李　歌,　王珊珊*,　丁文珺,　?！〖?　姚倩祺

1.沈陽工學(xué)院生命工程學(xué)院, 遼寧 撫順 113122;

2.遼寧省撫順市獸藥飼料監(jiān)察所, 遼寧 撫順 113122

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柚皮中黃酮類化合物提取工藝研究

李歌1,王珊珊1*,丁文珺1,牛佳1,姚倩祺2

1.沈陽工學(xué)院生命工程學(xué)院, 遼寧 撫順 113122;

2.遼寧省撫順市獸藥飼料監(jiān)察所, 遼寧 撫順 113122

摘要：柚子的果皮中含有果膠、膳食纖維、香精油、多糖、黃酮類化合物等多種活性成分，具有很高的藥用和食用價值。通過對柚子皮資源進(jìn)行合理的開發(fā)利用和深加工，不僅能夠減少環(huán)境污染，還能創(chuàng)造較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。采用超聲波法對柚皮中黃酮類物質(zhì)進(jìn)行提取，研究了柚皮中黃酮提取過程中的影響因素，并通過單因素試驗和正交試驗法以及驗證試驗對提取過程中的工藝參數(shù)進(jìn)行探究，最終確定最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%，超聲時間30 min，浸泡溫度60℃，料液比1∶25，在此條件下，柚皮中黃酮得率為4.63%。

關(guān)鍵詞：柚子皮；黃酮類化合物；超聲波法

柚子為蕓香科(Rutaceae)柑橘亞科柑橘屬(Citrus)植物。它的果實碩大，果皮比較光滑，一般呈綠色或淡黃色。 研究發(fā)現(xiàn)，柚子的外皮(最外層黃色的厚皮)和內(nèi)皮(直接與果肉接觸的薄層)中含有多種活性成分，如膳食纖維、果膠、香精油、色素和黃酮類化合物等，它們具有較高的藥用以及保健價值，同時還具有防治和殺滅害蟲等作用[1]。此外，中醫(yī)還認(rèn)為，柚皮還具有止咳、理氣、抗炎、化痰和止癢等功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，柚皮提取物具有抗氧化、抗微生物、降血糖、降血壓、抗癌、抑酶、抗衰老和預(yù)防動脈粥樣硬化等作用[2]。目前的食品加工業(yè)中，柚子皮多被作為廢棄物丟棄，不僅造成了資源浪費，還對生態(tài)環(huán)境造成了污染。對柚子皮進(jìn)行深加工處理，既能減少環(huán)境污染，又有極高的經(jīng)濟(jì)價值和社會價值。

黃酮類化合物常見的提取方法有熱水提取法、有機(jī)溶劑提取法、微波提取法和超聲提取法。黃酮易溶于水，利用這一特性可采用熱水浸提法來提取，熱水提取法的優(yōu)點是所需設(shè)備少、所需其他試劑少、節(jié)約實驗成本。但是由于水的極性比較大,提取同時容易把易溶于水的其他成分提取出來，如：糖類、 蛋白質(zhì)等，此外，熱水提取法時間較長。實驗室經(jīng)常采用的方法是有機(jī)溶劑提取法，常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮等。其中乙醇提取是最主要的提取方法。它的優(yōu)點是黃酮的含量和提取率均較高，與熱水提取法相比所需時間短，且后續(xù)操作較簡單，如過濾、回收溶劑等。但乙醇提取所需試劑用量較大、成本較高、操作相對復(fù)雜。微波法是指在微波反應(yīng)器中用合適的試劑從植物、動物及礦物質(zhì)等組織中提取各種成分的技術(shù)。微波法的優(yōu)點是：所需時間短、溶劑用量較少、黃酮提取率高，是一種真正的短時高效的方法。但目前仍處于試驗階段，是一種新興的技術(shù)手段，具有良好的發(fā)展前景和巨大的應(yīng)用潛力。

超聲波法提取黃酮類化合物，是目前比較新的方法在玉米、銀杏葉、紫蘇等植物中都有應(yīng)用[3~5]。超聲波是一種彈性機(jī)械振動波，超聲提取法是利用超聲波的空化作用、機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)等加速胞內(nèi)有效物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散和溶解，從而顯著提高提取效率的提取方法。超聲波提取法的優(yōu)勢明顯，主要體現(xiàn)在黃酮得率高、所需時間短、節(jié)約成本和環(huán)境污染小等方面[6]。因此超聲波法在黃酮類化合物提取中，是一種快速、高效、節(jié)能的新型提取工藝。綜合以上工藝，本研究采用超聲波法研究了在柚子皮中提取黃酮類物質(zhì)的最佳工藝條件，以期為柚皮的加工利用提供參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

