施光正　馬麗娟　趙海軍

(浙江醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，浙江　杭州　310053)

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成年大鼠心室肌細(xì)胞的急性分離方法

施光正馬麗娟趙海軍1

(浙江醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，浙江杭州310053)

〔摘要〕目的介紹一種新型的成年大鼠心肌細(xì)胞的急性分離方法。方法麻醉大鼠后快速取心臟，為心臟先循環(huán)灌流無鈣臺氏液，后循環(huán)灌流酶液，酶解完成后取左心室，迅速置于含0.5 mg/ml BSA的KB液(恒溫37℃)中拉碎，吹打數(shù)次后離心，去上清，溫育在含0.5 mg/ml BSA的KB溶液中35 min，梯度復(fù)鈣。結(jié)果首次分離細(xì)胞存活率在80%~90%，復(fù)鈣完成仍有40%~50%的細(xì)胞維持桿狀，橫紋清晰且90%以上細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)。結(jié)論通過該方法可獲得穩(wěn)定、高比例的存活心肌細(xì)胞，能夠?yàn)槌赡甏笫笮募〖?xì)胞原代培養(yǎng)及電生理學(xué)研究提供高品質(zhì)細(xì)胞。

〔關(guān)鍵詞〕心肌細(xì)胞； 急性分離； Langendorff灌流

能夠得到高活性的心肌細(xì)胞是心肌細(xì)胞培養(yǎng)和電生理研究的基礎(chǔ)，隨著酶解法的不斷完善與創(chuàng)新，酶解法成為獲取成年大鼠心肌細(xì)胞的主要方式，但迄今為止尚未有完全統(tǒng)一的分離方法，本文主要闡述筆者的實(shí)驗(yàn)方法。

1材料及方法

1.1材料Wistar雄性大鼠20只，220~250 g，由上海斯特萊動(dòng)物責(zé)任有限公司提供(動(dòng)物許可證號SCXK〔滬〕2012-0002)。

1.2主要試劑Ⅱ型膠原酶(C6885)、XⅣ型蛋白酶(P5147)、BSA(A1933)、Taurine(T0625-100G)、G-Lutamic acid(G8415)NaH2PO4、KOH Sigma公司NaCl、KCl、Glucose、KH2PO4、MgCl2國產(chǎn)分析純HEPES、EGTA BIOSHARP。

1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器恒溫水浴槽：JKI-MP-501A；超純水：MILLI-Q；倒置鏡：LeicaDMI3000B；Langendorff：自制灌流裝置。

1.4溶液配方無鈣臺式液:HEPES 15 mmol/L、MgCl21 mmol/L、NaCl 135 mmol/L、KCl 4 mmol/L、NaH2PO41 mmol/L、Glucose 10 mmol/L(NaOH調(diào)整溶液pH值為7.4)，KB液： L-Glutamic acid 50.3 mmol/L、KCl 39.97 mmol/L、KH2PO425 mmol/L、Taurine 19.98 mmol/L、MgCl23 mmol/L、KOH 80 mmol/L、EGTA 0.53 mmol/L、HEPES 10.7 mmol/L、Glucose 10.09 mmol/L(KOH調(diào)整溶液pH值為7.4)，酶液:0.16%蛋白酶、0.1%膠原酶、0.5 mg/ml胎牛血清(BSA，溶于無鈣臺氏液)

1.5實(shí)驗(yàn)步驟

1.5.1實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備利用恒溫水浴槽、蛇形玻璃罐、60 ml注射器、普通輸液管道及調(diào)控開關(guān)搭建Langendorff灌流裝置，如圖1。75%乙醇溶液灌洗裝置3~5次，再使用去離子水灌洗3~5次。所有灌流液氧飽和15 min。

