李江凌　陳曉暉　劉　銳　王秋實(shí)　龔建軍　曾　凱　廖黨金　高　榮　呂學(xué)斌

（1四川畜牧科學(xué)研究院，四川成都610066；2四川大學(xué)，四川成都610063）

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藏豬、長(zhǎng)白豬腸道微生物菌群的定量分析及比較研究

李江凌1陳曉暉1劉銳1王秋實(shí)1龔建軍1曾凱1廖黨金1高榮2呂學(xué)斌1

（1四川畜牧科學(xué)研究院，四川成都610066；2四川大學(xué)，四川成都610063）

摘要：為研究藏豬腸道微生物菌群特性及耐粗飼特性，本試驗(yàn)選擇生長(zhǎng)發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)狀況正常的藏豬和長(zhǎng)白豬各18頭，隨機(jī)分成兩組即常規(guī)組和粗糧組，每組9頭。分別于0、30、60日齡采集腸道內(nèi)容物，應(yīng)用熒光定量PCR的方法對(duì)腸道中四種細(xì)菌（大腸桿菌、乳酸桿菌、芽孢桿菌、梭狀桿菌）開展定量分析及對(duì)比研究，結(jié)果顯示：在出生時(shí)，藏豬、長(zhǎng)白豬腸道內(nèi)四種細(xì)菌的數(shù)量差異不顯著；隨著生長(zhǎng)發(fā)育，斷奶后藏豬腸道內(nèi)大腸桿菌、乳酸桿菌數(shù)量顯著多于長(zhǎng)白豬（＜0.05），梭狀桿菌數(shù)量極顯著多于長(zhǎng)白豬（＜0.01），芽孢桿菌屬兩個(gè)豬種之間無明顯差異。飼喂粗飼料后，藏豬腸道內(nèi)梭狀桿菌、芽孢桿菌數(shù)量極顯著增加（＜0.01），而長(zhǎng)白豬乳酸桿菌數(shù)量顯著增加（＜0.05）。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究藏豬、長(zhǎng)白豬耐粗飼性狀差異的遺傳機(jī)理提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：藏豬；長(zhǎng)白豬；耐粗飼性能；腸道微生物；熒光定量PCR

耐粗飼性狀主要指生豬對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)的要求低，可以適應(yīng)低能量的飼料來源，比如青綠飼料、纖維素含量高的飼料等，耐粗飼的豬品種對(duì)纖維類物質(zhì)的利用率較高，可以充分利用各種來源的飼料資源，緩解農(nóng)業(yè)資源的供需矛盾。生豬耐粗飼的能力與其腸道特定的微生態(tài)區(qū)系密切相關(guān)。動(dòng)物腸道相對(duì)穩(wěn)定的微生態(tài)系統(tǒng)和腸道微生物間的相互穩(wěn)定作用促進(jìn)了特定動(dòng)物復(fù)雜共生體的共同進(jìn)化，并發(fā)揮了促進(jìn)動(dòng)物正常生長(zhǎng)發(fā)育和健康的重要作用。因此，開展對(duì)藏豬、長(zhǎng)白豬腸道微生物區(qū)系的研究，對(duì)于生豬耐粗性狀的遺傳機(jī)理研究尤為關(guān)鍵。

過去研究動(dòng)物體內(nèi)的腸道微生物通常應(yīng)用傳統(tǒng)離體培養(yǎng)方法，這種方法的主要缺點(diǎn)是對(duì)于嚴(yán)格厭氧菌和一些尚未得到鑒定的細(xì)菌不能被正常分離純化，在離體培養(yǎng)狀態(tài)下的微生物在形態(tài)和特征與在腸道自然狀態(tài)下均存在顯著差異。隨著科技的發(fā)展，目前普遍應(yīng)用不依賴微生物培養(yǎng)的分子生物技術(shù)研究動(dòng)物胃腸道微生物區(qū)系，主要方法有應(yīng)用16SrDNA、DGGE、定量PCR等，可研究土壤、動(dòng)物腸道、食品微生物等的群落變化。

本試驗(yàn)應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)研究藏豬、長(zhǎng)白豬腸道中四種細(xì)菌（大腸桿菌、乳酸桿菌、芽孢桿菌、梭狀桿菌）的多樣性，分析常規(guī)飼養(yǎng)及粗糧飼養(yǎng)條件下藏豬、長(zhǎng)白豬四種細(xì)菌數(shù)量的變化情況，為揭示藏豬的耐粗性狀提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物

選擇生長(zhǎng)發(fā)育和營(yíng)養(yǎng)狀況正常的0月齡藏豬、長(zhǎng)白豬各18頭，試驗(yàn)前驅(qū)蟲、去勢(shì)，并免疫相關(guān)疫苗。

1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì)

藏豬和長(zhǎng)白豬隨機(jī)分成兩組即常規(guī)組和粗糧組，每組9頭。參照地方豬、外種豬的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)本場(chǎng)豬群情況，以玉米和大豆為主要原料配制育肥豬基礎(chǔ)日糧，基礎(chǔ)日糧均為粉料。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組飼喂由90%的基礎(chǔ)飼糧和10%的菊苣混合而成（菊苣切碎后與飼料混勻）的粗糧。

