王雅朦， 任　婷， 宋秀慶， 趙麗嬌， 鐘儒剛

(北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院 環(huán)境與病毒腫瘤學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京　100124)

?

·快遞論文·

N-(2-氯乙基)-N′-2-(O6-芐基-9-鳥嘌呤基)乙基-N-亞硝基脲的合成

王雅朦， 任婷， 宋秀慶， 趙麗嬌*， 鐘儒剛

(北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院 環(huán)境與病毒腫瘤學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100124)

摘要：以O(shè)6-芐基鳥嘌呤為原料，經(jīng)取代反應(yīng)和蓋布瑞爾反應(yīng)制得N9-(2-胺基)乙基-O6-芐基鳥嘌呤(4)； 4與異氰酸酯經(jīng)取代反應(yīng)和經(jīng)亞硝化反應(yīng)合成了N-(2-氯乙基)-N′-2-(O6-芐基-9-鳥嘌呤基)乙基-N-亞硝基脲(6)。 4和6為新化合物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)UV-Vis，1H NMR， (13)C NMR， IR和HR-ESI-MS表征。

關(guān)鍵詞：O6-芐基鳥嘌呤； N-(2-氯乙基)-N′-2-(O6-芐基-9-鳥嘌呤基)乙基-N-亞硝基脲； 聯(lián)合亞硝基脲； 合成； AGT抑制劑

氯乙基亞硝基脲(CENUs)是一類重要的雙功能烷化劑，在腦瘤、黑色素瘤、惡性淋巴瘤及白血病等多種癌癥的臨床治療中表現(xiàn)出良好的化療效果[1-2]。目前，臨床上常用的CENUs類藥物主要有尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀和司莫司汀等[3-4]。CENUs能夠阻礙DNA的正常復(fù)制及轉(zhuǎn)錄過程，導(dǎo)致有絲分裂不能正常進(jìn)行，最終誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[5]。然而，由于O6-烷基鳥嘌呤-DNA-烷基轉(zhuǎn)移酶(AGT)可以抑制CENUs的藥理作用，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)CENUs產(chǎn)生耐藥性[6-7]。因此，臨床上常使用AGT抑制劑來提高腫瘤細(xì)胞對(duì)CENUs的敏感性，以改善CENUs的化療效果。

O6-芐基鳥嘌呤(O6-BG， 1)是一種有效的AGT抑制劑[8]，其芐基基團(tuán)能夠被AGT轉(zhuǎn)移至活性中心的半胱氨酸殘基上，從而使AGT失活[9]。將1與CENUs聯(lián)合用藥，可提高癌細(xì)胞對(duì)CENUs的敏感性，降低藥物劑量過高所導(dǎo)致的毒副作用[10-13]。作為唯一進(jìn)入臨床研究的AGT抑制劑,1為CENUs的腫瘤化療開辟了新的領(lǐng)域。然而，其聯(lián)合化療過程中難以避免由于不合理配藥而引起的毒性增加、療效降低、理化配伍禁忌等問題。

Scheme 1

本文設(shè)計(jì)并合成了一種同時(shí)具有1和CENUs雙藥效團(tuán)的新型聯(lián)合亞硝基脲——N-(2-氯乙基)-N′-2-(O6-芐基-9-鳥嘌呤基)乙基-N-亞硝基脲(6)，以期達(dá)到提高藥物抗癌活性、降低毒副作用的目的。以1為原料，經(jīng)取代反應(yīng)和蓋布瑞爾反應(yīng)制得N9-(2-胺基)乙基-O6-芐基鳥嘌呤(4)； 4經(jīng)異氰酸酯取代反應(yīng)和亞硝化反應(yīng)合成了6(Scheme 1)。4和6為新化合物，其結(jié)構(gòu)經(jīng)UV-Vis,1H NMR，13C NMR， IR和HR-ESI-MS表征。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

Stuart SMP3型熔點(diǎn)儀(溫度未校正)；Bruker AC-P400型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Bruker Vertex 70型傅立葉變換紅外光譜儀(KBr壓片)；Bruker UHR-TOF maXis型超高分辨質(zhì)譜儀；Thermo-Finnigan SURVEYOR型高效液相色譜；TSQ Quantum Discovery MA型三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀。