蜜柚(文旦柚)為市售。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉等購自中國藥品生物制品檢驗所。

1.2實驗方法

1.2.1柚子皮中黃酮的提取將柚子皮的黃色果皮與白色果皮分開，留下黃色果皮，然后在65℃條件下烘干5 h，烘干后用粉碎機(jī)磨成粉末狀，過篩，把柚子皮粉末放入干燥箱中備用。用柚子皮粉末提取黃酮的工藝流程為：乙醇浸泡→超聲波處理→抽濾→定容→取樣測吸光值→計算提取率[7]。

1.2.2蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，加入甲醇進(jìn)行溶解，定容至100 mL，充分溶解，制成0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。

取7支干凈的試管，進(jìn)行編號，準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，然后分別加入5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖晃使其充分混勻，靜置6 min后再分別加入10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，靜置6 min[2]，最后分別加入10% NaOH溶液10 mL,并用蒸餾水定容至25 mL,定容后再靜置15 min，在510 nm波長下，以空白為對照，測定吸光值。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)來繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線[6]。

圖1　蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Standard curve of rutin.

由圖1得y=8.864 3x-0.003(R2=0.991)，測定黃酮提取液的吸光值后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得公式計算出黃酮提取液的濃度。然后計算黃酮得率：

黃酮得率(%)=提取液濃度(mg/mL)×稀釋倍數(shù)×體積(mL)/樣品干重×1 000

1.2.3單因素實驗選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸泡溫度、料液比和超聲時間[8,9]為參數(shù)，每個參數(shù)設(shè)5個水平(表1)，采用單因素正交試驗[10,11]在各組合條件下分別測定黃酮的得率以確定最佳工藝條件。

2結(jié)果與分析

2.1乙醇最佳體積分?jǐn)?shù)的確定

從圖2可以看出，其他條件不變的情況下，在不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)下，柚皮中黃酮類化合物的吸光值在50%~70%的范圍內(nèi)逐漸增大，這可能是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加減少了柚子皮與溶劑間黃酮類化合物的濃度差，從而減少了柚子皮中黃酮類化合物的殘留量，所以吸光值和黃酮得率在不斷增大。然而，乙醇體積分?jǐn)?shù)在70%~90%的范圍內(nèi)，柚皮中黃酮類化合物的吸光值隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增大而逐漸減小，這可能是由于在乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%后，在一定的提取條件下，柚子皮中的黃酮類化合物析出基本已達(dá)到平衡，即使繼續(xù)增大乙醇的體積分?jǐn)?shù)，也沒有增大吸光值和黃酮得率。所以，可以初步確定超聲波提取的最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

表1　柚子皮中黃酮類化合物因素水平

圖2　黃酮得率與乙醇體積分?jǐn)?shù)的關(guān)系曲線Fig.2　Relation curve between flavonoids extraction ratio and ethanol volume fraction.

2.2最佳浸泡溫度的確定

由圖3可以看出，隨著溫度的升高，黃酮得率從40℃到60℃范圍內(nèi)逐漸增大，溶劑分子運動加快，所以吸光值和黃酮得率在不斷增大，而在60℃到80℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，溶劑揮發(fā)的速度也在不斷加快，從而導(dǎo)致柚皮中黃酮類化合物的吸光值和黃酮得率隨溫度升高而逐漸減小。所以，可以初步確定超聲波提取的最佳浸泡溫度為60℃。

圖3　黃酮得率與浸泡溫度的關(guān)系曲線Fig.3　Relation curve between flavonoids extraction ratio and soaking temperature.

2.3最佳料液比的確定

從圖4可以看出，在一定的條件下，隨著料液比的增加，吸光值和黃酮的得率都在增大，當(dāng)料液比為1∶25時，吸光值和黃酮的得率都為最大，然而，當(dāng)料液比繼續(xù)增大至1∶30，吸光值和黃酮的得率反而減小。所以，可以初步確定超聲波提取的最佳料液比為1∶25。

圖4　黃酮得率與料液比的關(guān)系曲線Fig.4　Relation curve between flavonoids extraction ratio and material liquid ratio.

2.4最佳超聲時間的確定

從圖5可以看出，在一定條件下，20~40 min內(nèi)，隨著超聲時間的延長，吸光值也在逐漸增大，這是由于黃酮類化合物的析出是一個溶劑破壞細(xì)胞壁析出最后達(dá)到平衡的過程。所以，提取黃酮類化合物需要一定的時間，然而，當(dāng)超聲時間繼續(xù)延長時，吸光值和黃酮得率不再增加反而有減小的趨勢，這有可能是因為超聲時間太長，會有一小部分的乙醇揮發(fā)，從而使沸點增大，進(jìn)一步的破壞了某些黃酮類化合物。所以，可以初步確定超聲波提取的最佳超聲時間為30 min。

圖5　黃酮得率與超聲時間的關(guān)系曲線Fig.5　Relation curve between flavonoids extraction ratio and ultrasonic time.