圖1　灌流裝置示意圖

1.5.2細(xì)胞分離斷頭處死大鼠，剪刀沿胸骨左右兩側(cè)剪開，用止血鉗夾住劍突，胸廓前翻，充分暴露胸腔，剪斷上下腔靜脈，自主動(dòng)脈根部5 mm處剪斷主動(dòng)脈。迅速將心臟置入4℃無鈣臺氏液中，修剪心臟，適當(dāng)除去周圍組織，清洗血液，迅速將心臟懸掛至Langendorff灌流裝置上，3號絲線結(jié)扎固定，進(jìn)行主動(dòng)脈逆灌流，修建剩余的心臟周圍組織。先灌流無鈣臺式液3~5 min沖洗心臟剩余血液，無鈣臺式液剩余5 ml時(shí)加入5 ml酶液預(yù)灌流，待灌流液剩余5 ml繼續(xù)加入酶液，舍棄前10 ml的酶液，剩余酶液循環(huán)灌流12~15 min，酶解完成時(shí)心臟外觀主體呈現(xiàn)黃色和淡紅色，略微顯白，膨大30%~50%。取下心臟，在恒溫37℃含0.5 mg/ml BSA的KB液中剪取左心室，使用兩個(gè)鑷子拉碎心臟組織，吹打數(shù)次后300 r/min離心3 min，靜止3~5 min，去上清液，加入含0.5 mg/ml BSA的KB溶液里溫育30~40 min。等待復(fù)鈣。

1.5.3梯度復(fù)鈣分0.25、 0.5和1.0 mmol/L 3個(gè)梯度復(fù)鈣。去上清液，加入無鈣臺氏液溶液和50 μl 0.1 mol/L CaCl2溶液，細(xì)胞懸液總體積在20 ml，靜置10 min。重去上清液10 ml，加入10 ml 無鈣臺式液和75 μl 0.1 mol/L CaCl2溶液，靜置10 min。重去上清液10 ml，加入10 ml無鈣臺式液和150 μl CaCl2溶液。最終溶液中鈣離子濃度為1.0 mmol/L，將細(xì)胞懸液保存在4℃冰箱中或?qū)⒓?xì)胞保存在4℃KB液中待用。

2結(jié)果

首次分離下的細(xì)胞在鏡下觀察，80%~85%的細(xì)胞呈長桿狀，細(xì)胞膜完整，橫紋清晰，透光度高，部分細(xì)胞核可見，與周圍邊界清晰且90%以上處于靜止?fàn)顟B(tài)，少部分處于收縮狀或已收縮成團(tuán)狀(圖2)。復(fù)鈣后，40%~50%的細(xì)胞維持桿狀，90%以上的桿狀細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，胞膜完整邊緣清楚，表面光滑，立體感強(qiáng)，橫紋清晰，透光度好(圖3)。

圖2　首次分離心肌細(xì)胞(×100)

圖3　梯度復(fù)鈣后的心肌細(xì)胞(×100)

3討論

Langendorff裝置分離心肌細(xì)胞的方法技術(shù)已經(jīng)很成熟，采用酶解法獲取成年大鼠的心肌細(xì)胞分離已長達(dá)40多年的時(shí)間，但迄今為止，尚未建立統(tǒng)一的方法，這是因?yàn)槌赡甏笫笮募〖?xì)胞的急性分離方法受到了諸多因素的影響，如懸掛心臟速度、酶的選擇、酶濃度和酶解時(shí)間、復(fù)鈣濃度與方法、水pH、灌流液pH、環(huán)境溫度、灌流液溫度和大鼠狀態(tài)等〔1〕。

筆者認(rèn)為其難點(diǎn)之一在于對心臟酶解完成時(shí)間的判斷，消化時(shí)間過長，酶會破壞細(xì)胞的細(xì)胞膜，造成不可逆的損傷；消化未完全，細(xì)胞產(chǎn)量將會降低，且靠強(qiáng)烈的吹打分離細(xì)胞對細(xì)胞膜也有一定的破壞性。有文章通過恒流灌流心臟來觀察灌流壓變化的方法來確定心臟的消化終點(diǎn)〔2〕,但不同的酶與大鼠之間的個(gè)體差異會使得心臟的消化終止壓不能完全統(tǒng)一，且操作較為復(fù)雜。鈣反?，F(xiàn)象是此實(shí)驗(yàn)的另一大難點(diǎn)，高比例的存活心肌細(xì)胞在無鈣的環(huán)境下被分離出來，但是細(xì)胞再次進(jìn)入生理濃度的鈣溶液時(shí)，會誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放大量的Ca2+，使胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度迅速升高，抑制了心肌細(xì)胞舒張過程中必需的鈣離子和肌鈣蛋白的解離，細(xì)胞表現(xiàn)為不停地收縮，逐漸變圓，失去原有結(jié)構(gòu)，最終呈團(tuán)狀〔3，4〕。雖然在經(jīng)過復(fù)鈣后心肌細(xì)胞存活比例會減小部分，但最終得到的心肌細(xì)胞的質(zhì)量會顯著提高。

