孫亞軍,　王　亮,　蔡　俊

湖北工業(yè)大學(xué)工程技術(shù)學(xué)院, 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430068

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滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)最新研究動(dòng)態(tài)及展望

孫亞軍,王亮,蔡俊*

湖北工業(yè)大學(xué)工程技術(shù)學(xué)院, 發(fā)酵工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430068

摘要：滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(rolling circle amplification,RCA)的建立模擬了自然界中環(huán)狀病原生物DNA通過(guò)滾環(huán)模型方式自我復(fù)制的原理，經(jīng)長(zhǎng)期科學(xué)研究和實(shí)踐應(yīng)用，取得了諸多突破性成果。對(duì)最近幾年在滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)研究領(lǐng)域的最新動(dòng)態(tài)進(jìn)行了較全面的總結(jié)，其中包括了網(wǎng)狀RCA、鎖式探針RCA、目標(biāo)成環(huán)RCA和跨越式RCA，也對(duì)滾環(huán)擴(kuò)增中存在的問(wèn)題進(jìn)行了探討，重點(diǎn)介紹了該技術(shù)在基礎(chǔ)研究、實(shí)際檢測(cè)、醫(yī)療診斷及納米材料等方面的應(yīng)用，最后對(duì)核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：RCA；納米材料；轉(zhuǎn)基因；鎖式探針

建立于20世紀(jì)90年代中期的滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(rolling circle amplification,RCA)，模擬了自然界中環(huán)狀病原生物DNA通過(guò)滾環(huán)模型方式進(jìn)行自我復(fù)制的原理，在研究初期就得到了世界范圍內(nèi)科研人員的高度關(guān)注。經(jīng)過(guò)不斷研究和改善，現(xiàn)已成為了包括DNA鏈置換擴(kuò)增(SDA)、環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)和依賴解旋酶的恒溫基因擴(kuò)增(HDA)等核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中的重要一員。與傳統(tǒng)的核酸擴(kuò)增技術(shù)相比,RCA技術(shù)擺脫了對(duì)精良儀器的依賴和進(jìn)行反復(fù)熱變性等缺點(diǎn)的局限，且有較高的靈敏度和特異性，反應(yīng)時(shí)間也相對(duì)縮短，使得以此項(xiàng)技術(shù)為基礎(chǔ)的核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)能更有效的投入到普遍和成規(guī)模的實(shí)際應(yīng)用中。通過(guò)對(duì)目前國(guó)內(nèi)外在滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)中的研究及應(yīng)用調(diào)查發(fā)現(xiàn)，相較國(guó)外，我國(guó)的RCA應(yīng)用研究還是有些不足，因此本文對(duì)最近幾年國(guó)內(nèi)外在滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)研究領(lǐng)域的最新動(dòng)態(tài)進(jìn)行了較全面的總結(jié)，對(duì)滾環(huán)中存在的問(wèn)題進(jìn)行了探討，介紹了該技術(shù)在基礎(chǔ)研究、實(shí)際檢測(cè)、醫(yī)療診斷及納米材料等方面的應(yīng)用[1,2]，以期為我國(guó)科學(xué)研究中RCA技術(shù)的廣泛應(yīng)用提供參考。

1RCA技術(shù)

最早對(duì)RCA技術(shù)的研究包括了線性RCA(即單引物RCA，又叫LRCA)、指數(shù)RCA(即雙引物RCA，也被稱為超分支滾環(huán)擴(kuò)增，HRCA)、多引物RCA和免疫RCA等[3,4]。RCA技術(shù)操作的基本原理是在DNA聚合酶作用下，引物沿著環(huán)狀模板鏈延伸和擴(kuò)增，產(chǎn)物為與單環(huán)模板序列完全相同的線性鏈，但長(zhǎng)度卻擴(kuò)大了數(shù)千倍[5]。隨著RCA技術(shù)的發(fā)展，研究者在這幾種比較基礎(chǔ)的RCA技術(shù)上不斷改善、創(chuàng)新，開(kāi)發(fā)了一批更加高效和實(shí)用的RCA技術(shù)，其中就包括了如網(wǎng)狀RCA、鎖式探針RCA、目標(biāo)成環(huán)RCA和跨越式RCA在內(nèi)的一系列RCA技術(shù)。

