶-l(hemeoxygenase 1，HO1) 和 NAD(P)H：苯醌氧化還原酶(NAD(P)H：quinone oxidoreductase l，NQOl) 。本實驗發(fā)現不同劑量的ATR均表現為誘導心臟組織HO1和NQO1含量增加，說明Nrf2活化后，Ⅱ相解毒酶的組織含量增加。同時本實驗檢測心臟組織的抗氧化酶含量同樣發(fā)現濃度為5 mg/kg、25 mg/kg和125 mg/kg 的ATR上調SOD和GSH-PX水平，125 mg/kg劑量組中心臟組織的CAT活力同樣增高，以上說明ATR誘導下通過Nrf2/ARE通路的活化，上調了抗氧化酶的表達。

綜上，ATR誘導小鼠心臟組織中活性氧生成增多，進一步下調了Keap1的表達，激活了Nrf2/ ARE信號轉導通路，使Nrf2進入細胞核與ARE位點結合，激活ARE下游的保護性基因，使Ⅱ相解毒酶HO1和NQOl表達上調，抗氧化酶SOD、GSH-PX和CAT的活力增加。本實驗初步明確ATR作為心臟的氧化損傷因子，對心臟Nrf2/ARE抗氧化損傷防御系統(tǒng)具有強有力的誘導作用，為進一步分析ATR對心臟的損傷機制奠定了基礎。

4結論

BALB/C小鼠ATR連續(xù)給藥誘導心臟組織的活性氧生成增多，Nrf2/ARE通路被激活，通過Ⅱ相解毒酶HO1和NQOl及抗氧化酶SOD、GSH-PX和CAT表達上調進行抗氧化防御。

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The role of Nrf2 in atrazine induced oxidant response of heart in mouse

CHENJun-yu,SUOQi,HUANGLian-di,etal.

(ClinicalCollageofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the contents of peroxidation product and the activation of Nrf2 signaling pathway in heart tissue of mouses treated by atrazine (ATR),and to evaluate the mechanism of ATR on heart tissue oxidative stress injury and its protection mechanism.Methods32 female BALB/C rats were randomly divided into 4 groups,treated by a daily gavage of 0 mg/kg (control group) and 5,25 and 125 mg/kg (experiment groups) atrazine dissolved in maize oil respectively for 28 days,and the animals were sacrificed on day 29.The heart tissues were collected to homogenize and isolate the total protein.Biochemical process and Western blot were employed to detect the contents of peroxidation product,the expressions of Nrf2 signaling pathways related proteins and the activation of antioxidase in the heart tissues.ResultsAfter treated by ATR,the content of NO and MDA were increased;Nrf2 and Keap1 were decreased;Ⅱ phase detoxifying enzymes was increased;SOD,CAT,GSH-PX were increased.ConclusionAfter treated by ATR,the reactive oxygen in heart tissue was increased, and the Nrf2/ARE signaling pathway was activated to resist the oxidation through up-regulating the expression of Ⅱ phase detoxifying enzymes and antioxidase

Key words:atrazine;mouse;heart;oxidative stress;Nrf2

(收稿日期：2015-10-19)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R992

文章編號：1007-4287(2016)03-0355-04

*通訊作者