周　賡，鄧成剛，曹林友，陳　帥，田　云，盧向陽

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，

湖南 長沙 410128；3.湖南省農(nóng)業(yè)生物工程研究所，湖南 長沙 410128)

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一株耐鎘細(xì)菌的篩選、鑒定與性質(zhì)研究

周賡1,3，鄧成剛1,2,3，曹林友1,2,3，陳帥1,2,3，田云1,3，盧向陽1,3

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，

湖南 長沙 410128；3.湖南省農(nóng)業(yè)生物工程研究所，湖南 長沙 410128)

摘要：從重金屬鎘污染土壤中分離篩選出一株耐鎘能力為25 mmol·L(-1)的細(xì)菌，根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實驗和分子鑒定，確定為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas sp.)，命名為CdTB02。該菌株的最佳生長條件為：NaCl濃度1%、裝液量30 mL/250 mL、pH值6.0、溫度35 ℃；而在含1 mmol·L(-1) Cd(2+)的環(huán)境中，最佳耐鎘生長條件為：NaCl濃度1%、裝液量30 mL/250 mL、pH值7.0、溫度30 ℃。鎘吸附實驗結(jié)果顯示，菌株CdTB02在最佳耐鎘生長條件下對Cd(2+)的吸附率達(dá)到94%以上，表明菌株CdTB02對治理鎘污染能發(fā)揮一定的作用。

關(guān)鍵詞：鎘污染；耐鎘細(xì)菌；鞘氨醇單胞菌屬；耐受性；吸附率

近年來，隨著采礦、電鍍、金屬冶煉、化肥和農(nóng)藥等相關(guān)行業(yè)的不斷發(fā)展，大量有毒重金屬直接或間接地被釋放進(jìn)入環(huán)境，它們持續(xù)地對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成巨大的影響和危害[1]。鎘(Cd)是環(huán)境中一種常見的有毒重金屬，對人類和動物的健康都能造成持續(xù)性的危害[2-3]。近年來，隨著鎘使用量的增加、鎘污染土壤面積不斷擴(kuò)大以及鎘污染的食品沒有得到充分合理的處理，使得人們接觸鎘的風(fēng)險日益增加[4]。因此，鎘污染的治理成為急需解決的問題。

用于鎘污染治理的常規(guī)方法包括：電化學(xué)處理法、離子交換法、化學(xué)沉淀法、反滲透和吸附法等，但是這些物理和化學(xué)方法都受到技術(shù)和成本的約束，而且處理過程中釋放的化學(xué)物質(zhì)和處理后的副產(chǎn)品容易對環(huán)境造成二次污染，因此，需要用效益更高和更環(huán)保的生物方法來處理鎘污染[5]。人們開始不斷探索更多的生物修復(fù)方法[6-7]。其中細(xì)菌、真菌和藻類等微生物由于具有比表面積大、繁殖迅速、代謝能力旺盛、種類多、適應(yīng)性強(qiáng)、易擴(kuò)大培養(yǎng)且生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢，其在鎘污染治理中的獨特地位逐漸受到人們的重視[8-10]。

目前，耐鎘微生物的篩選越來越受到專家學(xué)者的關(guān)注。大量的耐鎘和具有鎘吸附作用的微生物通過傳統(tǒng)的分離篩選手段被發(fā)現(xiàn)，這些微生物主要屬于Pseudomonassp.、Cupriavidus metallidurans、Bacillus cereus和Enterococcus faecalis等[11-13]。Zhang等[3]篩選得到了33株具有抗鎘毒性的乳酸菌，其中Lactobacillus plantarumCCFM8610耐鎘能力最強(qiáng)，能達(dá)到1 000mg·L-1，對鎘離子的吸附率達(dá)到31.34%。Limcharoensuk等[14]從鋅礦山土壤中分離篩選得到Pseudomonas aeruginosaB237，對鎘離子有明顯的吸附能力，其對Cd2+最大吸附能力為16.89mg·g-1。Surasak等[15]同樣從鋅礦區(qū)的土樣中篩選得到24株耐鎘細(xì)菌，其平均耐受CdCl2能力達(dá)到2.5mmol·L-1。