1.1網(wǎng)狀RCA

在LRCA和HRCA的基礎(chǔ)上建立的網(wǎng)狀RCA(net rolling circle amplification，NRCA)是引入了切刻內(nèi)切酶的一種更高效率的核酸擴(kuò)增技術(shù)，切刻內(nèi)切酶可識(shí)別雙鏈中特定的核苷酸序列，并只切割雙鏈中的一條單鏈。其在LRCA階段的產(chǎn)物上設(shè)計(jì)了一個(gè)切刻內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，切割下的單鏈與環(huán)狀DNA模板互補(bǔ)并充當(dāng)引物，從而繼續(xù)誘發(fā)LRCA和HRCA反應(yīng)，使其在LRCA和HRCA基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了進(jìn)一步的擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的原子力顯微表征顯示為結(jié)構(gòu)較為單一的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。如果把LRCA產(chǎn)物視為樹(shù)干，那么HRCA就是具有眾多枝椏的一棵完整大樹(shù)，NRCA則是發(fā)展為由無(wú)數(shù)棵大樹(shù)組成的茂密森林(圖1)[6]。與LRCA和HRCA相比，該技術(shù)一方面沒(méi)有犧牲原有技術(shù)在操作性、使用成本和擴(kuò)增所需時(shí)間等方面的優(yōu)勢(shì)，另一方面其在原有技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了信號(hào)放大，從而為更低豐度核酸樣本的分析檢測(cè)提供了良好的技術(shù)條件[6]。

1.2鎖式探針RCA

經(jīng)特異性生成環(huán)狀DNA，HRCA和LRCA都可用于線性DNA的擴(kuò)增，即只有目標(biāo)DNA存在的條件下，另一條線狀DNA才可成環(huán)，且只有成環(huán)的線狀DNA才可以進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增，為了進(jìn)一步保證此反應(yīng)的特異性，可采用雙切口滾環(huán)擴(kuò)增[7]。線狀探針DNA的長(zhǎng)度只有幾十個(gè)堿基，兩端能與目標(biāo)DNA一段連續(xù)的序列相結(jié)合，在探針兩端序列之間留一段缺口，通過(guò)在缺口處設(shè)計(jì)既能發(fā)揮探針功能又能行使引物作用的一段序列，且當(dāng)另一部分探針和設(shè)計(jì)的引物序列都和模板完全互補(bǔ)配對(duì)后，兩個(gè)切口才能被連接酶特異性連接成環(huán)，也只有這種由兩部分探針形成的環(huán)狀模板才能在兩條引物作用下擴(kuò)增。這個(gè)方法類似于將線狀DNA分子特異性地鎖定在目標(biāo)DNA上，可以很好的應(yīng)用在單核苷酸特異性基因診斷的研究中[8]。

圖1　LRCA、HRCA和NRCA對(duì)比示意圖[6]Fig.1　The LRCA、HRCA and NRCA contrasts in diagram[6].