針對以上的問題，本實(shí)驗(yàn)從以下幾個(gè)方面展開討論：①熟練性：從大鼠開胸到將心臟懸掛上Langendorff裝置的整個(gè)過程需要操作者有較高的熟練性，整個(gè)過程最好在2 min內(nèi)完成。②灌流裝置的搭建：本文搭建的灌流裝置主要依靠重力勢差作為灌流動(dòng)力，制作較為簡便且經(jīng)濟(jì)，通過控制普通輸液器的開關(guān)或保持灌流管內(nèi)液面的高度，可以控制灌流液的流速。整個(gè)裝置的高度在80~100 cm，可以放置在超凈臺中完成，使分離下的細(xì)胞處于無菌環(huán)境，因此分離的心肌細(xì)胞適用于原代培養(yǎng)。③灌流液的選擇：選用無鈣臺氏液灌流時(shí)，保證了細(xì)胞的無鈣環(huán)境，同時(shí)對橋粒和閏盤的分離也起一定的作用〔5〕。本實(shí)驗(yàn)選用Sigma公司的Ⅱ型膠原酶，濃度為0.1%，聯(lián)合使用Sigma公司0.16%的蛋白酶和0.5 mg/ml的BSA配置成酶液30 ml循環(huán)灌流，酶液中的BSA具有細(xì)胞保護(hù)修復(fù)作用〔4〕，適宜的BSA在增加心肌細(xì)胞對酶耐受性的同時(shí)也能保護(hù)蛋白水解酶對膠原酶的水解，因此在酶液中加入BSA可以保護(hù)心肌細(xì)胞，也能夠保障酶的活性。④消化終點(diǎn)的判斷：本實(shí)驗(yàn)通過觀察心臟顏色與心臟大小來判斷心臟消化終點(diǎn)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)中的觀察，灌流酶液前心臟呈紅色，質(zhì)地較軟。灌流酶液后心臟開始膨脹，質(zhì)地變硬，紅色逐漸退去，黃色漸漸明顯，在消化終點(diǎn)時(shí)心臟膨大30%~50%，心臟主體呈現(xiàn)黃色和淡紅色，略微顯白，此時(shí)應(yīng)立即終止酶的消化。⑤復(fù)鈣：據(jù)報(bào)道心肌細(xì)胞的活性狀態(tài)是直接導(dǎo)致“鈣反?！钡母驹?，而實(shí)驗(yàn)的每一步都可能影響到心肌細(xì)胞的狀態(tài)。⑥消化組織在KB液中完全拉碎后，應(yīng)使用光滑圓頭的滴管小心吹打，注意不可混入空氣產(chǎn)生泡沫，且吹打次數(shù)不可過多，6~8次即可。另外，KB液溫度保持37℃，且加入0.5 mg/ml BSA可以提升細(xì)胞的鈣耐受性。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在消化組織吹打離心后，將分離細(xì)胞溫育在含0.5 mg/ml BSA的KB液中30~40 min有利于修復(fù)細(xì)胞膜，保持細(xì)胞膜的完整，但不可時(shí)間過長，使得BSA粘覆在細(xì)胞膜表面，影響其后的電生理學(xué)實(shí)驗(yàn)〔6〕。未復(fù)鈣細(xì)胞在用于電生理研究時(shí)細(xì)胞直接接觸含鈣電極外液，復(fù)鈣過程太快導(dǎo)致大部分的細(xì)胞死亡，而四步法復(fù)鈣時(shí)間較長〔7〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過三步法“0.25、 0.5 、1.0 mmol/L 3個(gè)梯度復(fù)鈣”后細(xì)胞狀態(tài)較好，能夠減輕“鈣反?！?，提高存活細(xì)胞比例。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-09-26修回〕

(編輯袁左鳴)

〔中圖分類號〕R332

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)07-1578-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.018

通訊作者：趙海軍(1977-)，男，副教授，主要從事毒理學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：浙江省教育廳項(xiàng)目(Y201226128，201330225，JA15815)

1廈門醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校

第一作者：施光正(1996-)，男，在讀本科生，主要從事心肌細(xì)胞電生理學(xué)研究。