金琦芳，陳志丹，孫威江1,*，林馥茗，薛志慧，黃艷，唐秀華

1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，福建 泉州 362400；3.閩臺(tái)特色作物病蟲(chóng)害生態(tài)防控協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 福州 350002

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茶樹(shù)CsANS基因及其啟動(dòng)子的克隆與生物信息學(xué)分析

金琦芳1,3，陳志丹2,3，孫威江1,2,3*，林馥茗2,3，薛志慧2,3，黃艷2,3，唐秀華1,3

1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，福建 泉州 362400；3.閩臺(tái)特色作物病蟲(chóng)害生態(tài)防控協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 福州 350002

摘要：采用RACE技術(shù)，獲得茶樹(shù)武夷奇種C18葉片花青素合成途徑中的花青素合成酶（ANS）基因的cDNA全長(zhǎng)序列。采用染色體步移技術(shù)獲得該基因的啟動(dòng)子序列。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)該基因在不同遮光處理下的表達(dá)動(dòng)態(tài)。結(jié)果表明，CsANS全長(zhǎng)cDNA為1 000 bp，其中ORF（Open Reading Frame）為957 bp，編碼320個(gè)氨基酸，含有DIOX-N和20G-Fell-Oxy保守功能結(jié)構(gòu)域；分離得到CsANS基因上游調(diào)控序列1 010 bp，其含啟動(dòng)子核心元件TATA-box及ACE、GT1-motif、Sp1（光響應(yīng)元件）、circadian（生物鐘相關(guān)元件）等與花青素合成途徑相關(guān)的重要順式作用元件。熒光定量PCR分析表明，該基因在全光照處理（CK）時(shí)表達(dá)量較高，75%遮光時(shí)表達(dá)量較低。說(shuō)明該基因的表達(dá)受光照強(qiáng)弱的控制。

關(guān)鍵詞：茶樹(shù)；CsANS基因；啟動(dòng)子；生物信息學(xué)分析

茶樹(shù)武夷奇種C18，無(wú)性系。灌木型，中葉類，中生種。是福建省武夷山市茶葉研究所從武夷群體種中選育的優(yōu)良品系。芽葉紫紅色，茸毛較密，節(jié)稍長(zhǎng)。且芽葉生育力強(qiáng)，發(fā)芽較密，持嫩性較強(qiáng)，是一種稀有的特色茶樹(shù)資源。武夷奇種C18芽葉呈現(xiàn)紅紫色，花青素含量較高[1-2]。研究表明，花青素是茶樹(shù)葉片呈現(xiàn)“紅紫色”的主要原因[3]。植物花青素的生物合成途徑已有較為深入的研究，其中花青素合成酶（Anthocyanin synthase，ANS）是將無(wú)色花青素經(jīng)氧化脫水形成紅紫色花青素的關(guān)鍵酶[1]。

環(huán)境信號(hào)激活花青素合成途徑中相關(guān)基因的表達(dá)[4]。在花青素合成的前期，光能調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，弱光可以抑制或下調(diào)基因的表達(dá)，從而減少花青素的合成；而強(qiáng)光可以誘導(dǎo)花青素合成相關(guān)基因的表達(dá)，使花青素的含量增加[5]。光信號(hào)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子與啟動(dòng)子結(jié)合的強(qiáng)弱，并影響結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)，其表達(dá)量也會(huì)隨之發(fā)生相應(yīng)的變化[1]。

目前在茶樹(shù)上，ANS基因的啟動(dòng)子還未克隆。本研究根據(jù)已有的茶樹(shù)ANS基因的EST（Expressed sequence tags）序列，采用同源克隆和Genome Walking方法，克隆了紫葉茶樹(shù)的ANS基因及分離5′調(diào)控序列，再利用生物信息學(xué)法，預(yù)測(cè)了啟動(dòng)子的順式作用元件，采用熒光定量PCR技術(shù)，分析ANS在不同光照條件下的表達(dá)模式，有助于揭示ANS在紫色茶樹(shù)葉片對(duì)環(huán)境信號(hào)響應(yīng)過(guò)程中的作用，解析光強(qiáng)對(duì)武夷奇種C18 ANS基因的調(diào)控機(jī)理，為紫芽茶樹(shù)特異種質(zhì)的創(chuàng)制和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