1， 1,2-二溴乙烷，2-氯乙基異氰酸酯，亞硝鎓四氟硼酸鹽，百靈威公司；鄰苯二甲酰亞胺鉀，天津希恩思試劑生化科技有限公司；其余所用試劑均為分析純。

1.2合成

(1)N9-溴乙基-O6-芐基鳥嘌呤(2)的合成

在反應(yīng)瓶中加入1 0.48 g(2 mmol)和丙酮150 mL，攪拌使其溶解；加入無水碳酸鉀0.83 g，緩慢升溫至50 ℃，滴加1,2-二溴乙烷0.5 mL(6 mmol)，滴畢,反應(yīng)96 h(TLC監(jiān)測)。過濾，濾液于40 ℃減壓蒸除溶劑，所得黃色油狀物經(jīng)硅膠柱層析[梯度洗脫劑：A=V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)=1 ∶2～1 ∶4]純化得白色固體2 0.42 g，收率61%， m.p.115～116 ℃； UVλmax: 250， 284 nm;1H NMRδ: 3.89(t,J=6.0 Hz, 2H)， 4.44(t,J=6.0 Hz, 2H)， 5.50(s, 2H)， 6.54(s, 2H)， 7.33～7.52(m, 5H)， 7.91(s, 1H);13C NMRδ: 160.53, 160.21, 154.79, 140.32, 137.10, 128.97, 128.87, 128.52, 114.08, 67.35, 44.83, 31.66; IRν: 3 469(N-CH2)， 3 324(N-H)， 2 968(CH2)， 1 639(C=C)， 1 261(C-O-C)， 1 063(C-N)， 695(C-Br) cm-1; HR-ESI-MSm/z: 348.200 4{[M+H]+}。

(2) 4的合成

在圓底燒瓶中加入2 0.42 g(1.2 mmol)和無水DMF 10 mL，攪拌使其溶解；加入鄰苯二甲酰亞胺鉀0.44 g(2.4 mmol)，于70 ℃反應(yīng)8 h。于65 ℃減壓蒸除溶劑得淡黃色固體3。加入乙醇20 mL，攪拌使其溶解；加入水合肼0.3 mL(6.2 mmol)，回流(70 ℃)反應(yīng)6 h(TLC監(jiān)測)。于40 ℃減壓蒸除溶劑，剩余物用二氯甲烷15 mL溶解；抽濾，濾液于30 ℃減壓蒸除溶劑，殘余物干燥得淡黃色粉末4 0.29 g，收率84%， m.p.112～113 ℃； UVλmax: 249， 283 nm;1H NMRδ: 2.90(t,J=6.0 Hz, 2H)， 3.99(t,J=6.0 Hz, 2H)， 3.35(s, 2H)， 5.50(s, 2H)， 6.50(s, 2H)， 7.33～7.52(m, 5H)， 7.88(s, 1H);13C NMRδ: 160.47, 160.07, 154.92, 140.82, 137.20, 128.90, 128.85, 128.46, 114.23, 67.24, 46.35, 41.48; IRν: 3 467(N-CH2)， 3 320(N-H)， 2 954(CH2)， 1 613(C=C)， 1 251(C-O-C)， 1 073(C-N) cm-1; HR-ESI-MSm/z: 285.141 5{[M+H]+}。

(3)N-(2-氯乙基)-N′-2-(O6-芐基-9-鳥嘌呤基)乙基脲(5)的合成

在圓底燒瓶中加入4 0.29 g(1.0 mmol)和二氯甲烷10 mL，攪拌使其溶解；滴加2-氯乙基異氰酸酯0.2 mL(2.4 mmol)，滴畢(有白色沉淀生成)，于35 ℃反應(yīng)5 h(TLC監(jiān)測)。于30 ℃減壓蒸除溶劑得粗品5。加入二氯甲烷10 mL，攪拌使其溶解；抽濾，濾液于30 ℃減壓蒸除溶劑,殘余物干燥得白色粉末5 0.24 g，收率62%， m.p.157～158 ℃； UVλmax: 251， 283 nm;1H NMRδ: 3.28～3.58(m, 4H)， 4.06～4.12(m, 4H)， 5.50(s, 2H)， 6.26(s, 2H)， 6.48(s, 2H)， 7.34～7.51(m, 5H)， 7.76(s, 1H);13C NMRδ: 160.45, 160.09, 158.16, 154.91, 140.52, 137.19, 128.93, 128.85, 128.48, 114.22, 67.26, 44.89, 43.77, 41.88, 41.77; IRν: 3 320(N-H)， 2 960(CH2)， 1 714(C=O)， 1 626(C=C)， 1 252(C-O-C)， 1 068(C-N)， 657(C-Cl) cm-1; HR-ESI-MSm/z: 390.238 2{[M+H]+}。