1.3目標(biāo)成環(huán)RCA

目標(biāo)成環(huán)RCA(target circle RCA,TC-RCA)克服了鎖式探針RCA的單鏈探針不穩(wěn)定、探針與模板容易錯(cuò)配、擴(kuò)增產(chǎn)物并非目標(biāo)序列而是互補(bǔ)探針自身等缺點(diǎn)。用限制性內(nèi)切酶酶切樣品，產(chǎn)生具有9nt粘性末端的序列，其次，設(shè)計(jì)與目標(biāo)序列粘性末端完全互補(bǔ)配對(duì)的雙鏈接頭，經(jīng)連接酶的作用，同目標(biāo)序列連接成環(huán)，然后再利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在兩條引物的作用下引發(fā)HRCA，最后，擴(kuò)增產(chǎn)物再經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切，得到擴(kuò)增后的目的片段。TC-RCA能在無(wú)背景信號(hào)的條件下擴(kuò)增目標(biāo)DNA片段，同時(shí)接頭能穩(wěn)定結(jié)合于固相磁珠表面而不影響擴(kuò)增，因此能在芯片上實(shí)現(xiàn)目標(biāo)成環(huán)等溫?cái)U(kuò)增。在此基礎(chǔ)上，利用高特異性的DNA連接酶、生物素修飾接頭、鏈霉親和素磁珠以及磁性分離等手段，構(gòu)建了磁珠輔助的TC-RCA技術(shù)。該項(xiàng)技術(shù)能夠在等溫條件下從大量背景核酸中檢測(cè)出目標(biāo)序列，從根本上解決了檢測(cè)特異性和靈敏度之間的矛盾關(guān)系，在檢測(cè)食品中的有害微生物方面十分適用[9]。

1.4跨越式RCA

通過(guò)具有鏈置換活性及熱穩(wěn)定性的Bst DNA聚合酶引入RCA反應(yīng)所提出的跨越式滾環(huán)等溫?cái)U(kuò)增(stride RCA,SRCA)，對(duì)RCA反應(yīng)中所產(chǎn)生的背景信號(hào)機(jī)理提供了線索，其原理和過(guò)程與早期指數(shù)RCA和多引物RCA類似，但由于Bst DNA聚合酶具有在聚合過(guò)程中不受DNA缺口影響的特殊活性，當(dāng)核酸合成過(guò)程中遇到復(fù)制模板缺空后可跨越并繼續(xù)合成延伸，因此，SRCA能夠以非閉合環(huán)形DNA為模板啟動(dòng)擴(kuò)增反應(yīng)。Bst DNA聚合酶最開(kāi)始以上游引物為模板合成其互補(bǔ)鏈形成雙鏈DNA后，該酶發(fā)揮核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性在其引物的3′末端沿5′→3′方向隨機(jī)摻入脫氧核糖核苷酸聚合形成寡聚核苷酸序列，即DNA的合成反應(yīng)跨越了互補(bǔ)鏈與下游引物間的缺口，以下游引物為模板繼續(xù)互補(bǔ)配對(duì)；然后Bst DNA聚合酶繼續(xù)將脫氧核糖核苷酸隨機(jī)添加到下游互補(bǔ)序列的3′末端后形成寡聚核苷酸序列，繼續(xù)催化聚合反應(yīng)合成互補(bǔ)新鏈，完成一輪合成；最后，通過(guò)其鏈置換酶活力替換上一輪引物，往復(fù)進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增，從而形成重復(fù)擴(kuò)增產(chǎn)物。通過(guò)該特性設(shè)計(jì)的非閉合模板，巧妙設(shè)計(jì)引物，避免了引物之間的擴(kuò)增，該技術(shù)能很好的驅(qū)動(dòng)RCA反應(yīng)，為基于RCA技術(shù)的檢測(cè)方法及開(kāi)發(fā)提供了新的理論依據(jù)和借鑒意義，也對(duì)開(kāi)發(fā)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)微生物有一定幫助[10]。