1.1.1 植物材料

試驗(yàn)材料為武夷奇種C18，由福建省武夷山市茶葉研究所資源圃提供。選取武夷奇種C18的成熟葉片，迅速用液氮處理，置－80℃冰箱保存,用于基因組DNA的提取，克隆CsANS啟動(dòng)子序列。

1.1.2 遮光處理

試驗(yàn)在福建省武夷山市茶葉研究所資源圃中完成。2015年4月中旬，挑選生長(zhǎng)發(fā)育良好、整齊一致、樹(shù)形基本相似的植株27株，分為3組（每9株為1組，每重復(fù)3株），掛牌標(biāo)記，并對(duì)其進(jìn)行同一高度的修剪。待茶樹(shù)芽頭萌動(dòng)之時(shí)，開(kāi)始遮光處理。設(shè)2個(gè)處理：分別用75%和60%的黑色遮蔭網(wǎng)遮光，以全光照處理為對(duì)照。經(jīng)過(guò)15 d的遮光處理，取經(jīng)遮光處理和全光照處理（CK）的武夷奇種C18葉片（第一葉位），經(jīng)錫箔紙分裝于－80℃保存，用于熒光定量PCR檢測(cè)。

1.1.3 試劑

FH Plant DNA Kit(北京德曼特爾生物科技有限公司)；Primer Star(TaKaRa公司)；AgaroSe Gel DNA Extraction Kit(TaKaRa公司)；SMARTer RACE 5′/3′Kit(TaKaRa公司)；染色體步移試劑盒(TaKaRa公司)；pEASY-Blunt Zero Cloning Kit(福州都拜特生物技術(shù)有限公司)；引物合成及樣品測(cè)序由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 茶樹(shù)葉片總RNA及基因組DNA的提取本試驗(yàn)參照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取茶樹(shù)總RNA；采用FH Plant DNA Kit(北京德曼特爾生物科技有限公司)試劑盒提取紫葉茶樹(shù)基因組DNA。

1.2.2 茶樹(shù)CsANS 5′RACE、3′RACE及全長(zhǎng)ORF的PCR擴(kuò)增

cDNA第一鏈的合成按RevertAidTMFirst-Strand cDNA Synthesis Ki試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。根據(jù)已報(bào)道的擬南芥、葡萄、茶樹(shù)等ANS基因序列，用DNAMAN設(shè)計(jì)同源克隆引物。上游引物：5′-CAACAATGATGACTACAGTGGCTG-3′，下游引物：5′-GCGCCTTTAGAGCCAAGTTCTTG-3′。PCR擴(kuò)增體系：12.5 μL Ex-Taq mix，2 μL cDNA模板，0.5 μL ANS-R，0.5 μL ANS-F，補(bǔ)ddH2O 至25 μL體系。94℃預(yù)變性4 min，94℃變性40 s，56℃退火30 s，72℃延伸3 min，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在其ORF兩端設(shè)計(jì)特異引物qANS-R：5′-ATGGCTCTCTGTACATATGCATGTC-3′；qANS-F：5′-TTATACAATTGTTACACCCCCGGTC-3′擴(kuò)增全長(zhǎng)序列。

1.2.3 CsANS基因啟動(dòng)子的克隆

根據(jù)TaKaRa Genome Walking Kit引物設(shè)計(jì)原則，在已知的茶樹(shù)ANS基因（GenBank收錄號(hào)為AY830416.1）的已知序列區(qū)（最好不少于500 bp）分別設(shè)計(jì)3條反向且退火溫度較高的特異性引物SP1、SP2和SP3，再與試劑盒中提供的4種經(jīng)過(guò)獨(dú)特設(shè)計(jì)的退火溫度較低的兼并引物AP1、AP2、AP3和AP4進(jìn)行熱不對(duì)稱PCR反應(yīng)[6]，經(jīng)過(guò)3次巢式PCR反應(yīng)獲得已知序列的側(cè)翼序列。用于擴(kuò)增ANS基因啟動(dòng)子序列的特異性引物情況詳見(jiàn)表1。以提取的武夷奇種C18茶樹(shù)葉片DNA為模板，按照TaKaRa Genome Walking Kit說(shuō)明和林玉玲等[7]的方法進(jìn)行ANS基因啟動(dòng)子的克隆。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶克隆至pMD18-T載體，37℃連接過(guò)夜后進(jìn)行轉(zhuǎn)化測(cè)序（鉑尚生物技術(shù)有限公司）。

