周發(fā)林+鄭麗明+楊其彬+黃建華+楊麗詩+江世貴

摘要：為深入研究斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）金屬硫蛋白MT（Pm-MT）基因參與斑節(jié)對蝦性腺發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)制，根據(jù)Pm-MT基因的cDNA序列，利用普通PCR和染色體步移（Genome Walking）技術(shù)獲得Pm-MT基因的DNA全長序列，該基因序列DNA全長為2 744 bp，由2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子組成。其中啟動(dòng)子區(qū)域?yàn)?06 bp，2個(gè)內(nèi)含子長度分別為1 194、242 bp，3個(gè)外顯子長度分別為22、78、77 bp。在啟動(dòng)子區(qū)域預(yù)測到轉(zhuǎn)錄因子糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件和雌激素應(yīng)答元件與卵巢發(fā)育密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）；金屬硫蛋白；全基因DNA克?。簧镄畔W(xué)分析

中圖分類號：S945.4+7；Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）03-0575-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.03.047

Cloning and Bioinformatic Analysis of Metallothionein Gene DNA

Sequence in Penaeus monodon

ZHOU Fa-lin， ZHENG Li-ming， YANG Qi-bin， HUANG Jian-hua， YANG Li-shi， JIANG Shi-gui

（South China Sea Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Guangzhou 510300， China）

Abstract： For further research on the molecular mechanism of Penaeus monodon MT （Pm-MT） involved in Gonadal development regulation，the PCR and genome walking technology was used to obtain the full length of Pm-MT DNA sequence，basis of the cDNA sequence. The full length of Pm-MT DNA sequence was 2 744 bp，made up of 2 introns and 3 exons. The promoter region was 806 bp，the length of introns were 1 194 bp and 242 bp respectively，the exons were 22 bp，78 bp and 77 bp each. And that predicted in the promoter region of glucocorticoid receptor element and estrogen response element with the ovarian development of two closely related transcription factors.

Key words： Penaeus monodon； metallothionein； gene DNA sequence clone； bioinformatic analysis

金屬硫蛋白（Metallothioneins，MTs）是一類富含半胱氨酸的胞內(nèi)小分子蛋白，在動(dòng)物、植物和微生物的細(xì)胞內(nèi)廣泛分布[1-3]。大量研究已證明，MTs具有調(diào)解氧自由基和氮氧化物并抑制細(xì)胞凋亡、重金屬解毒、降低紫外線/離子輻射以及參與應(yīng)激反應(yīng)等多種生物學(xué)功能[4-12]。此外，MTs在生殖方面的功能也有不少報(bào)道。劉代成等[13]研究發(fā)現(xiàn)，血清孕酮和肝MTs之間呈正相關(guān)。Ioachim等[14]發(fā)現(xiàn)，MT基因在正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)水平與雌、孕激素受體（ER、PR）呈負(fù)相關(guān)。Espey等[15]研究表明，絨毛膜促性腺激素（HCG）能促進(jìn)小鼠卵巢中MT mRNA的表達(dá)顯著增加。以上結(jié)果均表明，該基因參與了動(dòng)物的生殖和繁育過程。

已有研究表明，斑節(jié)對蝦MT的mRNA在其6個(gè)不同發(fā)育期的卵巢中表達(dá)量均很高，其中在Ⅱ期卵巢中的表達(dá)量最高[16]。因此，MT基因可能在斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育過程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。為了更深入研究這一功能，本研究克隆分析MT全基因DNA序列，為該基因在斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育中分子調(diào)控機(jī)理提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

斑節(jié)對蝦來源于海南省三亞市附近對蝦養(yǎng)殖池塘，其體重20～30 g，用于DNA克隆分析。試驗(yàn)用蝦在水溫（25±1） ℃、鹽度為3%的循環(huán)水池中暫養(yǎng)3 d后使用。

1.2 化學(xué)試劑

BspQⅠ、NotⅠ購自NEB公司；T4連接酶、Ex Taq購自TaKaRa公司；DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)λDNA/Hind Ⅲ購自東盛公司；PCR 產(chǎn)物清潔試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒購自AxyGen公司；基因組DNA純化試劑盒E.Z.N.A.？誖 MicroElute？誖 DNA Clean-Up Kit（D6296-00）購自O(shè)MEGA公司；海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒（DP324-02）、二抗（羊抗鼠IgG-HRP）和增強(qiáng)型HRP-DAB底物顯色試劑盒購自天根生化科技有限公司。

1.3 斑節(jié)對蝦金屬硫蛋白全基因DNA的克隆

1.3.1 基因組DNA提取和純化 按照海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN）使用說明提取合斑節(jié)對蝦基因組DNA。按照MicroElute？誖DNA Clean-Up Kit（OMEGA）使用說明純化基因組DNA。

