肖　鋒　張曉偉　張　杰　胡建功

( 泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 泰安　271000 )

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Gli-1蛋白在食管鱗癌組織的表達(dá)及其臨床意義*

肖鋒張曉偉張杰胡建功

( 泰山醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，山東 泰安271000 )

摘要：目的檢測(cè)食管鱗癌及其癌旁組織和食管正常組織的中Gli-1的表達(dá)水平，并探究其與食管鱗癌的臨床及病理因素之間的關(guān)系。方法免疫組化法測(cè)36例食管癌及其癌旁組織和9例食管正常組織Gli-1表達(dá)水平。結(jié)果Gli-1在食管鱗癌陽(yáng)性表達(dá)率為55.6%；癌旁為13.9%；食管正常組織中為11.1%；組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)； Gli-1在癌旁和正常組織中均顯著低于鱗癌(P< 0.05)；Gli-1在癌旁和正常食管中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.0 5)。其陽(yáng)性表達(dá)率在Ⅰ~Ⅱ期遠(yuǎn)低于Ⅲ~Ⅳ期(P< 0.05)，T1~T2遠(yuǎn)低于T3~T4 (P< 0.05)，無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移的遠(yuǎn)低于轉(zhuǎn)移( P< 0.05)。但其表達(dá)與年齡、性別、腫瘤位置、直徑及分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05)。結(jié)論Gli-1參與了食管鱗癌的發(fā)展進(jìn)程，高表達(dá)的Gli-1可能是促進(jìn)食管鱗癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的因素之一。

關(guān)鍵詞：HH信號(hào)；食管鱗狀細(xì)胞癌；Gli-1蛋白；免疫組化

當(dāng)前，食管癌(esophageal carcinoma，EC)在世界上較為常見(jiàn)。僅2008年，就有超過(guò)484000例患者被診斷為食管癌[1]。食管癌在全球范圍內(nèi)惡性腫瘤引起死亡的主要原因中占第六位，并且其發(fā)病率正迅速增加[2]。我國(guó)常見(jiàn)的組織類型是食管鱗狀細(xì)胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)。食管癌的早期診斷率低，死亡率極高。當(dāng)前，已經(jīng)證實(shí)Hedgehog(HH)信號(hào)通路是在胚胎發(fā)育的過(guò)程中對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)、增值、生存和分化起到關(guān)鍵的作用，此通路與很多腫瘤的發(fā)生、發(fā)展(包括侵襲和轉(zhuǎn)移)密切相關(guān)[3]。本實(shí)驗(yàn)用免疫組化法檢測(cè)HH通路中的Gli-1蛋白在ESCC及癌旁組織和正常食管組織中表達(dá)水平，探討其與ESCC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，以期為ESCC的臨床診斷及其治療提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料及試劑

收集我院胸外科2012年11月~2013年11月手術(shù)切除的食管鱗癌(ESCC)及與其對(duì)應(yīng)的癌旁組織(距癌灶5 cm以上)各36例，另胃鏡下取正常食管組織9例。全部患者均經(jīng)病理證實(shí)為食管鱗癌，癌旁組織為非癌組織，術(shù)前未經(jīng)放化療及其他免疫治療，亦無(wú)其他部位的腫瘤?；颊吣挲g在40~76歲，≥55歲有26例，<55歲有10例；男20例，女16例；腫瘤直徑≤3 cm 有21例，>3 cm 有15 例；中高分化29例，低分化7例；中下段癌30例，上段癌6例；按2002年制定的第六版TNM標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類[4]：Ⅰ和Ⅱ期共13例，Ⅲ和 Ⅳ期共23例；T1和T2期共16例，T3和T4期共20例；淋巴轉(zhuǎn)移21例，無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移15例。所有的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本均經(jīng)先經(jīng)過(guò)10%的甲醛固定，后經(jīng)石蠟包埋，切片本實(shí)驗(yàn)采用的厚度為5 μm，用來(lái)做HE和免疫組化。兔抗人Gli-1多克隆抗體(Gli-1，sc-20687)購(gòu)買于SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司，即用型免疫組化EliVisionTMsuper試劑盒(鼠/兔)購(gòu)買于福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2方法