1.3樣品采集及DNA提取

分別于0、30、60日齡屠宰豬只后采集結(jié)腸部位內(nèi)容物，-20℃保存，取回實(shí)驗(yàn)室后用天根公司TIANamp Stool DNA Kit糞便基因組DNA提取總DNA，-20℃保存待用。

1.4腸道內(nèi)常見菌群的定量檢測(cè)

1.4.1熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

對(duì)腸道內(nèi)常見的大腸桿菌、乳酸桿菌、芽孢桿菌、梭狀桿菌等4種菌群做定量分析。設(shè)計(jì)引物熒光定量PCR反應(yīng)的條件如表1～3。

表1　熒光定量PCR所用引物及退火溫度

表2　實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系設(shè)置

表3　PGR擴(kuò)增反應(yīng)程序

采用常規(guī)方法分別完成了熒光定量標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒構(gòu)建、建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍的確定。

（1）使用E.Z.N.A.TM plasmid Mini Kit I提取經(jīng)測(cè)序鑒定的陽性克隆重組質(zhì)粒，然后用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定重組質(zhì)粒DNA的濃度，并按如下公式換算成拷貝數(shù)。

DNA(copy)=50(μg/mL)× 10-6×OD×NA(阿佛加德羅常數(shù)：6.02×1023分子/摩爾)/660(堿基對(duì)平均分子量)×擴(kuò)增堿基數(shù)

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作是在Real-time PCR的檢測(cè)范圍內(nèi)，以各濃度梯度起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為X軸，相應(yīng)的Ct值為Y軸作回歸曲線，得出Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的表達(dá)式。

1.4.2樣品的Real-time PCR測(cè)定

對(duì)上述重組質(zhì)粒DNA構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和各DNA樣品進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。每個(gè)樣品作3次重復(fù)，采用TaqMan Real-Time PCR Premix Kit試劑盒于BiONEER公司ExicyclerTM96實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行絕對(duì)定量PCR分析。熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件同標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。根據(jù)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相應(yīng)的Ct值，計(jì)算出各個(gè)樣品中4種菌群的拷貝數(shù)和每克糞便中的數(shù)量。

1.5數(shù)據(jù)整理分析

Real-time PCR結(jié)果采用SPSS 21.0進(jìn)行顯著性分析。

2　結(jié)果分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線及方程

四個(gè)菌屬實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，重復(fù)管Ct值之差在0.5以內(nèi)，以1×109～1×104拷貝數(shù)/μL標(biāo)準(zhǔn)品陽性模板進(jìn)行熒光定量，連續(xù)10倍梯度濃度之間Ct值之差在3.33左右；以初始標(biāo)準(zhǔn)品模板量的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，分別繪制出4種菌屬的熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，結(jié)果見表4。

表4　4個(gè)菌屬的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.2實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)藏豬和長(zhǎng)白豬糞便中4種菌群

使用已經(jīng)建立起來的標(biāo)準(zhǔn)曲線和方法對(duì)試驗(yàn)藏豬、長(zhǎng)白豬糞便DNA中4種菌屬數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)。由于兩樣本的總體方差d2均未知，且為小樣本，用t檢驗(yàn)，結(jié)果如表5。

表5　常規(guī)組腸道內(nèi)容物樣品中幾種菌群數(shù)量?。╨og拷貝數(shù)//gg樣品）

表5結(jié)果顯示，在出生時(shí)，藏豬、長(zhǎng)白豬腸道內(nèi)四種細(xì)菌的數(shù)量差異不顯著。隨著生長(zhǎng)發(fā)育，斷奶后藏豬腸道內(nèi)大腸桿菌、乳酸桿菌顯著多于長(zhǎng)白豬（＜0.05）；藏豬腸道內(nèi)梭狀桿菌明顯多于長(zhǎng)白豬，30日齡時(shí)差異顯著（＜0.05），60日齡時(shí)差異極顯著（＜0.01）；芽孢桿菌屬兩個(gè)豬種之間無明顯差異。

2.3添加粗飼料后腸道微生物菌群的變化

表6結(jié)果顯示，（1）添加粗飼料后，藏豬腸道內(nèi)梭狀桿菌、芽孢桿菌數(shù)量明顯增加，與長(zhǎng)白豬腸道內(nèi)梭狀桿菌、芽孢桿菌相比，差異極顯著（＜0.01）；（2）添加粗飼料后，長(zhǎng)白豬乳酸桿菌數(shù)量增加顯著，而藏豬腸道內(nèi)乳酸桿菌數(shù)量下降，差異顯著（＜0.05）；（3）添加粗飼料后，兩個(gè)豬種之間的大腸桿菌數(shù)量無明顯差別。