2.5正交實驗

在柚子皮中提取黃酮類化合物的過程中，各個影響因素會相互產(chǎn)生交叉影響，所以，綜合考慮超聲波提取法的影響因素，再依照單因素的試驗結(jié)果，確定以乙醇的體積分?jǐn)?shù)、浸泡溫度、料液比和超聲時間4個參數(shù)進(jìn)行4因素5水平的正交試驗設(shè)計，并以吸光值及黃酮類化合物的得率作為判斷標(biāo)準(zhǔn)，從而確定最佳的工藝條件。

表2　正交實驗結(jié)果

從極差分析可知：影響因子按從大到小順序為：C>A>B>D，即料液比對黃酮得率影響最大，其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸泡溫度，影響最小的是超聲時間。通過正交實驗的結(jié)果可以看出，超聲波法提取柚子皮中黃酮類化合物的最佳工藝條件為：A4B3C4D3，即以體積分?jǐn)?shù)為 80%的乙醇作為溶劑，溫度為60℃，料液比為1∶25，超聲時間為30 min。

2.6驗證實驗

通過上述的正交實驗，初步確定了超聲波法提取柚子皮中黃酮類化合物的最佳工藝條件，在2.5得出的最佳工藝條件下進(jìn)行3次驗證實驗，以確保實驗的準(zhǔn)確性。稱取3份柚皮粉，每份3 g，按照單因素的試驗方法進(jìn)行測定吸光值，結(jié)果得出在最佳條件下，黃酮的得率為4.63%。

3討論

國內(nèi)外學(xué)者對柚皮總黃酮的提取也有一定的研究。戴玉綿等[12]應(yīng)用微波法從柚皮中提取黃酮類化合物的最佳工藝條件是浸提時間5 min,乙醇濃度80%，料液比 1∶25，在此工藝條件下，黃酮得率為0.884 mg/g。此外，于桂香等[13]應(yīng)用超聲法從柚皮中提取黃酮類化合物的最佳工藝條件是乙醇濃度81%，提取溫度61.5℃，超聲時間45 min。在此工藝條件下，黃酮得率為6.667 mg/g。本文工藝與有關(guān)文獻(xiàn)報導(dǎo)的方法相比較[12,13]，黃酮類化合物得率高、成本低、時間短、操作簡單、易回收處理，是一種高效、快速、環(huán)保的新型工藝。

采用超聲波法提取柚皮黃酮，影響其得率的各個影響因素會相互產(chǎn)生交叉影響，關(guān)鍵因素為料液比，料液比過小，提取不完全，料液比過高，不增加得率反而增加乙醇用量，提高成本，也會造成回收困難。其次是乙醇體積分?jǐn)?shù),然后是提取溫度和超聲時間，溫度過低和超聲時間過短，都會使提取不徹底，造成資源浪費，而柚皮總黃酮中柚皮苷為酚羥基化合物，溫度過高，時間過長時會使柚皮苷氧化，造成得率下降。討論最佳條件下的得率與正交條件下的最高得率無差異。

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Research on Extraction Process of Flavonoids From Pomelo Peel

LI Ge1, WANG Shan-shan1*, DING Wen-jun1, NIU Jia1, YAO Qian-qi2

1.LifeEngineeringCollegeofShenyangInstituteofTechnology,LiaoningFushun113122,China;2.FushunInstituteofVeterinaryDrugControlofLiaoningProvince,LiaoningFushun113122,China

Abstract:Pomelo peel contains many kinds of active ingredients, such as pecitin, dietary fiber, essential oil, polysaccharide and flavonoids, which has high medicinal and edible value. Reasonable development, utilization and deep processing using pomelo peel as material, could not only reduce the environment pollution, but also create good economic and social benefits. This experiment extracted flavonoids from the pomelo peel using the ultrasonic method, and studied the influence factors in the process of pomelo peel flavonoids extraction. Through the single factor and orthogonal experiment method to study the optimal extraction technological parameter, results showed that the optimal parameters were as follows: ethanol concentration was 80%, ultrasonic treatment time was 30 min, soaking temperature was 60℃, solid to liquid ratio was 1:25, and the yield of flavonoid was 4.63%.

Key words:pomelo peel; flavonoid; ultrasonic-assisted

DOI:10.3969/j.issn.2095-2341.2016.02.08

作者簡介：李歌，本科生，研究方向為天然活性成分的提取及應(yīng)用。E-mail:1324265495@qq.com。*通信作者：王珊珊，講師，研究方向為生化與微生物發(fā)酵。E-mail:shuihugai@163.com

基金項目：遼寧省教育規(guī)劃課題(JG14DB310)資助。

收稿日期：2015-09-08; 接受日期：2015-09-21