嚴(yán)格按照即用型免疫組化EliVisionTMsuper試劑盒(鼠/兔)(試劑A為放大劑，試劑B為多聚酶結(jié)合物)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。切片脫蠟及水化，高溫高壓修復(fù)，依次加Gli-1抗體(1∶100)、試劑A、試劑B、 新鮮配制的DAB， 經(jīng)蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化，自來(lái)水沖洗，碳酸鋰返藍(lán)，梯度酒精脫水干燥，(二甲苯透明)，中性樹(shù)膠封固，顯微鏡下觀察結(jié)果。用已知陽(yáng)性切片為陽(yáng)性對(duì)照， PBS 代替Gli-1抗體為空白對(duì)照。

1.3結(jié)果判定

參照Yoshikawa等[5]方法①由兩名病理科專家在不知其臨床病理特征下，顯微鏡觀察細(xì)胞數(shù)。②把胞核和(或)胞漿中黃或棕黃色顆粒細(xì)胞視為陽(yáng)性染色。③基于特定的百分比腫瘤細(xì)胞染色：無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)或陽(yáng)性染色< 5%為(-),≥5%而<35%為(+),≥35%而< 65%為(++),≥65%則(+++)。而本實(shí)驗(yàn)采取了適當(dāng)修改。定義陽(yáng)性反應(yīng)或陽(yáng)性染色< 5%為陰性表達(dá)，≥5%統(tǒng)稱為陽(yáng)性表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)為差異有顯著性。

2結(jié)果

2.1Gli-1蛋白在食管癌組織、癌旁組織及食管正常組織的的表達(dá)

Gli-1蛋白主要在胞核/胞漿中表達(dá)。其陽(yáng)性表達(dá)率在食管鱗癌組織為55.6%(20/36) (表1) ；癌旁組織為13.9%(5/36) (表1)；正常食管粘膜組織為11.1% (1/9)(表1)。組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.384,P<0.05，表1)。癌旁組織和正常粘膜組織顯著低于食管鱗癌(P<0.05，表1)；癌旁組織與正常粘膜組織間的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1) 。

表1　Gli-1在食管癌組織、癌旁組織及食管正常組織的表達(dá)

2.2食管鱗癌(ESCC)中Gli-1的表達(dá)與臨床及病理特征之間的關(guān)系

由表2得知其表達(dá)與年齡、性別、分化程度、腫瘤直徑和位置無(wú)關(guān)(P>0.05)。其陽(yáng)性表達(dá)率在Ⅰ和Ⅱ期顯著低于Ⅲ和Ⅳ期(P<0.05)；在T1和T2期顯著低于T3和T4期(P<0.05)；無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移者顯著低于轉(zhuǎn)移者(P<0.05)。當(dāng)P<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2　食管鱗癌組織中Gli-1蛋白的表達(dá)

3討論

到目前為止，食管癌的發(fā)生機(jī)制沒(méi)有完全被闡明，但是越來(lái)越的研究表明食管癌的形成是一多涉及眾多方面因素的過(guò)程，其中也涉及了信號(hào)通路等方面的問(wèn)題。近幾年來(lái)研究較多的HH信號(hào)通路(Shh等Hh配體蛋白、Ptch等跨膜蛋白、Gli-1等下游轉(zhuǎn)錄因子)發(fā)現(xiàn)在不少腫瘤中被激活。其中一種常見(jiàn)的激活方式是Shh或者Hh配體與Ptch1或者Ptch2受體結(jié)合，誘導(dǎo)Smo基因的激活，接著下游轉(zhuǎn)錄因子Gli-1等的激活。其Gli蛋白在此通路中是很重要的蛋白，不但反映HH通路的活化，而且與基因的轉(zhuǎn)錄密切相關(guān)，其作用可謂是承上啟下。

Ma X等[6]發(fā)現(xiàn)在食管癌中Gli-1的表達(dá)是增高的，暗示HH信號(hào)在食管癌中普遍激活。Mori Y等[7]用不同的辦法對(duì)食管鱗癌中Gli-1水平檢測(cè)，RT-PCR揭示在34種細(xì)胞株中超過(guò)百分之九十存在其表達(dá)；免疫組化揭示有一半人ESCC標(biāo)本Gli-1呈陽(yáng)性表達(dá)，其陽(yáng)性表達(dá)在無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移和T1~T2期明顯低于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和T3~T4期，其表達(dá)與癌的位置及分化度無(wú)關(guān)；亦發(fā)現(xiàn)其越高表達(dá)，患者預(yù)后就越差。Yanai K等[8]發(fā)現(xiàn)Gli-1的表達(dá)水平與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，一種HH信號(hào)的抑制劑—環(huán)杷明在體內(nèi)或者體外都能抑制胃癌細(xì)胞的成長(zhǎng)，這從側(cè)面證明了HH信號(hào)與胃癌的發(fā)生關(guān)系密切。Jeng W J等[9]對(duì)手術(shù)后肝細(xì)胞癌Gli進(jìn)行研究，RT-PCR結(jié)果示Gli-1mRNA在50例中全表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤的大小及TNM分期有關(guān)，亦其越高表達(dá)，總的存活時(shí)間越差。Ding Y等[10]對(duì)結(jié)腸癌中Gli-1進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果示79.2%的結(jié)腸癌中存在高表達(dá)，其表達(dá)與淋巴的轉(zhuǎn)移和T分期有關(guān)，亦揭示其高表達(dá)提示不良的預(yù)后。