2RCA技術(shù)的應(yīng)用

RCA技術(shù)在基礎(chǔ)研究、實(shí)際檢測(cè)、醫(yī)療診斷及納米材料等方面都有很好的應(yīng)用，結(jié)合細(xì)胞原位檢測(cè)、單核苷酸多態(tài)性(SNPs)、蛋白質(zhì)分析、免疫芯片和全基因組的擴(kuò)增等研究都能發(fā)揮其巨大的優(yōu)勢(shì)[11~14]，而且彌補(bǔ)了相應(yīng)技術(shù)中存在的某些不足，例如在細(xì)胞原位檢測(cè)中避免了傳統(tǒng)原位PCR技術(shù)擴(kuò)增產(chǎn)物會(huì)擴(kuò)散出細(xì)胞的問(wèn)題，且恒溫?cái)U(kuò)增特性保證了組織形態(tài)學(xué)特征的完整性[15]；在單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)中可以在合適的反應(yīng)環(huán)境和探針設(shè)計(jì)條件下同步檢測(cè)多組等位基因[16]，甚至還實(shí)現(xiàn)了對(duì)極低豐度基因組DNA樣本的檢測(cè)；近來(lái)研究顯示RCA技術(shù)對(duì)miRNA的檢測(cè)也非常靈敏和高效[17,18]。當(dāng)前RCA技術(shù)越來(lái)越多的應(yīng)用到更多的領(lǐng)域，充分證明了其重要的價(jià)值。

2.1蛋白質(zhì)分析免疫芯片檢測(cè)

對(duì)于一些疾病的檢測(cè)診斷和定向?qū)λ幬锼幇械暮Y選已通過(guò)免疫芯片技術(shù)得到了部分優(yōu)化，但對(duì)于進(jìn)行高通量及高靈敏性的檢測(cè)是傳統(tǒng)信號(hào)擴(kuò)增檢測(cè)力所不及的，基于RCA技術(shù)的免疫芯片檢測(cè)不僅克服了這一缺陷，而且使芯片靶點(diǎn)間的空間獨(dú)立性和抗原抗體結(jié)合體的整體性得到了保證[19,20]，基于兩者技術(shù)的交叉結(jié)合對(duì)于實(shí)現(xiàn)如數(shù)百個(gè)目標(biāo)分子同時(shí)檢測(cè)這樣的成規(guī)模生產(chǎn)大有裨益，還可以將微陣列技術(shù)與免疫RCA結(jié)合以實(shí)現(xiàn)多元高通量并行分析蛋白質(zhì)。

Miller等[21]制成能檢測(cè)前列腺癌患者及健康人血清中蛋白的186中抗體芯片，對(duì)患者與健康人中表達(dá)差異蛋白成功進(jìn)行了篩選。Zhou等[22]用不同標(biāo)記素雙色RCA芯片對(duì)血清蛋白質(zhì)進(jìn)行了相對(duì)水平的檢測(cè)，驗(yàn)證了其信號(hào)強(qiáng)度相對(duì)于間接和直接標(biāo)記檢測(cè)法大幅提升，比諸如HLISA法等方法的檢測(cè)過(guò)程中具有更高的重復(fù)性與準(zhǔn)確性。近年來(lái)，免疫RCA技術(shù)與納米材料相結(jié)合還可用于蛋白質(zhì)的高靈敏度甚至超高靈敏度檢測(cè)[23]。Ou等[24]通過(guò)DNA封裝脂質(zhì)體發(fā)展的免疫RCA多功能分析平臺(tái)對(duì)于超靈敏檢測(cè)蛋白質(zhì)十分實(shí)用。Cheng等[25]也提出了一種高靈敏性的級(jí)聯(lián)信號(hào)放大蛋白質(zhì)分子檢測(cè)策略，該策略融合了RCA、功能化量子點(diǎn)、生物素-親核素系統(tǒng)和電化學(xué)溶出伏安檢測(cè)技術(shù)。

2.2RCA全基因組擴(kuò)增

對(duì)于分子生物學(xué)的研究，核酸的擴(kuò)增無(wú)疑是最重要的手段之一，在對(duì)較大的環(huán)狀DNA模板的研究中，例如噬菌體DNA、葉綠素DNA和質(zhì)粒等[26]，采取指數(shù)RCA技術(shù)對(duì)模板的擴(kuò)增能達(dá)到均一和全面的效果[27]。RCA技術(shù)也拓展應(yīng)用到了全基因組的擴(kuò)增(WGA)，有研究報(bào)道phi29 DNA聚合酶和核酸酶抗性引物在30℃溫育6 h條件下，應(yīng)用RCA技術(shù)能夠從少至10個(gè)拷貝的基因組中擴(kuò)增DNA至20~30 μg, 產(chǎn)物的平均長(zhǎng)度大于10 kb。因此，采用RCA技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)利用全血樣品擴(kuò)增人類基因組DNA的目標(biāo)[28]。

