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甘草甜素抑制小鼠慢性支氣管炎模型肺組織中炎性細胞因子表達的作用機制

王宏英1,陳林2*

(1.赤峰市醫(yī)院 感染科,內(nèi)蒙古 赤峰024000；2.廣西壯族自治區(qū)江濱醫(yī)院 呼吸科,廣西 南寧530022)

慢性支氣管炎(chronic bronchitis,CB),在呼吸系統(tǒng)疾病中較為常見。吸煙、感染、環(huán)境污染及某些過敏因子等因素與其發(fā)病密切相關[1-4]。慢支的病理學特征為多種炎性細胞浸潤、充血水腫和纖維增生,并且伴有不同程度的急性或慢性炎癥反應存在于支氣管壁和氣管黏膜中。同時由于慢支患者支氣管黏膜上皮細胞中分泌大量諸如白細胞介素(interleukin-1β,IL-1β)和腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor-α,TNF-α)等細胞因子,并且TNF-α可加重炎癥反應的發(fā)生,由此我們可以推斷,抑制或減少肺組織中炎性細胞因子的產(chǎn)生,對慢性支氣管炎的發(fā)作可以起到緩解作用[5]。甘草甜素(Glycyrrhizin,GA) 藥理作用表現(xiàn)為氫化可的松樣的作用，可以抑制主要組織相容性復合體(MHC)、組織間黏附分子1(ICAM-1)、IL-1 和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的生成,誘導炎癥細胞凋亡[6]。甘草甜素可通過抑制磷脂酶 A2 和脂加氧酶的活性來抑制花生四烯酸水解,減少 PGs 合成來而發(fā)揮抗炎作用[7]。但其對慢性支氣管炎動物模型的炎性抑制作用,未見相關報道。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1造模動物選取健康成年雄性昆明種小鼠,體重(22±2) g,由吉林大學實驗動物中心提供,合格證為吉醫(yī)動準第0001號。常溫飼養(yǎng),普通飲食,自由飲水。所有實驗動物參照《中華人民共和國動物保護法》以及美國國家衛(wèi)生研究院(NIH)的相關條款。

1.1.2藥品與試劑甘草甜素呈白色結(jié)晶粉末,(MDL號：MFCD00065194,經(jīng)HPLC測定,純度≥99.6%);兔抗β-actin、兔抗IL-1β多克隆抗體、鼠抗TNF-α單克隆抗體(美國 Santa 公司);HRP-DAB底物顯色試劑盒、化學發(fā)光試劑盒均為美國 Santa 公司產(chǎn)品;硝酸纖維素膜(NC)為美國Millipore公司產(chǎn)品; 柯達感光片(北京鼎國生物技術有限公司)；蛋白預染 marker (加拿大 Fermentas 公司)；DTT、EDTA、TEMED、甘氨酸 (美國 Sigma 公司)；Tween-20 (美國 Amresco 公司)；濾紙 美國 bio-rad 公司。

1.1.3儀器冷凍離心機 28R 型 (德國 Heraeus 公司); DYCZ-24DN型雙垂直電泳槽、DYCZ-40D型半干式轉(zhuǎn)移電泳槽均為北京市六一儀器廠產(chǎn)品。低溫冰箱(MDF190 型 日本 SANYO 公司)；掃描儀(美國 Amersham 公司)；轉(zhuǎn)膜儀(TRANS-BLOT SD 型 美國 BioRad 公司)；Rea-time PCR 儀(Mx3000p 型 美國 Stratagene 公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(美國 Alpha-Innotech 公司)；多功能酶標儀(infinite M200 型 瑞士 Tecan 公司)；PCR 儀 (My cycler 美國 BIO-RAD)；激光共聚焦掃描顯微鏡 (日本 OLYMPUS 公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠CB造模、動物分組及給藥實驗動物小鼠50只,隨機進行分組,共5組,分別為：空白對照組、CB空白組、甘草甜素高劑量組、甘草甜素中劑量組及甘草甜素低劑量組。飼養(yǎng)3天后,除空白對照組外,所有模型組進行熏煙+濃氨水法干預造模4周[8]。從第5周起,甘草甜素低、中、高劑量組分別灌胃甘草甜素 2.5 mg/kg,5.0 mg/kg,10.0 mg/kg,連續(xù)用藥30天。

1.2.2Real-TimePCR檢測 引物的合成使用Beacon designer 7軟件設計IL-1β和TNF-α、以GAPDH為引物(表1),Blast檢索驗證其特異性。將各組肺組織標本Trizol試劑提取總RNA,以總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄制備cDNA庫。隨后以cDNA庫為模板,進行PCR擴增,每個反應體系中均加入GAPDH的一對引物作為PCR擴增的內(nèi)參,反應條件：95℃ 30 s,58℃ 60 s,72℃ 60 s 40個循環(huán)。