表1　茶樹(shù)ANS基因啟動(dòng)子克隆引物列表Table 1 Primer sequences of the promoter isolation of ANS genes in Camellia sinensis

1.2.4 熒光定量PCR表達(dá)分析

分別提取遮光75%、60%和全光照處理（CK）的武夷奇種C18第一葉位總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋10倍作模板。以18 S-rRNA基因?yàn)閮?nèi)參（18 SⅠ：5′-CCTGAGAAACGGCTACCACA-3′，18 SⅡ：5′-CACCAGACTTGCCCTCCA-3′）。運(yùn)用DNAMAN軟件，按照熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物（ANS-R：5′-GTTGCTGTAATAGGCGATGGTG-3′，ANS-F：5′-CCTGTTGGACTGTAATCTGCTAAG-3′）。參照SYBR Prime ScriptTMRT-PCR Kit （TaKaRa）說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增體系：cDNA模板1 μL，2×SYBR Premix Ex-TaqTM5 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.2 μL，用RNase-free H2O補(bǔ)足至10 μL。95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃復(fù)性34 s，共40個(gè)循環(huán)。每份樣品設(shè)3次重復(fù)。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Microsoft Excel 2007軟件，采用2-ΔΔCt法計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量[8]；應(yīng)用SPSS軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行差異顯著性分析。應(yīng)用Microsoft Excel 2007軟件作柱狀圖。

1.2.5 生物信息學(xué)分析

CsANS序列通過(guò)在線NCBI的Blast功能進(jìn)行氨基酸序列同源性比較；通過(guò)Protparam軟件對(duì)基因的分子量、等電點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，初步分析目的基因的功能；通過(guò)TMHMM和TMPred軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)；SignalP 4.1進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)；在線SOPMA預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。ProtComp Version 9.0進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

啟動(dòng)子序列通過(guò)在線Plant CAR[9]及Place軟件[10]預(yù)測(cè)其順式作用元件的種類、分布情況和生物學(xué)功能[11]。通過(guò)在線軟件BDGP[12]預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及可能的核心啟動(dòng)子區(qū)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)CsANS基因cDNA全長(zhǎng)克隆

2.1.1 茶樹(shù)CsANS基因PCR結(jié)果分析

經(jīng)PCR擴(kuò)增回收測(cè)序及使用DNAman軟件拼接獲得CsANS基因全長(zhǎng)序列1 000 bp （GenBank收錄號(hào)為KT215319）。（圖1）該序列包含1個(gè)完整的閱讀框（15～977 bp），編碼320個(gè)氨基酸，該基因含有起始密碼子ATG、終止密碼子TAA，并含有保守功能結(jié)構(gòu)域DIOX-N、20G-Fell-Oxy，屬于DIOX-N 和20G-Fell-Oxy超級(jí)家族（圖2）。

圖1　茶樹(shù)CsANS基因的全長(zhǎng)cDNAFig.1 The full length cDNA of CsANS from Camellia sinensis

2.1.2 茶樹(shù)CsANS基因的進(jìn)化分析

將武夷奇種C18茶樹(shù)ANS基因的氨基酸序列與已知的茶樹(shù)、高叢越橘（Vaccinium corymbosum）、和甘薯（Ipomoea batatas）等11種植物ANS基因的氨基酸序列進(jìn)行同源進(jìn)化樹(shù)分析（圖3）。發(fā)現(xiàn)所克隆的ANS蛋白與同屬茶樹(shù)ANS蛋白（登錄號(hào)：AY830416.1）的一致性高達(dá)100%。與其他物種比較，發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)ANS蛋白在親緣關(guān)系上與高叢越橘最近，同源性為78%。

圖3　ANS相關(guān)基因的同源進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Homologous phylogenetic tree of ANS gene related genes

2.1.3 CsANS基因氨基酸生物信息學(xué)分析

通過(guò)ProtParam軟件對(duì)CsANS氨基酸進(jìn)行基本信息分析可知，CsANS基因編碼320個(gè)氨基酸；相對(duì)分子量36 113.6 kD；理論等電點(diǎn)pI為6.23；負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）為46個(gè)，正電荷殘基（Arg+Lys）為43個(gè)；不穩(wěn)定指數(shù)為41.05，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂溶系數(shù)為：88.97，平均疏水性（GRAVY）為－0.397；分子式：C1626H2576N432O472S12，總原子數(shù)為5 118，氨基酸組成中谷氨酸含量最高，占總氨基酸的10.3%；其次為甘氨酸，占6.9%，其他氨基酸占82.8%。