Wang等[29]開(kāi)發(fā)了一種全新的限制性環(huán)化RCA (RCA-RCA)，這是一種改進(jìn)的全基因組擴(kuò)增技術(shù)，可針對(duì)于出現(xiàn)了明顯降解和交聯(lián)的DNA樣品。此方法用限制性內(nèi)切酶將DNA降解成短片段后環(huán)化成DNA環(huán)狀單鏈，最后進(jìn)行HRCA。Niel等[30]利用RCA可以由多條引物引發(fā)的特點(diǎn)，從人血漿樣品中對(duì)細(xì)環(huán)病毒(Torquetenovirus)的全基因組進(jìn)行擴(kuò)增，由于四條引物同時(shí)使用，使得所有成環(huán)擴(kuò)增子擴(kuò)增幾率更加均等，每個(gè)片段都可以擴(kuò)增到30 kb以上，樣品均一，覆蓋率在90%以上。

2.3轉(zhuǎn)基因檢測(cè)及食品安全

轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品正不斷涌入人們的生活，引起了世界范圍對(duì)于食品安全性的廣泛關(guān)注，因此，對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物檢測(cè)技術(shù)的需求顯得迫切重要。RCA技術(shù)用于植物轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)相比傳統(tǒng)的PCR方法檢測(cè)和ELISA等方法具有更加方便、高效的優(yōu)點(diǎn)。陶震等[31]通過(guò)效仿復(fù)合式PCR原理采用復(fù)合式HRCA方法成功的對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行了檢測(cè)，并取得了理想的結(jié)果。通過(guò)食物中提取轉(zhuǎn)基因模板，鎖式探針再與其特異性雜交成環(huán)，之后進(jìn)行RCA反應(yīng)擴(kuò)增[32]，能夠應(yīng)用于進(jìn)出口食品中轉(zhuǎn)基因成分的快速而高效檢測(cè)中。食品中卵清蛋白的檢測(cè)也可基于抗體抗原結(jié)合的特異性，利用RCA技術(shù)來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增[33]。還有研究者把食物中重金屬鉛的檢測(cè)結(jié)合RCA，利用Aptamer特異性結(jié)合Pb2+后，判斷目標(biāo)物的存在與否[34、35]。張健[36]利用RCA技術(shù)對(duì)食源性致病微生物進(jìn)行了特異性檢測(cè)，例如副溶血性弧菌、單核增生李斯特氏菌等，RCA檢測(cè)體系還可以研制成試劑盒以更方便的進(jìn)行快速、高靈敏性及準(zhǔn)確性的檢測(cè)[37]。

2.4RCA在納米技術(shù)中的應(yīng)用

2.4.1DNA納米結(jié)構(gòu)合成RCA可用于合成特定的DNA納米結(jié)構(gòu)，在體外模擬復(fù)雜的DNA復(fù)制。建立人工DNA納米材料已成為研究熱點(diǎn)，而RCA重復(fù)串聯(lián)產(chǎn)物序列是能夠通過(guò)編碼其環(huán)狀模板來(lái)實(shí)施精確調(diào)控的[38]，因此，基于這點(diǎn)特性可與人工合成DNA納米結(jié)構(gòu)技術(shù)相結(jié)合?，F(xiàn)已成功把RCA技術(shù)用于與端粒酶六聚體核苷酸序列互補(bǔ)的一個(gè)環(huán)狀模板復(fù)制，來(lái)人工合成及制備人端粒酶，對(duì)于人工合成端粒酶在活體研究中的意義重大。Lin等[39]利用RCA技術(shù)成功復(fù)制出平行互換DNA分子(paranemic crossover DNA, PX DNA)，建立了人工DNA納米結(jié)構(gòu)，表明RCA能夠作為復(fù)制其他復(fù)雜DNA納米結(jié)構(gòu)的有效工具，為將來(lái)核酸藥物的發(fā)展提供了方法。