表1　Beacon designer 7軟件設計IL-1β和TNF-α、GAPDH引物

1.2.3炎性細胞因子Western blot測定將小鼠肺組織中的蛋白樣品,用BCA試劑盒進行蛋白定量。取適量樣品,加入等體積的2×上樣緩沖液混勻,在100 ℃水中煮5 min,各組取15 μg樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠(5%濃縮膠、12%分離膠)電泳分離,先用100 V電泳,待溴酚藍至濃縮膠底后改用120 V電泳,當溴酚藍距離分離膠底1 cm時停止電泳。分離的蛋白在250 mA條件下轉(zhuǎn)膜150 min,將目的蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上,用TBST洗膜,室溫下用新鮮的5%脫脂奶粉封閉作用3 h,TBST洗膜后分別加入TBST稀釋的一抗[β-actin(1∶1 000)和IL-1β或TNF-α(1∶400)]4 ℃過夜;TBST洗滌20 min×3次,加入TBST稀釋的辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶3 000)室溫孵育2 h,TBST洗滌20 min×3次,化學發(fā)光反應2 min,在暗室中感光。以β-actin作為內(nèi)參,統(tǒng)計各組蛋白與β-actin吸光度的比值。

2結(jié)果

2.1Western-Blot法檢測細胞炎性因子的表達

實驗動物空白對照組中IL-1β/β-actin吸光度比值1.031±0.08,TNF-α/β-actin吸光度比值為1.284±0.11。模型組IL-1β/β-actin及TNF-α/β-actin吸光度比分別是2.149±0.09和3.791±0.15； 模型組與空白組兩組IL-1β及TNF-α的表達明顯升高(P<0.01)。用藥組各組IL-1β和TNF-α呈現(xiàn)下降趨勢,與空白組相比具有明顯差異(P<0.01),呈現(xiàn)量效規(guī)律 (圖1)。

2.2Realtime-PCR法檢測IL-1β和TNF-α表達水平的影響

IL-1β和TNF-αmRNA在正常大鼠坐骨神經(jīng)組織少量表達,慢性支氣管炎模型中,IL-1β和TNF-αmRNA的含量上升,用藥組各個劑量IL-1β和TNF-α表達呈下降趨勢,與空白組相比具有顯著差異(P<0.01),具有一定的量效關系。 用藥組組間比較具有一定的差異性,高,中劑量組的上升量減緩且明顯低于低劑量和對照組。各用藥組經(jīng)藥物干預后IL-1β和TNF-α表達量呈下降趨勢,與空白組相比具有顯著性差異(P<0.01),具有一定量效關系(圖2)。

圖1　Real-Time PCR法檢測甘草甜素對慢支小鼠肺組織細胞中IL-1β和TNF-α表達

圖2　　Western-Blot法檢測甘草甜素對慢支小鼠肺組織細胞

TNF-αIL-1βH1.528±0.13*1.161±0.06*M2.161±0.16*1.523±0.08*L2.778±0.14*2.012±0.10*Blank3.791±0.152.149±0.09Normal1.284±0.111.031±0.08

注： 各用藥組肺組織IL-1β和TNF-α表達量呈下降趨勢,與空白組相比具有顯著差異(*P<0.01)

3討論

最新研究證實,慢性支氣管炎其病理特征為氣道和肺的實質(zhì)以及肺血管的慢性炎癥和由炎癥所導致的肺組織結(jié)構重塑。伴隨氣道炎癥的不斷進展將發(fā)展成以低氧血癥為特征癥狀的肺氣腫,從而導致血管重建引起肺動脈高壓,導致肺心病。而慢性支氣管炎以及肺氣腫,CB等病情的持續(xù)進展與肺癌的發(fā)生和吸煙關系密切[9,10]。吸煙所導致的氣道高反應性、免疫功能損害、感染次數(shù)增加是CB的主要病理機制，其所導致的炎性細胞聚集及活化后進一步加重氣道損害；動物造模環(huán)境密閉,香煙的燃燒消耗氧氣加之實驗動物本身耗氧,形成相對缺氧環(huán)境；炎癥相關細胞因子和慢性缺氧兩種因素相互促進,IL-1β和TNF-α的表達水平增高。

有研究表明,自由基可導致CB患者支氣管黏膜上皮細胞分泌大量的炎性細胞因子[13]。當發(fā)生炎性反應時,IL-1β和TNF-α存于肺支氣管上皮細胞和肺泡中,二者表達在肺臟具有互相促進作用可加重CB癥狀[14-16]。本研究通過建立小鼠慢支模型,觀察Realtime-PCR及Western-blot檢測結(jié)果提示,空白組實驗動物肺組織中IL-1β和TNF-α的表達水平呈上升趨勢,與模型組對比,具有顯著差異,由此我們發(fā)現(xiàn)慢性支氣管炎動物模型肺部炎癥反應與炎性細胞因子的高表達密切相關。實驗結(jié)果提示：對于小鼠CB模型連續(xù)給藥4周后,IL-1β和TNF-α的表達呈明顯下降趨勢。甘草甜素各用藥組與模型組相比,中、高劑量組實驗動物炎性因子IL-1β和TNF-α含量接近正常表達水平。由此我們可以推斷,甘草甜素可能通過提高肺細胞中抗氧化酶的活性來抑制脂質(zhì)過氧化對細胞膜的破壞作用,同時甘草甜素對CB肺組織中的白細胞、中性粒細胞、巨噬細胞等分泌細胞因子和炎癥介質(zhì)的表達具有明顯的抑制功效,從而起到抑制肺組織中細胞炎性反應的表達,從而達到對CB的治療作用。

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(收稿日期：2015-07-19)

文章編號：1007-4287(2016)03-0372-03

*通訊作者