3　小結(jié)與討論

在哺乳動(dòng)物中，腸道微生物在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取、上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、免疫方面起著重要作用。豬的腸道中寄存著大量的微生物，復(fù)雜的腸道微生物區(qū)系對(duì)于腸道健康有著重要貢獻(xiàn)[1]。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們?cè)桨l(fā)了解動(dòng)物的腸道微生物群落，腸道微生物不僅是動(dòng)物的一個(gè)重要代謝“器官”，而且也是動(dòng)物自身重要的免疫“器官”，研究表明腸道有益微生物區(qū)系的建立對(duì)于避免仔豬腹瀉和刺激腸道的生長(zhǎng)、發(fā)育具有重要作用[2]。仔豬從剛出生到斷奶后，直至體成熟，其腸道微生物的組成受到日糧、環(huán)境及宿主等因素共同影響，形成了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的多樣化的微生物生態(tài)環(huán)境[3]。腸道微生物與宿主在漫長(zhǎng)的協(xié)同進(jìn)化過程中，相互選擇并形成了一個(gè)相互依賴和相互制約的共生生態(tài)系統(tǒng)，腸道微生物是腸道生態(tài)系統(tǒng)的組成成員，并與宿主構(gòu)成了一個(gè)統(tǒng)一的整體[4]。然而，腸道微生物區(qū)系的建立是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，受品種、環(huán)境、發(fā)育階段、消化道各部位組織結(jié)構(gòu)和生理特性不同的影響，導(dǎo)致體內(nèi)微生物菌落的數(shù)量、組成有所差異[5]。因此研究腸道微生物菌群的發(fā)育變化過程對(duì)于研究豬種的消化能力形成、以及對(duì)于粗飼料分解、營(yíng)養(yǎng)成分吸收等具有重要意義。

我國的地方豬種普遍有耐粗飼的特性，肖文萍等[6]采用PCR/DGGE技術(shù)和16SrDNA序列分析方法，研究了普通豬、藏豬的腸道細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)豬腸道微生物區(qū)系的品種間差異大于品種內(nèi)差異[6]。本研究結(jié)果顯示：在出生時(shí)，藏豬、長(zhǎng)白豬腸道內(nèi)四種細(xì)菌的數(shù)量差異不顯著；隨著生長(zhǎng)發(fā)育，斷奶后藏豬大腸桿菌、乳酸桿菌數(shù)量顯著多于長(zhǎng)白豬（＜0.05），藏豬梭狀桿菌極顯著地多于長(zhǎng)白豬（＜0.01），芽孢桿菌屬兩個(gè)豬種之間無明顯差異。在添加粗飼料后，藏豬腸道內(nèi)梭狀桿菌、芽孢桿菌數(shù)量明顯增加，與長(zhǎng)白豬腸道內(nèi)梭狀桿菌、芽孢桿菌相比，差異極顯著（＜0.01）；（2）添加粗飼料后，長(zhǎng)白豬乳酸桿菌數(shù)量增加顯著，藏豬腸道內(nèi)乳酸桿菌數(shù)量降低，兩者之間差異顯著（＜0.05）；（3）兩個(gè)豬種之間的大腸桿菌無明顯差異。這些結(jié)果說明：不同品種的仔豬之間，腸道優(yōu)勢(shì)菌群呈現(xiàn)較大差異，腸道微生物群落差異與品種有直接相關(guān)。隨著生豬日齡的增長(zhǎng)，豬斷奶及其對(duì)飼料（如增加粗飼料）與環(huán)境的適應(yīng)，各品種豬糞樣中微生物菌群發(fā)生了很大的變化，這些結(jié)果與楊柳等對(duì)地方品種榮昌豬[7]的研究結(jié)果類似。

表6　常規(guī)組、粗糧組腸道內(nèi)容物樣品中幾種菌群數(shù)量?。╨og拷貝數(shù)//gg樣品）

4　結(jié)論

本研究結(jié)果表明，在出生時(shí)，藏豬、長(zhǎng)白豬腸道內(nèi)四種細(xì)菌的數(shù)量差異不顯著；隨著生長(zhǎng)發(fā)育，斷奶后藏豬腸道內(nèi)大腸桿菌、乳酸桿菌數(shù)量顯著多于長(zhǎng)白豬（＜0.05）；梭狀桿菌數(shù)量極顯著多于長(zhǎng)白豬（＜0.01）；芽孢桿菌屬兩個(gè)豬種之間無明顯差異。添加粗飼料后，藏豬腸道內(nèi)梭狀桿菌、芽孢桿菌數(shù)量極顯著增加（＜0.01）；長(zhǎng)白豬腸道內(nèi)乳酸桿菌數(shù)量顯著增加（＜0.05），兩個(gè)豬種之間大腸桿菌無明顯差異。可見，藏豬的耐粗性狀與腸道內(nèi)梭狀桿菌、芽孢桿菌增加相關(guān)。

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作者簡(jiǎn)介：李江凌（1972-），女，研究員，從事動(dòng)物遺傳學(xué)研究，E-mail：yujiang1465@126.com

基金項(xiàng)目：四川省應(yīng)用基礎(chǔ)項(xiàng)目（2013JY0112）；四川省財(cái)政基礎(chǔ)科研項(xiàng)目；四川省生豬創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目

收稿日期：2016-01-20

中圖分類號(hào)：S828；S813.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1673-4645(2016)03-0061-04