利用具有鏈置換作用及高持續(xù)合成力的Phi 29 DNA聚合酶在RCA進(jìn)程中不會(huì)受到模板自身二級(jí)結(jié)構(gòu)約束的性質(zhì)，如雙鏈、發(fā)卡、結(jié)頭等這些在功能化核酸和DNA納米技術(shù)中的關(guān)鍵部分二級(jí)結(jié)構(gòu)可通過(guò)RCA技術(shù)合成。研究者們把基于RCA擴(kuò)增的放大合成用于DNA四通接頭結(jié)構(gòu)上，提出了用于大尺寸樹(shù)枝狀DNA接頭制備的新策略。在對(duì)交聯(lián)度較高的復(fù)雜DNA納米結(jié)構(gòu)RCA反應(yīng)放大后，對(duì)胞內(nèi)病毒DNA克隆提供了一個(gè)新的可能途徑。Nangreave等[40]通過(guò)RCA實(shí)現(xiàn)了經(jīng)單鏈DNA分子構(gòu)建的DNA四面體-三維納米結(jié)構(gòu)的放大合成。

2.4.2構(gòu)建周期性納米組裝結(jié)構(gòu)因RCA反應(yīng)所具有的在擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)聚合酶聚合核苷酸結(jié)合到引物末端而不斷延伸擴(kuò)增的特性，通過(guò)簡(jiǎn)便的環(huán)狀序列長(zhǎng)度的調(diào)節(jié)，就能精確地實(shí)現(xiàn)對(duì)組裝單元間距的調(diào)節(jié)與控制，所以對(duì)于一維周期性納米組裝結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，RCA產(chǎn)物所特有的重復(fù)串聯(lián)結(jié)構(gòu)就理想的成為其模板。

Deng等[41]和Beyer等[42]以重復(fù)串聯(lián)核酸序列為模板，通過(guò)對(duì)有互補(bǔ)序列金納米顆粒的雜交修飾，成功構(gòu)建了有序的周期性金納米顆粒組裝結(jié)構(gòu)。Zhao等[43]利用巰基修飾RCA過(guò)程中的引物，修飾成功的引物與金納米顆粒進(jìn)行組裝后進(jìn)行RCA反應(yīng)，擴(kuò)增得到的重復(fù)串聯(lián)單鏈DNA作為模板就可用于DNA修飾的小尺寸納米顆粒的組裝，這是基于RCA技術(shù)構(gòu)建的一種新型的三維周期性納米組裝支架。Cheglakov等[44]和Winner等[45]以RCA產(chǎn)物分別作為支架及拉鏈狀結(jié)構(gòu)成功構(gòu)建了三維DNA納米結(jié)構(gòu)和可控尺寸的DNA納米管，還通過(guò)RCA反應(yīng)對(duì)于核酸適體的放大特性構(gòu)建了周期性的蛋白質(zhì)和納米顆粒的復(fù)合納米結(jié)構(gòu)。當(dāng)延著RCA產(chǎn)物長(zhǎng)鏈連續(xù)性組裝的四邊形或六邊形基本單元所合成的二維片層達(dá)到一定尺度后就會(huì)發(fā)生卷曲變性，這種變性導(dǎo)致了具有一定尺寸的DNA納米管的形成。Hamblin等[46]也將RCA反應(yīng)的重復(fù)串聯(lián)DNA大片段作骨架很好的運(yùn)用在了三棱柱DNA納米結(jié)構(gòu)的構(gòu)建上，經(jīng)一系列構(gòu)建的產(chǎn)物深度分析后發(fā)現(xiàn)這種結(jié)構(gòu)對(duì)于核酸酶的降解抵抗力和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性大幅提升，還可有效的被癌細(xì)胞攝取。