利用在線軟件TMHMM Server v.2.0工具預(yù)測(cè)CsANS蛋白的跨膜螺旋區(qū)，如圖4顯示，該蛋白不是膜蛋白，無(wú)跨膜螺旋區(qū)。使用TMpred預(yù)測(cè)也顯示蛋白都分布在膜外，無(wú)跨膜蛋白。通過(guò)在線軟件COILS對(duì)CsANS氨基酸預(yù)測(cè)，在CsANS蛋白的25個(gè)氨基酸左右預(yù)測(cè)到強(qiáng)超螺旋信號(hào)。經(jīng)過(guò)SignalP-4.1預(yù)測(cè)信號(hào)肽顯示，CsANS編碼的氨基酸不含信號(hào)肽，不是分泌蛋白。對(duì)氨基酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示CsANS編碼的氨基酸中α螺旋結(jié)構(gòu)較多，有125個(gè)占所有氨基酸的39.06%，其次為無(wú)規(guī)則卷曲占31.87%，延伸鏈占17.81%，β折疊所占比例最低為11.25%。通過(guò)ProtComp Version 9.0軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，其亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)。

2.2 CsANS基因啟動(dòng)子克隆

2.2.1 CsANS基因啟動(dòng)子擴(kuò)增結(jié)果

以武夷奇種C18的DNA為模板，經(jīng)3輪巢式PCR反應(yīng)后，擴(kuò)增到1條大于1 000 bp的目的片段（圖5）。將該片段進(jìn)行克隆、測(cè)序，結(jié)果顯示，獲得的片段實(shí)際長(zhǎng)度為1 236 bp。序列經(jīng)過(guò)分析整理后，以ATG為起始位點(diǎn)，得到茶樹(shù)CsANS上游長(zhǎng)度為1 010 bp的DNA序列。

2.2.2 茶樹(shù)CsANS啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的預(yù)測(cè)

經(jīng)過(guò)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在線預(yù)測(cè)，茶樹(shù)CsANS基因1 010 bp的5′端調(diào)控序列可能存在3處核心啟動(dòng)子區(qū)域，位于35～85、316～366、480～530 bp，分值分別為0.96、1和0.88，可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)分別為G、C和T。此結(jié)果可推測(cè)位于316～366 bp的序列很可能就是該基因真正的核心啟動(dòng)子區(qū)域，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為位于第357 bp的C（圖6）。

2.2.3 茶樹(shù)CsANS基因啟動(dòng)子順式元件分析

啟動(dòng)子生物學(xué)功能的在線預(yù)測(cè)結(jié)果表明，CsANS基因啟動(dòng)子區(qū)域中，除了含有大量的核心啟動(dòng)子元件如CAAT-box和TATA-box之外，還存在多種順式元件，如脫落酸相關(guān)元件ABRE，厭氧誘導(dǎo)相關(guān)的元件ARE，熱應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)元件HSE，晝夜控制調(diào)節(jié)元件circadian，低溫應(yīng)答元件LTR，光響應(yīng)相關(guān)元件Sp1、ACE、I-box及MYB結(jié)合位點(diǎn)等（表2）。

圖2　ANS序列的超家族信息Fig.2 The super family information of the ANS sequence

圖4　CsANS跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Posterior probability for CsANS

圖5　茶樹(shù)CsANS啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增Fig.5 PCR production of CsANS promoter from Camellia sinensis

2.3 相對(duì)熒光定量PCR表達(dá)分析

以18 S-rRNA為內(nèi)參，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)不同遮光處理及未處理的武夷奇種C18葉片CsANS基因表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果（圖7）表明，其表達(dá)量在全光照處理（CK）時(shí)較高，75%遮光時(shí)較低。隨著遮光度增加，呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。說(shuō)明茶樹(shù)葉片在光照強(qiáng)時(shí)花青素合成酶（ANS）表達(dá)量高，光照弱時(shí)表達(dá)量低。