鞘氨醇單胞菌(Sphingomonassp.)對芳香化合物的代謝能力極強(qiáng)[16]，并且該菌屬某些菌種能夠合成有價值的胞外生物高聚物。所以該菌株通常作為降解有機(jī)污染物的一類環(huán)保細(xì)菌被學(xué)者們所認(rèn)識[17]。但是關(guān)于其耐鎘特性方面的研究報道較少。

作者從湘西鎘污染的土壤中篩選了一株耐鎘細(xì)菌CdTB02，對其進(jìn)行了鑒定和生長條件的優(yōu)化，并對其在鎘環(huán)境中的生長情況以及該菌株對Cd2+的吸附能力進(jìn)行研究，擬為該菌株在生物修復(fù)鎘污染環(huán)境中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1實驗

1.1土壤樣品采集

采樣點：湖南省湘西鳳凰縣、古丈縣、瀘溪縣3個重金屬鎘污染地區(qū)。

采樣方法：各采樣點取5～10cm表層重金屬鎘污染土樣，將其混合均勻后備用。

1.2培養(yǎng)基

分離培養(yǎng)基：蛋白胨10g，NaCl10g，酵母膏10g，瓊脂12g，調(diào)節(jié)pH值為7，加濃度為1mol·L-1的CdCl2溶液10mL，定容至1 000mL，121 ℃下滅菌20min，倒平板。

篩選培養(yǎng)基：配制Cd2+濃度分別為10mmol·L-1、15mmol·L-1、20mmol·L-1、25mmol·L-1、30mmol·L-1的分離培養(yǎng)基。

1.3耐鎘細(xì)菌的分離

取10g鎘污染混合土樣置于500mL三角瓶中，加入100mL去離子水和20顆小玻璃珠，置于200r·min-1、30 ℃振蕩培養(yǎng)箱中處理1h，靜置10min，取上層懸液稀釋至10-4、10-5、10-6數(shù)量級，吸取稀釋液涂布在含Cd2+濃度為10mmol·L-1的平板上，置于28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察結(jié)果。

1.4耐鎘細(xì)菌的篩選

挑取平板上的單菌落，分別在Cd2+濃度為10mmol·L-1、15mmol·L-1、20mmol·L-1、25mmol·L-1、30mmol·L-1的平板上劃線，置于28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。重復(fù)上述操作得到鎘耐受能力最強(qiáng)的細(xì)菌。

1.5耐鎘細(xì)菌的鑒定

1.5.1形態(tài)及生理生化鑒定

參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[18]、《微生物學(xué)實驗教程》[19]、《污染土壤生物修復(fù)理論基礎(chǔ)與技術(shù)》[20]以及《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[21]等對耐鎘細(xì)菌進(jìn)行鑒定。

1.5.216S rDNA序列分析

采用磁珠法基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)提取細(xì)菌CdTB02的總基因組DNA，擴(kuò)增細(xì)菌CdTB02的16S rDNA，設(shè)計引物為：27F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R：GGCTACCTTGTTACGACTT。PCR反應(yīng)體系為：5 μL的10×buffer，0.25 μL的Ex Taq DNAase，4 μL的 dNTP，2 μL的引物，2 μL的模板，總反應(yīng)體系為50 μL。PCR條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將其連接到pMD18-T vector上，經(jīng)陽性鑒定后送華大基因公司進(jìn)行測序。

1.6生長條件對菌株CdTB02生長和耐鎘的影響

分別測試菌株CdTB02在250 mL三角瓶中不同裝液量(10 mL、30 mL、50 mL、70 mL、90 mL)、不同NaCl濃度(0%、1%、2%、3%、4%、5%)、不同溫度(25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃)、不同pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)條件下的生長情況和在含鎘濃度為1 mmol·L-1的上述不同液體培養(yǎng)基中的生長情況。接種母液OD600均為1，接種量為2%，于轉(zhuǎn)速200 r·min-1的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，每組設(shè)3個平行。

