沈　潔，李加友，陸筑鳳，蔡麗玲（嘉興學(xué)院生化學(xué)院，浙江　嘉興　314001）

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化工廠廢水中對(duì)甲苯磺酸降解菌的篩選及降解特性研究

沈潔，李加友，陸筑鳳，蔡麗玲
（嘉興學(xué)院生化學(xué)院，浙江嘉興314001）

摘要：以對(duì)甲苯磺酸為唯一碳源，從化工廠供試廢水中篩選出對(duì)甲苯磺酸降解菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，確定這種菌株為哈茨木霉菌，命名為哈茨木霉1228。利用固態(tài)發(fā)酵的方法制備哈茨木霉1228，培養(yǎng)物直接投入化工廠供試廢水進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在pH=5、溫度30℃時(shí)，處理7 h后，化工廠供試廢水中對(duì)甲苯磺酸降解率可達(dá)45%。

關(guān)鍵詞：對(duì)甲苯磺酸；生物降解；哈茨木霉；降解特性

芳香族化合物作為一類重要的化工原料與中間體，正以每年百萬噸的數(shù)量被制造出來，它們廣泛用于有機(jī)合成、染料、塑料等行業(yè)。這類化合物有苯環(huán)或者多個(gè)苯環(huán)結(jié)構(gòu)，具有相當(dāng)大的毒性和致癌、致突變作用，且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，故其殘留在生態(tài)系統(tǒng)中，對(duì)環(huán)境和人類健康造成危害[1-2]。目前，國(guó)內(nèi)外工廠對(duì)廢水中芳香族化合物的處理主要用物理化學(xué)方法，但大都存在運(yùn)行費(fèi)用高，處理效果不理想并且容易造成二次污染等諸多缺點(diǎn)。微生物降解環(huán)境污染物由于投資少、占地小又不需特殊設(shè)備而成為最有前途的治理環(huán)境污染的方法[3-4]。自然界中的許多好氧和厭氧微生物可以降解芳香族化合物[5-10]。

對(duì)甲苯磺酸是農(nóng)藥、醫(yī)藥、染料及有機(jī)合成等工業(yè)生產(chǎn)中的中間體原料，已廣泛應(yīng)用于制備樹脂的固化劑和有機(jī)合成反應(yīng)的催化劑[11]。對(duì)甲苯磺酸具強(qiáng)刺激性，對(duì)水體和大氣都會(huì)造成污染，吸入、攝入或經(jīng)皮膚吸收后都會(huì)對(duì)人體健康造成危害?；S廢水中，因?qū)妆交撬岬暮枯^高，廢水酸性強(qiáng)，工廠常規(guī)的處理方法無法達(dá)到理想效果；且廢水中含鹽量大，菌種不易生長(zhǎng)降解。本研究主要通過自然選育法從化工廠供試廢水中選育出對(duì)甲苯磺酸降解菌，并考查其直接投菌的處理化工廠供試廢水時(shí)的降解特性，為化工廠含甲苯磺酸廢水的修復(fù)處理提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1供試廢水

采自浙江嘉化能源化工股份有限公司化工廠含有對(duì)甲苯磺酸的未經(jīng)處理的廢水。

1.1.2主要儀器及化學(xué)試劑

主要儀器：液相色譜儀（1200 series，美國(guó)Agilent）、氣質(zhì)聯(lián)用儀（7890A-5975C，美國(guó)Agilent）、恒溫震蕩搖床（QYC-211，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、高速離心機(jī)（TD5A-WS，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）

化學(xué)試劑：對(duì)甲苯磺酸（浙江嘉化能源化工股份有限公司化工廠生產(chǎn)，純度≧98%），其余化學(xué)試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.1.3培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白陳10 g，NaCl 5 g，瓊脂15～20 g，H2O 1000 mL，pH 7.2～7.4。

PDA養(yǎng)基：土豆100 g，蔗糖20 g，瓊脂15～ 20 g，H2O 1000 mL，自然pH。

無糖無機(jī)鹽培養(yǎng)基：Na2NO33 g，K2HPO41 g，MgSO40.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，瓊脂15～ 20 g，H2O 1000 mL，pH 7.2～7.4。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1對(duì)甲苯磺酸降解菌的篩選

從供試廢水中篩選出降解對(duì)甲苯磺酸的活性菌株。具體方法如下：供試廢水經(jīng)適當(dāng)稀釋，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基或PDA培養(yǎng)基（含有1 g·L-1的對(duì)甲苯磺酸）平板涂布，放置在35℃或28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。將有生長(zhǎng)的菌種分別標(biāo)記，并在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基或PDA培養(yǎng)基（含有1 g· L-1的對(duì)甲苯磺酸）上劃線純化。純化好的菌種，分別接于50 mL無糖無機(jī)鹽培養(yǎng)基（含有5 g·L-1的對(duì)甲苯磺酸）中，放置在35℃或28℃恒溫?fù)u床中，130 r/min，初篩培養(yǎng)48 h。初篩了的菌種再次轉(zhuǎn)接到50 mL無糖無機(jī)鹽培養(yǎng)基（含有5 g·L-1的對(duì)甲苯磺酸）中，放置在35℃或28℃恒溫?fù)u床中，130 r/min，馴化培養(yǎng)48 h，得到對(duì)甲苯磺酸的耐受菌。選取對(duì)甲苯磺酸為單一碳源時(shí)的生長(zhǎng)最好的菌種，挑取單菌落，反復(fù)劃線純化得到純菌種，即對(duì)甲苯磺酸降解菌，于4℃冰箱保藏備用。