圖6　CsANS基因啟動(dòng)子分析Fig.6 CsANS gene’s promoter analysis

3 討論

CsANS是紫葉茶樹(shù)花青素合成的最后一個(gè)酶，也是將無(wú)色花青素經(jīng)氧化脫水形成紅紫色花青素的最關(guān)鍵酶，此中間產(chǎn)物進(jìn)一步與3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（3GT）偶聯(lián)并且被傳送到液泡中，形成顯色的3-O-糖苷化花青苷[13]，在植物色澤形成中具有重要作用[14]。ANS基因最初是利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)從玉米的A2突變體中鑒定和克隆得到[15]，近年來(lái)在茶樹(shù)（AY830416.1）、擬南芥（AT4G2288）、小麥（T.aestivum，AB247921）[16-17]等多種植物中也已經(jīng)得到其克隆。本研究從武夷奇種C18中克隆得到了CsANS的cDNA全長(zhǎng)序列，該基因編碼的蛋白具有典型 ANS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域：DIOX-N、20G-Fell-Oxy。DIOX-N（嗎啡合成非血紅素加氧酶的N-末端）是蛋白質(zhì)與2-酮戊二酸/鐵（Ⅱ）依賴性雙加氧酶活性的高度保守的N-末端區(qū)域。2OG-FeⅡ_Oxy氧化酶結(jié)構(gòu)域由2-酮戊二酸和Fe(Ⅱ)-依賴的氧化酶超家族組成，該家族包括脯氨酰4-羥化酶α亞基的C末端。全酶由一個(gè)α2β2復(fù)合物組成，α亞基是其主要的活性位點(diǎn)。能夠催化反應(yīng)：前膠原L-脯氨酸+2-酮戊二酸+O2=前膠原反式-4-羥基-L-脯氨酸+琥珀酸+CO2[14]。與其他已知的ANS蛋白相比，CsANS編碼的氨基酸具有較高的同源性，它與高叢越橘（JN654701.1）的同源性較高，一致性為78%。所以推斷CsANS與高叢越橘中典型的花青苷元合成酶基因的生物學(xué)功能類似。

表2　CsANS基因部分啟動(dòng)子元件Table 2 Partial element of CsANS promoter

圖7　紫葉茶樹(shù)在不同遮光處理下CsANS基因表達(dá)分析Fig.7 Purple leaf tea plant CsANS gene expression analysis under different shading treatment

環(huán)境信號(hào)激活花青素苷合成途徑，并促使茶樹(shù)葉片開(kāi)始積累花青素[18-20]。不同的外界環(huán)境因子下，葉色會(huì)隨之改變。光照是影響花青素苷合成最重要的環(huán)境因子之一。Hong等[21]對(duì)茶樹(shù)進(jìn)行暗光處理后發(fā)現(xiàn)ANS基因表達(dá)水平下降。Rosati等[17]從連翹中克隆得到ANS基因，并證明在Forsythin的花瓣中由于缺少ANS基因，所以形成無(wú)花色素苷。結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)可以看出：不同遮光處理及全光照處理的武夷奇種C18葉片中CsANS基因均有表達(dá)；全光照處理下，ANS基因表達(dá)量較高，75%遮光時(shí)較低，且遮光度增加，ANS基因表達(dá)量減少。這表明光照強(qiáng)時(shí)ANS基因表達(dá)量較高，光照弱時(shí)ANS基因表達(dá)量較低；CsANS基因?qū)τ谖湟钠娣NC18葉片色澤形成過(guò)程可能起主要作用，推斷與其基因的催化功能吻合。

近年來(lái)ANS啟動(dòng)子在洋蔥（Allium cepa L.）、三色堇（Viola×wittrockiana Gams.）、紫心甘薯[Ipomoea batatas(L.)Lam.]中已經(jīng)得到克隆[22-24]。洋蔥、紫心甘薯和三色堇的ANS啟動(dòng)子除含有多個(gè)CAAT-box、TATA-box等基本啟動(dòng)子元件外，還含有與MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的元件，以及參與光響應(yīng)、逆境、激素應(yīng)答的順式作用元件。這與本研究中武夷奇種C18的ANS啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)的順式作用元件相符，說(shuō)明不同植物間ANS基因功能類似。武夷奇種C18的ANS啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)了6種與光反應(yīng)調(diào)控有關(guān)的順式作用元件，結(jié)合CsANS基因在不同光強(qiáng)下表達(dá)量的變化，可以推測(cè)ANS是個(gè)受光照調(diào)控的基因。ANS基因在其他物種中參與光反應(yīng)的研究已有報(bào)道[25-26]，而從啟動(dòng)子角度來(lái)研究這類基因功能還鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)下一步可以構(gòu)建ANS基因的啟動(dòng)子缺失載體，轉(zhuǎn)化到植株中，通過(guò)光照處理研究該啟動(dòng)子是否為光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，確定啟動(dòng)子核心啟動(dòng)區(qū)，對(duì)光照調(diào)控ANS基因的原理加以闡釋。

