王晨，呂世懂，廉明，孟慶雄*.昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院，云南 昆明 650500；.昆明市糧油飼料產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中心，云南 昆明 6508

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頂空固相微萃取結(jié)合GC/MS分析普洱大葉種喬木茶花香氣成分

王晨1，呂世懂2，廉明1，孟慶雄1*
1.昆明理工大學生命科學與技術(shù)學院，云南 昆明 650500；2.昆明市糧油飼料產(chǎn)品質(zhì)量檢驗中心，云南 昆明 650118

摘要：運用全自動頂空固相微萃取技術(shù)（Headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）對云南普洱地區(qū)生產(chǎn)的大葉種喬木茶花樣品中的揮發(fā)性成分進行提取，并采用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)（Gas chromatography-mass spectrometry,GC/MS）進行定性定量分析；同時與該類茶樹制成的普洱生茶的揮發(fā)性成分進行了比較。結(jié)果表明，從普洱大葉種喬木茶花和普洱生茶中鑒定出揮發(fā)性成分分別為9種和67種，主要以碳氫化合物和醇類揮發(fā)性化合物為主。通過對比發(fā)現(xiàn)，普洱大葉種喬木茶花中的揮發(fā)性成分均存在于普洱生茶的揮發(fā)性成分之中，這些成分均具有一定香氣特性。本研究表明，普洱大葉種喬木茶花可作為獨立飲品，有類似于茶葉的香味感受，或者可與茶葉混合以提高或改善茶葉產(chǎn)品的香氣風味。

關(guān)鍵詞：茶花；普洱生茶；頂空固相微萃取（HS-SPME）；揮發(fā)性成分；氣相色譜-質(zhì)譜（GC/MS）

云南具有適宜茶樹生長的得天獨厚的氣候環(huán)境和地理條件，全省茶園面積超過570萬畝[1]，居全國第二，茶花產(chǎn)量巨大，但其基礎(chǔ)研究及市場開發(fā)都還處于起步階段。目前，關(guān)于茶樹花的研究主要集中在茶花中的多糖方面[2]。其醫(yī)用功效表現(xiàn)在治療出血、便血、涼血解毒等癥狀[3]。在茶花的應(yīng)用方面，采摘立秋之后的茶花，經(jīng)干燥晾曬，單獨壓制成茶花餅或與秋季的曬青毛茶（生茶）混和后壓制成的餅茶，市面上稱這種含普洱茶花的普洱茶為谷花茶，該茶口感純正，味道清淡，香味如荷[4]。此外，茶花還可以作為輔助成分制作糕點。

普洱大葉種喬木茶花，因其營養(yǎng)成分和活性物質(zhì)相當豐富，具有很大的開發(fā)和利用價值，例如普洱大葉種喬木茶花中的天然多糖具有增強免疫、抗病毒、抗氧化等多種生物活性功效[5]。梅花、杜鵑、茉莉花心、山茶茶花、梔子花和薔薇等的揮發(fā)性成分有過研究[6-7]，對普洱大葉種喬木生茶的揮發(fā)性成分也有較多報道[8-11]，但對普洱大葉種喬木茶花揮發(fā)性成分的研究卻未見報道。

目前，頂空固相微萃取法已經(jīng)在不同類型茶葉揮發(fā)性組分的提取中被廣泛應(yīng)用[12-14]。它是一種靈敏度高、簡單、重現(xiàn)性好、可靠的樣品前處理技術(shù)，而且在整個提取過程中不使用任何有機溶劑，可以真實地反映茶葉樣品中所含的化學信息。運用全自動頂空固相微萃取法集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體，通過軟件全自動控制整個萃取過程，樣品的處理時間大大縮短，實驗結(jié)果的重復性和準確性得到了明顯提高[15]。

本文以普洱大葉種喬木茶花為研究對象，對其揮發(fā)性成分進行分離鑒定，并比較它與大葉種曬青毛茶（生茶）在揮發(fā)性成分上的差異性，旨在探究普洱大葉種喬木茶花的理化特性，為將茶花及普洱茶進一步開發(fā)茶葉新產(chǎn)品提供科學依據(jù)及理論參考。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

普洱大葉種喬木干茶花和普洱生茶，2013年產(chǎn)于普洱市梅子湖茶園，由普洱市茶業(yè)局提供。茶樹品種為小喬木過渡型野生茶樹，屬推廣品種，樹齡20年，樹高經(jīng)修剪后為1.5 m，于立秋采摘該茶花樣品，開放程度為盛花，然后經(jīng)自然曬干處理?；旌蠘藴势窞檎龢?gòu)烷烴C6～C30（美國AccuStandard公司）。