1.2.2對(duì)甲苯磺酸降解菌的觀察及鑒定

篩選得到的對(duì)甲苯磺酸降解菌經(jīng)純化培養(yǎng)，在光學(xué)顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，初步判斷降解菌為真菌，采用分子生物學(xué)進(jìn)行鑒定。

1.2.3對(duì)甲苯磺酸降解菌的固態(tài)發(fā)酵

取當(dāng)年新鮮的水稻秸稈，用粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎過篩，篩孔直徑0.5 cm。稱取1000 g水稻秸稈粉于發(fā)酵桶中，加3000 mL水和速腐劑，充分?jǐn)嚢杈鶆?，接種對(duì)甲苯磺酸降解菌，使菌種充分與秸稈接觸，于28℃恒溫室中發(fā)酵培養(yǎng)8天，得到的發(fā)酵基質(zhì)即為工業(yè)廢水處理用的對(duì)甲苯磺酸降解菌。發(fā)酵培養(yǎng)物直接稱重，加入待處理的供試廢水中進(jìn)行降解處理。

1.2.4對(duì)甲苯磺酸降解菌的降解特性研究

取供試廢水50 mL裝于250 mL錐形瓶中，分別調(diào)節(jié)一定pH值，添加一定的接菌量，28℃下?lián)u床培養(yǎng)一定時(shí)間，計(jì)算得到對(duì)甲苯磺酸降解率。

1.2.5對(duì)甲苯磺酸的檢測(cè)

采用外標(biāo)法用液相色譜儀檢測(cè)培養(yǎng)后殘留的對(duì)甲苯磺酸濃度，檢測(cè)條件為：柱：C-18；流動(dòng)相為：乙腈：水：磷酸=240：235：0.15；檢測(cè)波長(zhǎng)為：254 nm；流速=0.8 mL/min。

對(duì)甲苯磺酸標(biāo)準(zhǔn)曲線公式：y = 1×106x-1912.7（R2= 0.9915）。

對(duì)甲苯磺酸降解率（%）=（初始對(duì)甲苯磺酸的量-對(duì)甲苯磺酸殘余量）/初始對(duì)甲苯磺酸的量× 100%

2　結(jié)果與討論

2.1對(duì)甲苯磺酸降解菌的篩選及鑒定

經(jīng)過初篩、復(fù)篩后，在對(duì)甲苯磺酸為單一碳源時(shí)，有1株真菌生長(zhǎng)明顯優(yōu)于其他菌種。將此菌種經(jīng)純化培養(yǎng)，成為對(duì)甲苯磺酸的降解菌，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察（圖1、圖2）和鑒定。

該降解菌在菌落為圓形，菌絲初為白絮狀，后為暗綠色。菌落的局部有色素合成，呈現(xiàn)淡黃色。普通光學(xué)顯微鏡觀察表明：菌絲纖細(xì)無色，多分枝，縱橫交錯(cuò)。結(jié)合菌落形態(tài)和顯微鏡檢結(jié)果，根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》，發(fā)現(xiàn)該降解菌屬于木霉屬。對(duì)該降解菌的ITS序列BLAST分析可知，該菌屬于哈茨木霉（Trichoderma harzianum）（菌種登入號(hào)：HQ011501.1），我們將其命名為哈茨木霉1228。

圖1　對(duì)甲苯磺酸降解菌的菌落形態(tài)

圖2　對(duì)甲苯磺酸降解菌的顯微鏡觀察

2.2對(duì)甲苯磺酸降解菌的降解特性研究

2.2.1體系初始pH對(duì)哈茨木霉1228降解對(duì)甲苯磺酸的影響

取化工廠工業(yè)廢水50 mL裝于250 mL錐形瓶中，分別調(diào)節(jié)pH值至5、6、7、8，添加25%的接菌量，30℃下?lián)u床處理5 h，測(cè)定殘余對(duì)甲苯磺酸含量，分別計(jì)算得到其降解率。實(shí)驗(yàn)做三組平行實(shí)驗(yàn)。

圖3　pH對(duì)對(duì)甲苯磺酸降解率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3）表明，對(duì)甲苯磺酸在酸性或堿性環(huán)境中降解率都較低，在pH=7的中性環(huán)境中降解率最高，這可能是由于哈茨木霉1228中降解對(duì)甲苯磺酸的酶屬于一種中性酶，因此對(duì)甲苯磺酸在中性環(huán)境中降解率最高。

2.2.2菌種添加量對(duì)哈茨木霉1228降解對(duì)甲苯磺酸的影響

取供試廢水50 mL裝于250 mL錐形瓶中，調(diào)節(jié)pH值至7，分別添加5%、10%、15%、20%、25%的接菌量，30℃下?lián)u床培養(yǎng)5 h，計(jì)算得到對(duì)甲苯磺酸降解率。實(shí)驗(yàn)做三組平行實(shí)驗(yàn)。