參考文獻(xiàn)

[1]金琦芳,孫威江,陳志丹.光照對(duì)紫色芽葉茶花青素合成的調(diào)控機(jī)理[J].生物技術(shù)通報(bào),2015,31(6):20-27.

[2]劉富知,黃建安,付冬和.茶樹(shù)上紅紫色芽葉部分生化特性研究[J].湖南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2000,26(1):55-57.

[3]蕭力爭(zhēng),蘇曉倩,李勤.紫芽品種茶樹(shù)芽葉多酚類物質(zhì)組成特征[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2008,34(1):77-79.

[4]Sheehan MJ,Farmer PR,Brutnell TP.Structure and expression of maize phytochrome family homeologs[J].Genetics,2004,167(88):1395-1405.

[5]胡可,韓科廳,戴思蘭.環(huán)境因子調(diào)控植物花青素苷合成及呈色的機(jī)理[J].植物學(xué)報(bào),2010,45(3):307-317.

[6]林玉玲.龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中SOD基因家族的克隆及表達(dá)調(diào)控研究[D].福州:福建農(nóng)林大學(xué),2011:31-37.

[7]Lin Y L,Lai Z X.Superoxide dismutase multigene family in longan somatic embryos:a comparison of CuZn-SOD,Fe-SOD,and Mn-SOD gene structure,splicing,phylogeny,and expression[J].Molecular Breeding,2013,32(3):595-615.

[8]孫君,陳桂信,葉乃興,等.茉莉花香氣相關(guān)基因JsDXS及其啟動(dòng)子的克隆與表達(dá)分析[J].園藝學(xué)報(bào),2014,41(6):1236-1244.

[9]Lescot M,Dehais P,Moreau Y,et al.PlantCARE:A database of plant cis-acting regulatory elements and a portal to tools for in silico analysis of promoter sequences[J].Nucleic Acids Res,2002,30(1):325-327.

[10]Higo K,Ugawa Y,Iwamoto M,et al.Plant cis-acting regulatory DNA elements(PLACE)atabase[J].Nucleic Acids Research,1999,27(1):297-300.

[11]劉志欽,馬小玲,嚴(yán)雁,等.擬南芥AtLURP1基因啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)基因煙草和水稻中的功能分析[J].熱帶作物學(xué)報(bào),2013,34(2):308-313.

[12]Shahmuradov I A,Solovyev V,Gammerman A J.Plant promoter prediction with confidence estimation[J].Nucleic Acids Res,2005,33(3):1069-1076.

[13]Nakajima J,Tanaka Y,Yamazaki M,et al.Reaction mechanism from leucoanthocyanidin to anthocyanidin 3-glucoside,a key reaction for coloring in anthocyanin biosynthesis[J].Journal Biology Chemistry,2001,276(1):25797-25803.

[14]田佶,沈紅香,張杰,等.蘋果屬觀賞海棠McANS基因克隆與不同葉色品種間表達(dá)差異分析[J].園藝學(xué)報(bào),2010,37(6):939-948.

[15]Menssen A,Hohmann S,MartinW,et al.The En/Spm transposable element of zea mays contains splice sites at the temini generating a novel intron frodSpm element in the A2 gene[J].EMBO Journal,1990,9(2):3051-3057.

[16]Tanaka Y,Fukui Y,Mizutani M F,et al.Molecular cloning and characterization of rosa hybrid dihydroflavonol 4-reductase gene[J].Plant Cell Physiology,1995,36(6):1023-1031.

[17]Rosati C,Cadic A,Duron M,et al.Molecular characterization of the anthocyanidin synthase gene in forsythiax intermedia reveals organ-specific expression during flower development[J].Plant Science,1999,149(3):73-79.