3RCA技術(shù)存在的問(wèn)題和解決策略

3.1鎖式探針連接效率

核酸鏈結(jié)構(gòu)、離子強(qiáng)度和雜交溫度等都是可制約及干擾核酸分子雜交的因素，在RCA反應(yīng)中的鎖狀探針的雜交及其連接的效率也是一個(gè)關(guān)鍵性的制約因素，只有確保了探針?lè)肿拥碾s交及高效的連接才會(huì)有高靈敏度和特異性的檢測(cè)效果[47]。王星宇[9]設(shè)計(jì)的目標(biāo)成環(huán)RCA(TC-RCA)提高了探針與模板配對(duì)的正確率和穩(wěn)定性。Szemes等[48]的研究發(fā)現(xiàn)，熱循環(huán)法對(duì)于核酸分子的雜交有很高的效率，通過(guò)此項(xiàng)技術(shù)輔助鎖狀探針的雜交，保證了高效率的雜交后對(duì)馬鈴薯晚疫病原的成功分析。除此之外，不同的連接酶所要求的連接條件及連接效率有著較大的差異，包括鎖式探針的小二級(jí)結(jié)構(gòu)等也影響著反應(yīng)的進(jìn)程。根據(jù)相關(guān)報(bào)道，NaCl 濃度干擾著T4 DNA連接酶的保真性，當(dāng)濃度處于50~150 mmol/L之間時(shí)，此酶的保真性會(huì)隨著NaCl濃度的升高而不斷增加。因此，必須要按照不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來(lái)調(diào)控合適的連接條件及連接酶種類的選擇，這樣才能提高連接酶的連接效率及保真性，從而加強(qiáng)檢測(cè)的靈敏性。

3.2背景信號(hào)干擾

RCA擴(kuò)增反應(yīng)的背景信號(hào)干擾問(wèn)題一直以來(lái)都是嚴(yán)重干擾檢測(cè)效率的一個(gè)棘手問(wèn)題，背景信號(hào)的來(lái)源廣泛，既有連接反應(yīng)中非特異性連接經(jīng)過(guò)多個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后產(chǎn)生的較強(qiáng)信號(hào)，又有未經(jīng)成環(huán)的鎖式探針等的干擾[49]，因此，如何解決背景信號(hào)的干擾顯得至關(guān)重要。孟兆祥等[10]利用熱穩(wěn)定的Bst DNA聚合酶驅(qū)動(dòng)跨越式滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)為RCA反應(yīng)中的背景信號(hào)干擾問(wèn)題提供了線索，對(duì)于背景信號(hào)干擾的降低或消除，目前有幾種主要方法：①通過(guò)無(wú)模板的陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)來(lái)確定背景信號(hào)的來(lái)源，經(jīng)不同的熒光染料在RCA反應(yīng)與芯片分析中作標(biāo)記后進(jìn)行雙重?zé)晒庑酒治?，能夠極大限度的提升對(duì)背景信號(hào)和陽(yáng)性信號(hào)區(qū)分的準(zhǔn)確性；②篩選及棄除非特異性模板和未成環(huán)的鎖式探針，可通過(guò)利用固體支持物上固定的生物素和抗生物素蛋白捕獲探針和純化探針來(lái)進(jìn)行特異選擇，但這也增大了RCA技術(shù)的繁瑣性及成本；③對(duì)未結(jié)合探針的模板和線性探針采用核酸外切酶降解，以克服未成環(huán)探針的背景信號(hào)對(duì)信號(hào)檢測(cè)的干擾。