當(dāng)添加量增加時(shí)，哈茨木霉1228發(fā)酵過程中產(chǎn)生的降解對(duì)甲苯磺酸所起作用的酶的量也隨之增加，酶量的增加導(dǎo)致催化效率升高，從而降解率升高。但考慮到實(shí)際工業(yè)應(yīng)用成本及操作，菌種添加量不易過大。

2.2.3降解時(shí)間對(duì)哈茨木霉1228降解對(duì)甲苯磺酸的影響

取供試廢水50 mL裝于250 mL錐形瓶中，分別調(diào)節(jié)pH值至5，添加25%的接菌量，30℃下?lián)u床培養(yǎng)，分別于5 h、6 h、7 h、8 h、9 h取樣檢測(cè)，計(jì)算得到對(duì)甲苯磺酸降解率。實(shí)驗(yàn)做三組平行實(shí)驗(yàn)。

圖4　菌種添加量對(duì)降解率的影響

圖5　降解時(shí)間對(duì)哈茨木霉1228降解對(duì)甲苯磺酸的影響

酶降解底物受反應(yīng)時(shí)間的影響，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，對(duì)甲苯磺酸降解率隨之增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間到達(dá)7 h降解率最高。但7 h后延長(zhǎng)降解時(shí)間，對(duì)甲苯磺酸的降解率沒有明顯提高。因此，供試廢水的處理時(shí)間為7 h。

2.2.4Cu2+添加量對(duì)降解率的影響

取化工廠工業(yè)廢水50 mL裝于250 mL錐形瓶中，調(diào)節(jié)pH值至5，添加25%的接菌量，分別添加0.2‰、0.4‰、0.6‰、0.8‰、1‰的Cu2+溶液，30℃下?lián)u床處理5 h，測(cè)定殘余對(duì)甲苯磺酸含量，分別計(jì)算得到其降解率。實(shí)驗(yàn)做三組平行實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：隨著Cu2+濃度增加，對(duì)甲苯磺酸的降解率明顯增加，當(dāng)Cu2+濃度為1‰的時(shí)候，對(duì)甲苯磺酸的降解率比同等條件下不添加Cu2+降解率提高了60%。這說明Cu2+對(duì)哈茨木霉1228降解對(duì)甲苯磺酸的酶有明顯的促進(jìn)作用。

圖6　Cu2+添加量對(duì)對(duì)甲苯磺酸降解的影響

3　結(jié)論

目前，化工企業(yè)的廢水處理多是先經(jīng)過復(fù)雜的物理化學(xué)處理，再進(jìn)行微生物處理，耗時(shí)耗力。本實(shí)驗(yàn)將化工廠未經(jīng)任何處理的一次廢水，首先經(jīng)過微生物處理，將主要有毒有害物質(zhì)大部分清除，再經(jīng)過一定處理即可以達(dá)到廢水的排放標(biāo)準(zhǔn)，而且本實(shí)驗(yàn)處理時(shí)間短（7 h）。這為化工企業(yè)廢水處理提供了新的思路，對(duì)治理化工廢水起到了十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究篩選的哈茨木霉1288，在pH=7時(shí)添加量為25%，溫度30℃，降解7 h，對(duì)甲苯磺酸降解率達(dá)到45%。本研究對(duì)廢水處理效果較明顯，如經(jīng)進(jìn)一步優(yōu)化處理，降解率可進(jìn)一步提升。

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材料化學(xué)

Isolation and Degradation Characteristics of a New p-Toluenesulfonic Acid Degrading Strains from Chemical Plant Wastewater

SHEN Jie，LI Jia-you，LU Zhu-feng，CAI Li-ling
（College of Biological and Chemical Engineering，Jiaxing University，Jiaxing，Zhejiang 314001，China）

Abstract:The p-toluenesulfonic acid（p-TSA）degrading strain was isoloated from chemical plant wastewater，which can use p-TSA as the sole carbon nutrition for growth．The degrading strain was identified as Trichoderma harzianum based on the results of morphological observation and molecular biological analysis，and it was named Trichoderma harzianum 1228. Trichoderma harzianum 1228 was preparation for treatment of wastewater from chemical plant by solid state fermentation method. The results showed that，the degradation rate of p-TSA can reach 45% when the chemical plant was treated with 5 h at pH=5 and 30℃.

Keywords:p-toluenesulfonic acid（p-TSA）; biological degradation; Trichoderma harzianum; degradation characteristics

作者簡(jiǎn)介：沈潔（1978-），女，吉林市人，實(shí)驗(yàn)師，主要研究生物發(fā)酵及其相關(guān)研究。E-mail：41615491@qq.com。

基金項(xiàng)目：嘉興市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014AY21009）；浙江省芳烴磺酸工程技術(shù)研究中心開放基金項(xiàng)目（84214001-6）。

文章編號(hào)：1006-4184（2016）3-0034-04

修回日期：2016-01-20