1.2 主要儀器

7890A氣相色譜5975C質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；G6500轉(zhuǎn)盤式自動進樣器（美國CTC公司）；配置有65 μm PDMS/DVB萃取頭的固相微萃取裝置（美國Supelco公司）；BP210S電子分析天平（德國塞多利斯公司）。

1.3 實驗與方法[16-17]

1.3.1 頂空固相微萃取

首先對萃取頭進行預(yù)處理，將65 μm PDMS/DVB萃取纖維在氣相色譜進樣口250℃條件下老化60 min。然后通過粉碎機粉碎茶葉或茶花樣品，并快速稱取各2.00 g的樣品裝入20 mL密閉的小瓶中，加入5 mL沸騰蒸餾水進行沖泡，并立即密閉瓶口。然后，在80℃平衡10 min進行固相微萃取，吸附60 min，最后解吸附3.5 min，每個樣品重復2次。

1.3.2 GC/MS檢測

氣相色譜條件：色譜柱采用HP-5MS彈性石英毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度為250℃，載氣為高純氦氣，1 mL·min-1的流速進行不分流進樣；程序升溫：保持5 min 的50℃初始柱溫，以3℃·min-1的速度升至210℃，平衡3 min，然后再以15℃·min-1的速度升至230℃。

質(zhì)譜條件：電離方式為EI，電子能量70 eV，離子源溫度為230℃，接口溫度為280℃，電子倍增器電壓為350 V，35～400 m/z進行質(zhì)量掃描，2.8 min溶劑延遲。

1.3.3 保留指數(shù)值測定

取正構(gòu)烷烴混合標準品，按照1.3.2的條件進行GC/MS分析（進樣量1 μL），記錄每個正構(gòu)烷烴標準品出峰的保留時間，采用Kovats保留指數(shù)（Retention index，RI）公式計算各組分的RI值：

式中，tx、tn和tn+1分別表示分析組分、n碳原子數(shù)和n+1碳原子數(shù)之間的正構(gòu)烷烴混合標準品（tn

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

采用安捷倫MSD G1701EA E.02.00.493化學工作站處理系統(tǒng)，并將GC/MS分析得到的數(shù)據(jù)在NIST 08.L標準譜庫上進行檢索，然后將計算出來的RI值與文獻中用HP-5MS柱測得的RI值進行比較[18-20]，最佳鑒定結(jié)果以質(zhì)譜相似度和RI值接近度最高的化學結(jié)構(gòu)為準，無法得到保留指數(shù)的仍以質(zhì)譜匹配度最高為準。同時，運用峰面積歸一化法進行定量分析，得到各組分的相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 普洱大葉種喬木茶花和普洱生茶揮發(fā)性成分分析

普洱大葉種喬木茶花和普洱生茶揮發(fā)性成分的GC/MS總離子流色譜圖分別如圖1和圖2所示，它們揮發(fā)性成分的定性和定量結(jié)果分別如表1和表2所示。

圖1　普洱大葉種喬木茶花揮發(fā)性成分GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in big-leaf tea plant(Camellia sinensis var.assamica)flower

在普洱大葉種喬木茶花中，共鑒定出揮發(fā)性成分9種，主要為碳氫化合物60.42%（6種）、酮類16.59%（2種）、以及醇類10.31% （1種）。碳氫化合物主要是十六烷（8.21%）、D-檸檬烯（3.66%）和芳香烴類48.55%（4種）；酮類組分主要是香葉基丙酮（6.69%）和β-紫羅酮（9.90%）；芳香烴類主要是萘（29.90%）、蒽（8.66%）、芴（5.31%）和1-甲基萘（4.68%）；醇類是脫氫芳樟醇（10.31%）。

在普洱生茶中，共鑒定出揮發(fā)性成分67種，主要為醇類33.25%（17種）、碳氫化合物22.11%（25種，其中芳香烴類10種，占6.74%）、酮類12.69%（8種）、酯類8.21%（4種）、、含氮化合物5.24%（2種）、內(nèi)酯類4.00% （1種）、雜氧化合物4.70%（3種）、酸類2.48% （1種）、醛類1.8%（5種）和酚類化合物0.17% （1種）。醇類組分中主要以芳樟醇（11.47%）、植醇（8.3%）、香葉醇（2.95%）以及橙花叔醇（1.84%）為主，這幾種物質(zhì)占總醇類物質(zhì)的73.86%；碳氫類主要是2,6,10,14-四甲基十五烷（3.17%）、十六烷（2.25%）以及芳香烴類中的芴（1.67%）和1,2,3-三甲氧基苯（1.5%）；不飽和烴化合物主要是α-法呢烯（1.9%）和β-蒎烯（0.73%）；酮類組分主要是香葉基丙酮（3.87%）、β-紫羅酮（3.83%）和植酮（2.52%）；酯類化合物主要是十六烷酸甲酯（5.13%）和水楊酸甲酯（2.19%）；含氮化合物主要是咖啡堿（4.70%）；內(nèi)酯類揮發(fā)性化物中僅檢測出二氫獼猴桃內(nèi)酯（4.00%）；雜氧化合物主要是芳樟醇氧化物Ⅲ（0.94%）、芳樟醇氧化物Ⅱ（2.06%）和芳樟醇氧化物Ⅰ（1.70%）；酸類化合物僅檢出十六烷酸（2.48%）；醛類主要是β-環(huán)檸檬醛（0.85%）；酚類是2,6-二甲氧基苯酚（0.17%）。