Gli-1在消化系腫瘤存在不同程度表達(dá)上調(diào)，反映了HH信號(hào)通路的激活在腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中是較為普遍的，同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)Gli-1的異常的表達(dá)與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了Gli-1在癌旁組織和正常粘膜組織的表達(dá)低于食管鱗癌；亦發(fā)現(xiàn)其表達(dá)與食管鱗癌的臨床分期和T期有關(guān)，且隨著分期的增高，其表達(dá)也升高，揭示其參與了食管鱗癌的浸潤(rùn)生長(zhǎng)；本實(shí)驗(yàn)亦揭示其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，其表達(dá)越高，越易發(fā)生轉(zhuǎn)移。同時(shí)暗示在Gli-1蛋白表達(dá)越高，腫瘤具有的侵襲能力就相對(duì)的越強(qiáng)，預(yù)后就相對(duì)較差。使得檢測(cè)Gli-1蛋白在食管鱗癌(ESCC)中的表達(dá)來(lái)判斷患者的預(yù)后的程度提供了一定的理論依據(jù)。

綜上所述， Gli-1參與了食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展，與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)；檢測(cè)其在食管鱗癌的表達(dá)可有助于判斷其惡性程度，也可為臨床的診斷及其治療提供一定的理論參考依據(jù)。

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The expression and clinical significance of gli-1 protein in esophageal squamous cell carcinoma

XIAOFengZHANGXiao-weiZHANGJieHUJian-gong

(Affiliated Hospital of Taishan Medical College，Taian 271000，China)

Abstract:Objective: Objective To observe the expression of Gli-1 in esophageal squamous cell carcinoma ( ESCC), tumor-adjacent tissues and normal tissues ,and to investigate the expression and clinical significance of Gli-1 protein in esophageal squamous cell carcinoma. Methods： The expression of Gli-1 protein was detected by immunohistochemistry in 36 cases ESCC, tumor-adjacent tissues and 9 cases normal esophageal tissues. Results： In esophageal squamous cell carcinoma, tumor-adjacent tissues and normal tissues, the positive expression rate of Gli-1 were 55.6%，13.9%，and 11.1% respectively, there was significant difference between group ( P< 0. 05). The expression of Gli-1 protein in tumor-adjacent and normal tissues was lower than that in esophageal squamous cell carcinoma. The difference was statistically significant (P <0.05). No difference was found between tumor-adjacent and normal tissues about the expression of Gli-1 protein(P>0.05).The expression of Gli-1was not only much lower in T1~T2 than that in T3~T4 ( P< 0. 05) but also much lower in clinical stage Ⅰ~Ⅱ than that in Ⅲ~Ⅳ ( P< 0.05). The expression of Gli-1 was higher in nodal metastases group than that in group without nodal metastases ( P< 0.05). No correlations were found between Gli-1 protein and age, gender, tumor location, Tumor diameter, the degree of differentiation(P>0.05). Conclusions： Up-regulation of Gli-1 might be involved in the development of esophageal squamous cell carcinoma,and it might play a promoting role in the invasion and metastasis of esophageal squamous cell carcinoma.

Key words:esophageal squamous cell carcinoma; Gli-1; immunohistochemistry

(收稿日期2015-11-10)

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2016.02.001

中圖分類號(hào)：R571

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-7115(2016)02-0121-03

通訊作者：胡建功，jghu@tsmc.edu.cn。

*作者簡(jiǎn)介：肖鋒(1986—)，男，山東泰安人，住院醫(yī)師，碩士，主要從事臨床消化內(nèi)科工作。