3.3拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的制約

研究顯示當(dāng)DNA單鏈分子通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)與鎖狀探針雜交后會(huì)導(dǎo)致與拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)相類似的區(qū)域結(jié)構(gòu)形成，一旦產(chǎn)生這種結(jié)構(gòu)就會(huì)嚴(yán)重干擾聚合酶對(duì)鎖狀探針的擴(kuò)增[50]，所以基于鎖狀探針的RCA擴(kuò)增分子檢測(cè)手段的可行性飽受研究學(xué)者們的質(zhì)疑。通過(guò)Beyer等[51]研究設(shè)計(jì)的一種特殊的鎖式探針(earring probe)在與DNA分子退火雜交后，可自發(fā)形成特定的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，再通過(guò)具有特殊鏈置換功能的Bst DNA聚合酶擴(kuò)增雜交后的環(huán)狀鎖式探針，從而獲得RCA產(chǎn)物，研究結(jié)果表明即使不對(duì)模板進(jìn)行變性處理，RCA反應(yīng)也會(huì)正常發(fā)生，從而很好的解決了所質(zhì)疑的問(wèn)題。解決了拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的制約,為RCA技術(shù)在癌基因的檢測(cè)、基因分型、單核苷酸多態(tài)性等廣泛的核酸檢測(cè)領(lǐng)域夯實(shí)了理論基礎(chǔ)。

4展望

生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)作為21世紀(jì)最有潛力的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)，是繼信息產(chǎn)業(yè)后的又一個(gè)新興經(jīng)濟(jì)技術(shù)增長(zhǎng)點(diǎn)，在社會(huì)和經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展中具有戰(zhàn)略性和先導(dǎo)性。RCA作為生物技術(shù)中的一名重要成員，因其具有獨(dú)特的等溫?cái)U(kuò)增條件，克服了PCR反應(yīng)需要反復(fù)溫度變化的循環(huán)過(guò)程，其優(yōu)勢(shì)也使得它對(duì)儀器的要求大大簡(jiǎn)化，反應(yīng)時(shí)間大大縮短，檢測(cè)靈敏度高，檢測(cè)特異性強(qiáng)，同時(shí)也易于同其他技術(shù)聯(lián)合，實(shí)現(xiàn)高通量與自動(dòng)化檢測(cè)，因此具有巨大的商業(yè)價(jià)值和廣闊的市場(chǎng)潛力。但同時(shí)國(guó)內(nèi)的RCA發(fā)展也面臨諸如研究資金來(lái)源單一、創(chuàng)新性不足、成果轉(zhuǎn)化較慢等一系列問(wèn)題。我國(guó)的科研人員必須抓住挑戰(zhàn)和機(jī)遇，才能促使我國(guó)核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化得到進(jìn)一步發(fā)展。

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Progress and Prospects of Rolling Circle Amplification

SUN Ya-jun, WANG Liang, CAI Jun*

KeyLaboratoryofFermentationEngineering,MinistryofEducation,EngineeringandTechnologyCollege,HubeiUniversityofTechnology,Wuhan430068,China

Abstract:The establishment of rolling circle amplification simulates the principle of self-replication of the ring-shaped pathogen DNA through the rolling circle model in nature, experiencing long-term scientific research and practical application, many breakthroughs have been achieved. This paper made a comprehensive summary on the latest research in recent years on rolling circle amplification(RCA), including net RCA, padlock probe RCA, target circle RCA and stride RCA. The paper also discussed the problems in the process of rolling circle amplification. We mainly introduced the application of RCA in basic research, the practical detection, medical diagnosis and Nano-materials. At last, the expectation towards the development of isothermal amplification of nucleic acid was prospected.

Key words:RCA; nanomaterials; transgene; padlock probe

DOI:10.3969/j.issn.2095-2341.2016.02.09

作者簡(jiǎn)介：孫亞軍，本科生，研究方向?yàn)樯锕こ?。E-mail：sunyajun43@163.com。*通信作者：蔡俊，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事微生物發(fā)酵工程研究。E-mail：caijun@mail.hbut.edu.cn

收稿日期：2015-11-11; 接受日期：2015-11-26