(4) 6的合成

在圓底燒瓶中依次加入5 0.24 g(0.6 mmol)，丙酮4 mL和冰醋酸40 μL，攪拌使其溶解；加入亞硝化試劑NOBF40.14 g(1.2 mmol)，于0 ℃反應(yīng)2 h(TLC監(jiān)測)。減壓蒸除溶劑，剩余物經(jīng)硅膠柱層析(梯度洗脫劑：A=1 ∶2～1 ∶4)純化得淡黃色固體6 0.15 g，收率60%， m.p.176～177 ℃； UVλmax: 249, 283 nm;1H NMRδ: 3.35～3.65(m, 6H)， 4.09～4.16(m, 4H)， 5.47(s, 2H)， 6.43(s, 2H)， 6.48(s, 2H)， 7.35～7.51(m, 5H)， 7.69(s, 1H)， 8.83(t,J=5.2 Hz, 1H);13C NMRδ: 160.38, 160.14, 154.99, 153.30, 140.05, 137.12, 128.92, 128.85, 128.49, 113.92, 67.34, 49.06, 42.92, 42.48, 40.52; IRν: 3 326(N-H)， 2 959(CH2)， 1 726 (C=O)， 1 663(C=C)， 1 563(N=O)， 1 280(C-O-C)， 1 128(C-N)， 1 073(N-N)， 744(C-Cl) cm-1; HR-MSm/z: 419.111 3{[M+H]+}。

2結(jié)果與討論

2.1合成

以1為原料，經(jīng)取代反應(yīng)、蓋布瑞爾反應(yīng)、異氰酸酯取代反應(yīng)和亞硝化反應(yīng)等五步反應(yīng)合成6。其中，四步反應(yīng)均在無水條件下進(jìn)行，所用試劑需無水或預(yù)先無水處理。為了提高底物的轉(zhuǎn)化率，所加入的水合聯(lián)氨、2-氯乙基異氰酸酯和NOBF4均過量。

在2的合成過程中，反應(yīng)時(shí)間較長，且溫度不宜高于50 ℃；硅膠柱層析純化時(shí)，洗脫劑的極性逐漸增大，以加快洗滌速度。此過程中需注意：(1)由于該反應(yīng)容易發(fā)生二溴取代副反應(yīng)生成副產(chǎn)物，所以整個(gè)反應(yīng)過程的溫度應(yīng)<50 ℃，且反應(yīng)過程中需充分?jǐn)嚢?(2)該反應(yīng)容易產(chǎn)生N7位的副產(chǎn)物，在反應(yīng)過程中需嚴(yán)格控制反應(yīng)物的量，使得1與1,2-二溴乙烷的比例在1 ∶1～1 ∶3，抑制副產(chǎn)物的產(chǎn)生，并通過硅膠柱層析的方法分離純化。

在4的合成過程中，由于反應(yīng)溫度較高，應(yīng)使用回流裝置，以防止溶劑乙醇的揮發(fā)。在6的合成過程中，反應(yīng)需在冰浴中進(jìn)行。由于5中脲基的兩側(cè)均存在氮原子(N1和N3)，因此，亞硝化反應(yīng)既可能生成6(即N1-位亞硝化產(chǎn)物)，也可能生成N3-位亞硝化產(chǎn)物，甚至可能生成N1,N3-雙亞硝化產(chǎn)物。粗產(chǎn)物經(jīng)柱層析純化后，得一主產(chǎn)物A及一次產(chǎn)物B,其{[M+H]+}m/z均為419.111 3，確定為單亞硝化產(chǎn)物(若終產(chǎn)物為雙硝化產(chǎn)物，則其分子量的理論值為449)。為了進(jìn)一步確定結(jié)構(gòu)，分別對(duì)A和B進(jìn)行了二級(jí)質(zhì)譜全掃描分析，結(jié)果見圖1。由圖1(a)可見，m/z311為C-N1鍵斷裂所得碎片離子峰，表明亞硝基化發(fā)生在N1-位原子上；由圖1(b)可見，m/z314為C-N3鍵斷裂所得碎片離子峰，表明亞硝基化發(fā)生在N3-位原子上。因此，所得主產(chǎn)物A與預(yù)期產(chǎn)物6的結(jié)構(gòu)相吻合。此外，通過二級(jí)質(zhì)譜分析，未發(fā)現(xiàn)鳥嘌呤母核上被亞硝化的產(chǎn)物。

以O(shè)6-BG為原料，經(jīng)五步反應(yīng)合成了一種新型聯(lián)合亞硝基脲——N-(2-氯乙基)-N′-2-(O6-芐基-9-鳥嘌呤基)乙基-N-亞硝基脲。該方法操作簡單，收率良好，是一種實(shí)用的合成方法，為進(jìn)一步探索和開發(fā)高效低毒的新型雙官能團(tuán)烷化劑奠定基礎(chǔ)。

m/z

參考文獻(xiàn)

[1]Larsson A K, Shokeer A, Mannervik B. Molecular evolution of theta-class glutathione transferase for enhanced activity with the anticancer drug 1,3-bis-(2- chloroethyl)-1-nitrosourea and other alkylating agents[J].Arch Biochem Biophys,2010,497(1-2):28-34.