1.3.2 Pm-MT基因內(nèi)含子擴(kuò)增 根據(jù)已知的Pm-MT基因cDNA全序列（GenBank 登錄號ADQ28316.1），分別在5'UTR和3'UTR區(qū)域設(shè)計(jì)上下游引物SMT（31）和AMT（337）（表1），以斑節(jié)對蝦基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×Ex Taq Buffer （Mg2+ Plus） 2.5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L） 1.5 μL，AMT（337）（10 μmol/L）1 μL，SMT（31）（10 μmol/L）1 μL，Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL，DNA 1 μL，dH2O 17.25 μL，體系為25 μL。一擴(kuò)PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 35 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 50 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min；最后4 ℃保溫。

1.3.3 Pm-MT基因啟動(dòng)子擴(kuò)增 按照Genome Walking Kit（TaKaRa）的使用說明采用染色體步移的方法擴(kuò)增Pm-MT基因5′上翼序列。根據(jù)已知的Pm-MT DNA序列設(shè)計(jì)3個(gè)特異性引物，分別為AMT（623）、AMT（341）和AMT（84）（表1）。

基因組DNA經(jīng)純化后，取適量作為模板，以AP Primer（4種AP1 Primer～AP4 Primer）作為上游引物，AMT（623）、AMT（341）和AMT（84）為下游引物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。

PCR反應(yīng)體系：10×LA PCR Buffer Ⅱ（Mg2+ Plus） 5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L） 8 μL，引物各1 μL，TaKaRa LA Taq（5 U/μL）0.5 μL，DNA 2 μL，dH2O 32.5 μL，總體系50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min；98 ℃ 1 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 30 s；25 ℃ 3 min；72 ℃ 2 min；根據(jù)不同引物使用不同退火溫度和時(shí)間。

1.3.4 序列分析 利用啟動(dòng)子分析軟件BDGP（Berkeley Drosophila Genome Project）（http：//www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）、啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)分析TFSEARCH（http：//www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html） 和Alibab2.1（http：//www.gene-regulation.com/pub/programs/alibaba2/index.html）進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑節(jié)對蝦基因組DNA的提取

使用海洋動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒（TIANGEN）提取斑節(jié)對蝦基因組DNA后，取5 μL用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果。如圖1所示，DNA片段接近20 kb，主帶清晰，可以滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.2 Pm-MT內(nèi)含子擴(kuò)增結(jié)果

以5′UTR和3′UTR區(qū)域的上下游引物SMT（31）和AMT（337）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，所得Pm-MT內(nèi)含子條帶在2 000 bp左右。

2.3 染色體步移結(jié)果

由圖3可知，染色體步移PCR中，以AMT（623）、AP1-AP4為引物，擴(kuò)增結(jié)果AP1-AP4對應(yīng)均有明顯條帶；以AMT（341）為引物，擴(kuò)增后AP1、AP2和AP3對應(yīng)均有明顯條帶，而AP4的條帶很弱；最后以AMT（84）為引物，只有AP2和AP3對應(yīng)有明顯條帶，最大的清晰條帶在1 000 bp左右。

2.4 Pm-MT基因DNA序列及啟動(dòng)子序列分析

選取染色體步移以AMT（84）進(jìn)行PCR的明顯條帶，經(jīng)切膠回收、克隆測序后進(jìn)行序列分析。在測序結(jié)果中可找到特異性引物AMT（84），將此段序列與Pm-MT基因cDNA上游序列進(jìn)行比對，確定兩條序列對應(yīng)部分一致。將克隆測序得到Pm-MT基因啟動(dòng)子序列806 bp、內(nèi)含子擴(kuò)增測序所得序列1 730 bp和Pm-MT cDNA序列502 bp拼接后獲得基因組DNA全長（圖4），該基因序列DNA全長為2 744 bp，由2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子組成，其中啟動(dòng)子區(qū)域?yàn)?06 bp，2個(gè)內(nèi)含子長度分別為1 194、242 bp， 3個(gè)外顯子長度分別為22、78、77 bp。Pm-MT基因的外顯子和內(nèi)含子接頭區(qū)符合手提拼接點(diǎn)和供體拼接點(diǎn)的Chambon法則（GT-AG法則）。

利用啟動(dòng)子分析軟件BDGP（Berkeley Drosophila Genome Project）可預(yù)測到2個(gè)啟動(dòng)子序列分別位于-130～-81 bp處（TGCATAAATATATAAAAGATTAGTT

TCAGTTCAATCGTTAAAAGCTTAAC）和-38～12 bp處（CTTACGTCAATATAAACATTGTACACGTGGTGT

CCGACACAGAAGCTCAA）。

利用啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)分析軟件TFSEARCH和Alibab2.1預(yù)測，可得到Pm-MT啟動(dòng)子區(qū)域包含2個(gè)TATA盒，分別位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-301～-295 bp處和-122～-114 bp處，無GC盒和CAAT盒。該基因啟動(dòng)子區(qū)還包含組成型表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Sp1、基因上游激活因子USF、增強(qiáng)子AP1和Oct-1、轉(zhuǎn)錄激活因子ATF、聚合酶相關(guān)蛋白RAP1、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控元件CRE-BP1、糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件GRE、熱休克應(yīng)答元件轉(zhuǎn)錄因子HSF、血清應(yīng)答元件轉(zhuǎn)錄因子SRF、雌激素應(yīng)答元件ERE，以及C/EBPalp、E4、C/EBPbeta、Antp、Ftz、YY1等潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