圖2　普洱生茶揮發(fā)性成分GC/MS總離子流色譜圖Fig.2 GC/MS total ion chromatogram of volatile components in the Pu-erh raw tea

表1　普洱大葉種喬木茶花揮發(fā)性成分的GC/MS分析結(jié)果Table 1 GC/MS analysis results of volatile components in big-leaf tea plant(Camellia sinensis var.assamica)flower

表2　普洱生茶揮發(fā)性成分的GC/MS分析結(jié)果Table 2 GC/MS analysis results of volatile components in the Pu-erh raw tea

續(xù)表2

2.2 普洱大葉種喬木茶花和普洱生茶揮發(fā)性組分對比分析

普洱大葉種喬木茶花和普洱生茶的香氣成分分析比較結(jié)果見表3，這兩種樣品的香氣成分相對含量比較見圖3。從圖表中可以看出，普洱大葉種喬木茶花和普洱生茶揮發(fā)性成分都以醇類和碳氫化合物為主，但是普洱大葉種喬木茶花中碳氫化合物明顯相對含量很高（60.42%），除碳氫類、醇類和酮類化合物外并沒有檢測出其他揮發(fā)性成分。普洱生茶檢出67種，其碳氫類揮發(fā)性化合物與普洱大葉種喬木茶花相比明顯相對含量較低，但其醇類化合物相對含量與普洱大葉種喬木茶花相近。此外，通過表1和表2可以發(fā)現(xiàn)，鑒定出的普洱大葉種喬木茶花揮發(fā)性組分全部存在于云南普洱生茶的揮發(fā)性組分中，共有9種，分別為D-檸檬烯、芴、蒽、萘、十六烷、脫氫芳樟醇、香葉基丙酮、1-甲基萘和β-紫羅酮。在茶花所鑒定出的揮發(fā)性組分中，D-檸檬烯具有檸檬香味，甜、柑橘的果皮香韻[21]；脫氫芳樟醇具有花的甜清香，香氣具有柔和持久的特點[22]；香葉基丙酮具有葉香、玫瑰香和果香[23]；而β-紫羅酮具有柏木香和紫羅蘭香等特殊香氣[16]。若茶花與普洱生茶混配制作谷花茶，這些物質(zhì)有助于增加生茶的原始香味，可在一定程度上提高生茶的香氣感受。此外，直接沖泡飲用普洱茶花，香味感受與生茶相近，滋味醇厚，具有板栗香，可作為新的飲品開發(fā)。

2.3 方法的重現(xiàn)性

HS-SPME結(jié)合GC/MS分析測定普洱大葉種喬木茶花和普洱生茶香氣成分的方法重現(xiàn)性是十分重要的指標之一。按照1.3.1處理本實驗中的茶葉和茶花樣品5次，分別用1.3.2的條件進行GC/MS檢測分析，以檢測比較總峰面積和保留時間為主。結(jié)果表明，總峰面積和保留時間的相對標準偏差（RSD）都符合分析要求（RSD<3%）。由于樣品揮發(fā)性組分濃度會隨著頂空萃取次數(shù)的增加而下降，進而總峰面積和實驗結(jié)果會受到一定影響，所以同一份樣品只能進行1次HS-SPME分析。

表3　2種樣品揮發(fā)性成分分析比較結(jié)果Table 3 The comparison results of two kinds of samples by aromatic components analysis

圖3　兩種樣品香氣組分對比圖Fig.3 Comparison of aromatic compounds in two kinds of samples

3 討論

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在普洱生茶樣品中檢測出較高含量的芳樟醇及其氧化物、二氫獼猴桃內(nèi)酯、水楊酸甲酯、α-松油醇、香葉醇、植醇等揮發(fā)性香氣物質(zhì)，而且其他學者也從普洱生茶中檢測出了含量較高的這些化合物[24]，并猜測這些物質(zhì)對普洱生茶的典型木香和青草香味起到了一定的作用。其中，芳樟醇含量高達11.47%，張峻松等[25]認為其香氣新鮮純正持久，對普洱生茶的風味具有重要影響。特別是，具有鮮葉香氣的二氫獼猴桃內(nèi)酯和具有木香的萜烯類化合物被認為是普洱生茶中的主要香氣成分之一[26]，因此其含量也很高，我們的實驗結(jié)果也與這一猜測相吻合，這兩種物質(zhì)的產(chǎn)生估計與茶葉的殺青程度有關(guān)。此外，楊明容等[27]認為水楊酸甲酯具有特殊的香氣和滋味，黃致喜等[28]認為α-松油醇、香葉醇、植醇是一種良好的定香溶劑，它們的產(chǎn)生對茶香的貢獻還需要結(jié)合先進的GC-O等儀器作進一步地判斷。