[18]David W.Regulation of flower pigmentation and growth:multiple signaling pathways control anthocyanin synthesis in expanding petals[J].Physiol Plant,2000,110(28):152-157.

[19]Mori K,Sugaya S,Gemma H.Decreased anthocyanin biosynthesis in grape berries grown under elevated night temperature condition[J].Sci Hortic,2005,105(11):319-330.

[20]Mori K,Goto-Yamamoto N,Kitayama M,et al.Loss of anthocyanins in red-winegrape under high temperature[J].J Exp Bot,2007,58(68):1935-1945.

[21]Hong G,Wang J,Zhang Y,et al.Biosynthesis of catechin components is differentially regulated in dark-treated tea(Camellia sinensis L.)[J].Plant Physiol Biochem,2014,78(4):49-52.

[22]劉暢,繆軍,霍雨猛,等.洋蔥ANS基因啟動(dòng)子的克隆與瞬時(shí)表達(dá)分析[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,5(1):13-17.

[23]尚嘯.三色堇F3'H的克隆分析及ANS、DFR啟動(dòng)子的克隆[D].?？?海南大學(xué),2014:13-16.

[24]董薇,高峰.紫心甘薯花青素合成酶基因ANS啟動(dòng)子的克隆及其與轉(zhuǎn)錄因子的相互作用研究[R].廣東省植物學(xué)會(huì),2012:8-10.

[25]Papi M,Sabatini S,Altamura MM.Inactivation of the phloem-specific dof zinc finger gene DAG1 affects response to light and integrity of the testa of arabidopsis seeds[J].Plant Physiol,2002,128(2):411-417.

[26]Ward JM,Cufr CA,Denzel MA.The dof transcription factor OBP3 modulates phytochrome and cryptochrome signaling in Arabidopsis[J].Plant Cell,2005,17(2):475-485.

Cloning and Bioinformatical Analysis of Anthocyanin Synthase Gene and Its Promoter in Camellia sinensis

JIN Qifang1,3,CHEN Zhidan2,3,SUN Weijiang1,2,3*,LIN Fuming2,3,XUE Zhihui2,3,HUANG Yan2,3,TANG Xiuhua1,3

1.College of Horticulture,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China; 2.College of Tea,Fujian Agriculture and Forestry University,Quanzhou 362400,China; 3.Fujian-Taiwan Joint Centre for Ecological Control of Crop Pests,Fuzhou 350002,China

Abstract:The full length cDNA sequence of anthocyanin synthase gene（CsANS）was cloned from‘Wuyi qizhong C18’(Camellia sinensis)using rapid amplification of cDNA ends（RACE）technology.The promoter of CsANS was isolated using Genome Walking technology.The gene expression of ANS under different shading treatments was analyzed by the real-time PCR.The results showed that the full length cDNA of CsANS was 1 000 bp,and it contained a 957 bp open reading frame(ORF),which encoding a protein of 320 amino acid,including two conservative functional domains,DIOX-N and 20G-Fell-Oxy.A sequence containing 1 010 bp was isolated and found to be the promoter of CsANS,which contained many cis-acting elements related to anthocyanin biosynthetic pathway,such as the core promoter element TATA-box and light responsive element(including ACE,GT1-motif and Sp1),circadian(cis-acting regulatory element involved in circadian control).The real-time PCR analysis revealed that the gene was highly expressed under the sunshine(CK),while lowly expressed under the 75% shading.This study reveals that the expression of CsANS was regulated by light intensity.

Keywords:Camellia sinensis,CsANS gene,promoter,bioinformatics analysis

作者簡(jiǎn)介：金琦芳，女，碩士研究生，主要從事茶樹(shù)分子生物學(xué)研究。*通訊作者：swj8103@126.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家“863”計(jì)劃閩臺(tái)優(yōu)異茶樹(shù)種質(zhì)發(fā)掘創(chuàng)新與保護(hù)利用（2013AA10260605）、紫化芽葉茶樹(shù)種質(zhì)資源的挖掘保存與創(chuàng)新利用（2015N5008）。

收稿日期：2015-11-23

修訂日期：2015-12-16

中圖分類號(hào)：S571.1；Q52

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-369X（2016）02-219-10