1.7最佳耐鎘生長條件下菌株CdTB02的鎘吸附實驗

配制100 mL LB液體培養(yǎng)基，加鎘使培養(yǎng)基中Cd2+的初始濃度分別為100 mg·L-1、500 mg·L-1、900 mg·L-1、1 300 mg·L-1、1 700 mg·L-1，先分別取2 mL培養(yǎng)基作為對照，再以2%接種量接種，接種母液OD600為1，于30 ℃、200 r·min-1下振蕩培養(yǎng)24 h，離心后取上清液2 mL做消化。

消化方法：將消化管洗凈，烘干。取待測樣加入消化管中。稱取硫酸銅0.5 g、硫酸鉀6 g、濃硫酸12 mL于消化管中。做一個空白對照，將對照組樣品加入消化管中，其它條件相同。將消化管放入儀器上進(jìn)行消化。調(diào)整溫度為350～400 ℃，待顏色變?yōu)槌吻?大約2 h以上)，再繼續(xù)加熱0.5 h，關(guān)閉儀器，將消化管靜置、冷卻至室溫。消化后采用TAS-986原子吸收分光光度計火焰法測定鎘濃度。

菌株CdTB02對鎘的吸附率(%)和吸附量(mg·L-1)的計算公式如下：

吸附量=(Cd2+初始濃度-吸附后Cd2+濃度)×0.1

2結(jié)果與討論

2.1耐鎘細(xì)菌的篩選與鑒定

通過對鎘污染土壤中微生物進(jìn)行鎘耐受性篩選，得到一株耐鎘細(xì)菌，命名為CdTB02，該菌的最大鎘耐受濃度為25 mmol·L-1。對菌株CdTB02進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定，結(jié)果見表1。菌株CdTB02總DNA和16S rDNA擴(kuò)增的部分電泳結(jié)果見圖1。

由圖1可知，菌株CdTB02的16S rDNA序列全長為1 451 bp。將測定所得序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫，通過在線序列BLAST比對檢索，構(gòu)建CdTB02菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹，見圖2。

表1耐鎘細(xì)菌CdTB02的生化特征

Tab.1

Biochemical properties of the cadmium

注：“+”為陽性反應(yīng),“-”為陰性反應(yīng)。

圖1　菌株CdTB02總DNA(a)和16S rDNA擴(kuò)增(b)電泳圖

圖2　菌株CdTB02與其它相關(guān)細(xì)菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹

結(jié)合該菌株的形態(tài)學(xué)、生理生化鑒定，并參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》[18]，確定耐鎘細(xì)菌CdTB02為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)。

2.2生長條件對菌株CdTB02的生長和鎘耐受能力的影響(圖3)

圖3NaCl濃度、裝液量、pH值和溫度對菌株CdTB02生長和鎘耐受能力的影響

Fig.3Effects of NaCl concentration,liquid loading,pH value and temperature on growth and cadmium resistance of CdTB02

培養(yǎng)微生物時，培養(yǎng)基中NaCl含量與細(xì)胞滲透壓密切相關(guān)；裝液量的多少會影響培養(yǎng)基中溶解氧的含量，進(jìn)而影響微生物的呼吸作用和某些代謝產(chǎn)物的合成；pH值和溫度直接影響微生物相關(guān)代謝酶的活性。由圖3a可知，無論環(huán)境中是否含有鎘離子，隨著NaCl濃度的升高，菌株CdTB02的生長都會受到抑制，在NaCl濃度為5%以上時，菌株CdTB02不能生長，其生長最佳NaCl濃度為1%；菌株CdTB02在含鎘環(huán)境中的生長情況優(yōu)于不含鎘的環(huán)境，說明NaCl能提高該菌株的鎘耐受能力。由圖3b可知，菌株CdTB02在裝液量30 mL/250 mL時生長狀況最好，但裝液量對該菌株鎘耐受能力影響不大。由圖3c可知，菌株CdTB02適合在中性或偏酸性條件下生長，pH值為9.0時該菌停止生長，說明pH值過高會嚴(yán)重抑制菌體生長；pH值為6.0時該菌生長最佳，含鎘環(huán)境下pH值為7.0時該菌生長最佳；在堿性環(huán)境中pH值對菌株CdTB02的鎘耐受能力影響小，偏酸性環(huán)境中會降低其鎘耐受能力。由圖3d可知，菌株CdTB02最佳生長溫度為35 ℃，而含鎘環(huán)境中最佳生長溫度為30 ℃。