[2]Das D, Preet R, Mohapatra P,etal. 1,3-Bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea enhances the inhibitory effect of resveratrol on 5-fluorouracil sensitive/resistant colon cancer cells[J].World J Gastroenterol,2013,19(42):7374-7388.

[3]Walbert T, Gilbert M R, Groves M D,etal. Combination of 6-thioguanine,capecitabine and celecoxib with temozolomide or lomustine for recurrent high-grade glioma[J].J Neuro-oncol,2011,102(2):273-280.

[4]Watanabe S, Sato S, Nagase S,etal. Chemotherapeutic choice of ranimustine or nimustine on the basis of regional polyamine levels in rat brain[J].Method Find Exp Clin Pharmacol,2008,30(2):115-120.

[5]Rajski S R, Williams R M. DNA cross-Linking agents as antitumor drugs[J].Chem Rev,1998,98(8):2723-2796.

[6]Yang C, Garcia K, He C. Damage detection and base flipping in direct DNA alkylationrepair[J].Chem Bio Chem,2009,10(3):417-423.

[7]Lamb K L, Liu Y, Ishiguro K,etal. Tumor-associated mutations inO6-methylguanine DNA-methyltransferase(MGMT) reduce DNA repair functionality[J].Mol Carcinogen,2014,53(3):201-210.

[8]Pegg A E, Boosalis M, Samson L,etal. Mechanism of inactivation of humanO6-alkylguanine-DNA alkyltransferase byO6-benzylguanine[J].Biochemistry,1993,32(45):11998-12006.

[9]Pegg A E. Multifaceted roles of alkyltransferase and related proteins in DNA repair,DNA damage,resistance to chemotherapy,and research tools[J].Chem Res Toxicol,2011,24(5):618-639.

[10]Dolan M E, Pegg A E.O6-Benzylguanine and its role in chemotherapy[J].Clin Cancer Res,1997,3(6):837-847.

[11]Moschel R C, Mcdougall M G, Dolan M E,etal. Structural features of substituted purine derivatives compatible with depletion of humanO6-alkylguanine-DNA alkyltransferase[J].J Med Chem,1992,35:4486-4491.

[12]Dolan M E, Mitchell R B, Mummert C,etal. Effect ofO6-benzylguanine analogues on sensitivity of human tumor cells to the cytotoxic effects of alkylating agents[J].Cancer Res,1991,51(13):3367-3372.

[13]Schold S C Jr, Kokkinakis D M, Rudy J L,etal. Treatment of human brain tumor xenografts withO6-benzyl-2′-deoxyguanosine and BCNU[J].Cancer Res,1996,56(9):2076-2081.

Synthesis ofN-(2-chloroethyl)-N′-2-(O6-benzyl-9-guanineyl)ethyl-N-nitrosourea

WANG Ya-meng,REN Ting,SONG Xiu-qing,ZHAO Li-jiao*,ZHONG Ru-gang

(Beijing Key Laboratory of Environmental and Viral Oncology, College of Life Science and Bioengineering,Beijing University of Technology, Beijing 100124, China)

Abstract：N9-(2-amino)ethyl-O6-benzylguanine(4) was obtained through substitution and Gabriel reaction, using O6-benzylguanine as the starting material. N-(2-chloroethyl)-N′-2-(O6-benzyl-9-guanine)ethyl-N-nitrosourea(6) was synthesized by isocyanate substitution of 4, followed by a nitrosation reaction. 4 and 6 were new compounds. And their structures were characterized by UV-Vis,1H NMR, (13)C NMR, IR and HR-ESI-MS.

Keywords：O6-benzylguanine; N-(2-chloroethyl)-N′-2-(O6-benzyl-9-guanine)ethyl-N-nitrosourea; combi-nitrosourea; synthesis; AGT inhibitor

中圖分類號(hào)：O626； O621.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.03.15104

作者簡介：王雅朦(1990-)，女，蒙古族，北京人，碩士研究生，主要從事藥物合成研究。 E-mail: wangyameng@emails.bjut.edu.cn通信聯(lián)系人： 趙麗嬌，教授， Tel. 010-67391667， E-mail: zhaolijiao@bjut.edu.cn

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21277001)

收稿日期：2015-03-24；

修訂日期：2016-03-01