3 討論

為進(jìn)一步探討Pm-MT與卵巢發(fā)育調(diào)控的關(guān)系，利用染色體步移技術(shù)和普通PCR技術(shù)相結(jié)合的方法，獲得了Pm-MT基因的DNA全長序列，含3個(gè)外顯子、2個(gè)內(nèi)含子，與其他動(dòng)物的MT基因基本一致[17]。不過，斑節(jié)對蝦MT基因第一個(gè)內(nèi)含子為1 194 bp，比一般動(dòng)物的要長[17]。此外，斑節(jié)對蝦MT基因內(nèi)含子的兩側(cè)都具有RNA正確剪接所必須的識別位點(diǎn)（GT/AG），這與其他基因的內(nèi)含子識別序列完全一致。

Pm-MT基因與斑節(jié)對蝦的CHH基因[18，19]及中華絨螯蟹蛻皮抑制激素1基因[20]DNA組成結(jié)構(gòu)相類似，均含有與其他真核基因相似的啟動(dòng)子元件特征，包括TATA盒，cAMP效應(yīng)元件結(jié)合蛋白CREB、Pit-1和AP-1等3個(gè)反應(yīng)原件結(jié)合蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件GRE是MT基因內(nèi)對甾體激素產(chǎn)生應(yīng)答的元件，斑節(jié)對蝦MT基因也含有。GRE通過與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合體（glucocorticoid receptor，GR）結(jié)合，由此介導(dǎo)甾體激素對MT的誘導(dǎo)[21]。李文佼[22]利用克隆78 bp的人絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞11β-羥基類固醇脫氫酶1型（11β-HSD1）基因啟動(dòng)子構(gòu)建于含熒光素酶報(bào)告基因的質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)染W(wǎng)ISH細(xì)胞株，研究糖皮質(zhì)激素啟動(dòng)子活性的機(jī)制。結(jié)果表明，皮質(zhì)醇對WISH細(xì)胞11β-HSD1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用是通過其基因啟動(dòng)子區(qū)實(shí)現(xiàn)的；皮質(zhì)醇對11β-HSD1基因啟動(dòng)子活性的促進(jìn)作用可能是通過翻譯起始點(diǎn)上游78 bp的序列實(shí)現(xiàn)的，而且與糖皮質(zhì)激素受體有關(guān)。萬順倫[23]利用大鼠海馬11β-HSD1啟動(dòng)子區(qū)，構(gòu)建以CAT酶為報(bào)告基因的pBLCAT6質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染PC12細(xì)胞株，研究結(jié)果表明妊娠期糖皮質(zhì)激素對海馬神經(jīng)元11β-HSD1表達(dá)的上調(diào)作用是通過MR和GR（以GR為主）和11β-HSD1啟動(dòng)子區(qū)實(shí)現(xiàn)的。據(jù)此可推論，Pm-MT的表達(dá)受體內(nèi)甾體激素調(diào)控，并可能參與斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育及生殖活動(dòng)。根據(jù)軟件Alibab2.1預(yù)測，Pm-MT基因啟動(dòng)子區(qū)域還含有雌激素應(yīng)答元件ERE（estrogen responsive element）。Govind等[24]研究得到，雌激素與核受體ER結(jié)合，ER即形成二聚體，并與靶基因啟動(dòng)子序列內(nèi)的增強(qiáng)子序列——雌激素應(yīng)答元件ERE結(jié)合而誘導(dǎo)靶基因表達(dá)。雌激素是甾體激素，且預(yù)測中Pm-MT啟動(dòng)子區(qū)域的糖皮質(zhì)激素應(yīng)答元件和雌激素應(yīng)答元件序列重合，提高了Pm-MT的表達(dá)受體內(nèi)甾體激素調(diào)控此推測的可信度。而進(jìn)一步確認(rèn)Pm-MT表達(dá)與甾體激素調(diào)控的關(guān)系，需進(jìn)行功能性研究。

胰高血糖素、血管緊張素、糖皮質(zhì)激素均可誘導(dǎo)鼠、兔和家貓肝腎等器官金屬硫蛋白的合成[13]。本研究根據(jù)Pm-MT基因在啟動(dòng)子區(qū)域的分析，推測Pm-MT在斑節(jié)對蝦中的表達(dá)與CHH家族激素、甾體激素的調(diào)控相關(guān)。本推測與劉代成等[13]研究結(jié)論相似，為今后進(jìn)一步研究該基因在斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育中的作用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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