通過對普洱大葉種喬木茶花和對應(yīng)的生茶揮發(fā)性成分的探究，旨在加深對茶花理化特性的了解。此次研究從茶花中所鑒定出來的揮發(fā)性組分較少，可能與我們使用的萃取方式和茶花干燥方式有關(guān)。頂空固相微萃?。℉S-SPME）是一種無溶劑的樣品前處理技術(shù)，對于分析茶葉以及相關(guān)樣品具有良好的表現(xiàn)[29]，但對于茶花樣品尚未充分優(yōu)化，這可能導致了茶花的揮發(fā)性成分在一定程度上沒有揮發(fā)完全。因此，還應(yīng)該進一步結(jié)合同時蒸餾萃取法或其他方法進行檢測分析，全面考察茶花中的揮發(fā)性成分。

揮發(fā)性組分帶來的香氣感受是反映茶葉品質(zhì)和特征的一個重要因素之一，另一方面則是水溶性物質(zhì)帶來的滋味感受[30]。目前，將茶花摻到普洱生茶中，可以使茶葉的滋味變得更加甘甜和醇厚。但這缺乏實驗數(shù)據(jù)的支持，僅僅是從感官角度出發(fā)，具有較強的主觀意識。因此，基于分光光度法及液相色譜技術(shù)及液質(zhì)聯(lián)用的茶花化學成分的研究也應(yīng)當進一步考慮。同時還可結(jié)合普洱茶花優(yōu)良的品質(zhì)和藥理學功效進行深加工，開發(fā)相應(yīng)的功能飲料?？傊?，通過比較云南普洱大葉種喬木茶花和對應(yīng)的生茶揮發(fā)性成分，能夠為普洱大葉種喬木茶花及普洱谷花茶的市場開發(fā)及質(zhì)量標準的制定提供科學依據(jù)和理論參考。

4 結(jié)論

本研究首次通過全自動頂空固相微萃取（HS-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（GC/MS）法分析普洱大葉種喬木茶花茶香氣成分，并與普洱生茶香氣成分進行比較，從中分別鑒定出香氣成分9種和67種，結(jié)果表明它們的香氣成分都以醇類、酮類、碳氫類揮發(fā)性化合物為主，普洱大葉種喬木茶花中所鑒定出來的揮發(fā)性組分較少。通過對比發(fā)現(xiàn)，普洱大葉種喬木茶花中的揮發(fā)性成分均存在于普洱生茶的揮發(fā)性成分之中，這些成分均具有一定香氣特性。本研究表明，茶花作為獨立飲品有類似于茶葉的香味感受，或者可與茶葉混合以提高或改善茶葉產(chǎn)品的香氣風味。

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Analysis of Aroma Components in Big-leaf Tea Plant(Camellia sinensis var.assamica)Flower Using Headspace Solid-phase Microextraction Coupled with GC/MS

WANG Chen1,Lü Shidong2,LIAN Ming1,MENG Qingxiong1*

1.Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China; 2.Kunming Grain and Oil and Feed Product Quality Inspection Center,Yunnan 650118,China

Abstract:The volatile components of tea flower(Camellia sinensis var.assamica),which was collected from tea garden in Pu-erh district,were extracted by fully automated headspace solid-phase microextraction(HS-SPME),identified by gas chromatography-mass spectrometry(GC/MS),and compared with the volatile components of Pu-erh green tea from same tea garden.The results showed that 9 and 67 kinds of volatile components were identified in tea flower and Pu-erh raw tea,respectively.Among them,hydrocarbons and alcohols were two major volatile components.Comparison showed that all volatile components of the tea flower were also found in Pu-erh green tea.Our results suggests that the tea flower may have similar aroma to tea leaves,and can also be mixed with tea leaves to improve the aromatic flavor.

Keywords:tea flower,Pu-erh raw tea,HS-SPME,volatile components,GC/MS

作者簡介：王晨，男，碩士研究生，主要從事生物工程方面的研究。*通訊作者：qxmeng@sina.com

基金項目：國家自然科學基金（31460228）。

收稿日期：2015-08-13

修訂日期：2015-10-13

中圖分類號：TS272；Q946.8

文獻標識碼：A

文章編號：1000-369X（2016）02-175-09