2.3最佳耐鎘生長條件下菌株CdTB02的鎘吸附能力

在最佳耐鎘生長條件下，即NaCl濃度1%、裝液量30 mL/250 mL、pH值7.0、溫度30 ℃時，測定菌株CdTB02的鎘吸附量和吸附率，結(jié)果見表2。

由表2可知，菌株CdTB02對鎘的吸附率均高于94.736%，表明該菌的細(xì)胞內(nèi)有較多的活性酶，能提高代謝效率，使細(xì)胞與鎘的結(jié)合率提高，并且呼吸作用提供了足夠的能量以運輸鎘離子進(jìn)入細(xì)胞[6，12]。Cd2+初始濃度為500 mg·L-1時，菌株CdTB02對Cd2+的最高吸附率為97.659%，隨著Cd2+濃度的升高，菌株CdTB02對Cd2+的吸附率呈下降趨勢，表明菌株CdTB02對鎘的吸附能力有限，Cd2+濃度過高會影響菌株CdTB02對鎘的吸附能力。

表2

菌株CdTB02的鎘吸附量和吸附率

Tab.2

Cadmium adsorption amount and cadmium

3結(jié)論

采用常規(guī)純培養(yǎng)方法從重金屬鎘污染土壤中分離篩選耐鎘微生物，并獲得一株耐鎘能力強(qiáng)的細(xì)菌CdTB02，該菌株能在含25 mmol·L-1Cd2+的LB固體培養(yǎng)基中生長。通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實驗及分子鑒定，確定該菌株為鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonassp.)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CdTB02最佳生長條件為：NaCl濃度1%，裝液量30 mL/250 mL，pH值6.0，溫度35 ℃；而在含1 mmol·L-1Cd2+的環(huán)境中，最佳耐鎘生長條件為：NaCl濃度1%，裝液量30 mL/250 mL，pH值7.0，溫度30 ℃。該菌株在有無鎘的環(huán)境下均生長良好，說明該菌鎘耐受能力強(qiáng)。在最佳生長條件下，菌株CdTB02對Cd2+的最高吸附率為97.659%，表明該菌株對Cd2+有較強(qiáng)的吸附能力，具有在鎘污染治理中應(yīng)用的潛力。

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Screening,Identification and Characterization of A Cadmium Resistant Strain

ZHOU Geng1,3,DENG Cheng-gang1,2,3,CAO Lin-you1,2,3,CHEN Shuai1,2,3,TIAN Yun1,3,LU Xiang-yang1,3

(1.CollegeofBioscienceandBiotechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China；2.CollegeofOrientScience&Technology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha410128,China；3.HunanAgriculturalBioengineeringResearchInstitute，Changsha410128,China)

Abstract：In this paper,a strain with maximum cadmium tolerated concentration of 25 mmol·L(-1) was isolated from the soil of heavy metal cadmium polluted area.It was identified as Sphingomonas sp. and named as CdTB02 by morphological observation,physiological-biochemical identification and molecular identification.The optimum growth conditions for strain CdTB02 were as follows：NaCl concentration of 1%,liquid loading of 30 mL/250 mL,pH value of 6.0 and temperature of 35 ℃.In the environment of containing 1 mmol·L(-1) Cd(2+),the optimum growth conditions of cadmium resistance were as follows：NaCl concentration of 1%,liquid loading of 30 mL/250 mL,pH value of 7.0 and temperature of 30 ℃.Cadmium adsorption experiment showed that the adsorption rate of Cd(2+)was more than 94% under the optimum growth conditions of cadmium resistance，which indicated that the strain CdTB02 could play an important role in the treatment of cadmium pollution.

Keywords：cadmium pollution;cadmium resistant bacteria;Sphingomonas sp.;tolerability;adsorption rate

中圖分類號：X 703

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)03-0043-05

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.03.012

作者簡介：周賡(1989-)，男，湖南津市人，碩士研究生，研究方向：應(yīng)用微生物學(xué)，E-mail：1019583003@qq.com；通訊作者：田云，教授，E-mail：tianyun79616@163.com；盧向陽，教授，E-mail：xiangyangcn@163.com。

收稿日期：2015-12-02