鄧林霞+陳小強+覃美運+張亞鶴

摘要：以兜唇石斛[Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher]試管苗為材料，探討在不同濃度NaCl脅迫下，不同濃度外源GABA對兜唇石斛組培苗生長的影響，通過測定兜唇石斛組培苗葉片中的脯氨酸含量來確定外源GABA對鹽脅迫的緩解效應(yīng)。結(jié)果表明，在相同濃度的NaCl脅迫下，加入GABA可明顯提高兜唇石斛組培苗中的脯氨酸含量，說明外源GABA對兜唇石斛組培苗鹽脅迫有明顯的緩解效應(yīng)，且緩解效果最佳的外源GABA濃度為7 mmol/L。

關(guān)鍵詞：兜唇石斛[Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher]；NaCl脅迫；脯氨酸；γ-氨基丁酸

中圖分類號：R282；Q813.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）03-0579-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.03.048

Effects of Gamma Aminobutyric Acid on the Growth of Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher Seedlings under NaCl Stress

DENG Lin-xia，CHEN Xiao-qiang，QIN Mei-yun，ZHANG Ya-he

（College of Agronomy & Resources and Environment， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384，China）

Abstract： The seedlings of Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher were used as materials to study the different concentrations of NaCl stress， effects of different concentrations of exogenous GABA on the growth of Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher plantlets. The rusults showed that the content of the proline from seedlings in leaves of Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher would determine exogenous GABA on salt stress relieving effects. Finally， in the same concentration of NaCl stress conditions， exogenous GABA would significantly improve the proline content in Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher seedlings. And the optimal concentration of exogenous GABA was 7 mmol/L.

Key words： Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher； NaCl stress； proline； gamma aminobutyric acid

石斛來源于蘭科石斛屬多種植物的新鮮或干燥莖，是中國歷史悠久的名貴中藥材，具有益脾生津，滋陰清熱的功效，主治熱病傷津、胃痛干嘔、肺燥干咳、腰膝軟弱等癥狀[1，2]。現(xiàn)代藥理試驗證明，石斛具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等多種活性[3-5]。兜唇石斛[Dendrobium aphyllum（Rohb.）C.E.Fishcher]屬于蘭科（Orchidaceae）植物，分布于中國長江以南（廣西、云南、貴州）、尼泊爾、錫金、不丹、印度東北部至中南半島和馬來西亞[6]；生長在400～1 500 m的疏林樹干上或山谷巖石上[7]。

兜唇石斛有重要的觀賞價值和較高的藥用價值。近年來，由于森林砍伐嚴重、藥用開發(fā)過多等因素，自然界中石斛蘊藏量逐年減少[8]。且石斛生長速度緩慢，加上繁殖率低等特點，許多優(yōu)良品種無法大量繁殖以滿足日益增長的市場需求。針對這一問題，利用組織培養(yǎng)技術(shù)可以擴大石斛蘭生產(chǎn)規(guī)模。土壤鹽漬化是農(nóng)作物生產(chǎn)中最嚴重的非生物逆境之一，選育耐鹽作物，提高作物對鹽漬環(huán)境的適應(yīng)能力，是減輕土壤鹽漬化危害的重要途徑之一。因此，研究植物耐鹽性是植物耐鹽育種的基礎(chǔ)。目前，石斛的生產(chǎn)多利用設(shè)施農(nóng)業(yè)通過溫室栽培大量培養(yǎng)，而溫室的環(huán)境相對封閉，室內(nèi)的溫度較高，導致基質(zhì)水分大量蒸發(fā)，鹽分含量增高，不利于兜唇石斛生長發(fā)育。所以，研究提高作物耐鹽堿性的方法與機理有重要意義。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid，簡稱GABA）又稱γ-氨酪酸，是一種非蛋白質(zhì)組成的天然氨基酸，分布廣泛；具有降低血壓、控制哮喘、治療癲癇等功能[9]。研究表明，植物體內(nèi)γ-氨基丁酸（GABA）能在一定程度上增強逆境脅迫下植物的抗性。鹽脅迫條件下GABA對甜瓜[10]、玉米[11]、小麥[12]等的影響已有報道，對GABA緩解兜唇石斛鹽脅迫傷害的研究鮮見報道。在逆境條件下（旱、鹽堿、熱、冷、凍），植物體內(nèi)脯氨酸含量顯著增加，脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性。本研究通過對不同濃度NaCl脅迫下，不同濃度外源GABA對兜唇石斛組培苗生長的影響進行分析，建立最適宜兜唇石斛生長的組織培養(yǎng)體系；同時通過測定兜唇石斛組培苗葉片中的脯氨酸含量來確定外源GABA對鹽脅迫的緩解效應(yīng)，篩選出緩解效果最佳的外源GABA濃度，進而為外源GABA引導兜唇石斛抗逆栽培提供理論基礎(chǔ)，為石斛抗逆栽培和抗性育種研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為兜唇石斛試管苗，取自天津農(nóng)學院農(nóng)學與資源環(huán)境學院植物細胞工程研究中心。

1.2 方法

1.2.1 兜唇石斛苗的擴繁 取兜唇石斛試管苗接種于新的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為MS+15 g蔗糖+6.5 g瓊脂+2.0 mg/L6-BA+0.5 mg/L NAA。為保證后續(xù)試驗所需材料的數(shù)量，共培養(yǎng)60瓶，每瓶接種3個種苗，每個種苗高2 cm左右。

1.2.2 NaCl脅迫下GABA對兜唇石斛組培苗生長的影響 設(shè)置NaCl的濃度梯度0.4%、0.6%、0.8%，分別加入不同濃度的GABA（0、1、3、5、7、9 mmol/L）（表1），每組配比重復(fù)5次。觀察培養(yǎng)30 d，通過測定各個濃度配比中組培苗葉片內(nèi)的脯氨酸含量來確定外源GABA對鹽脅迫的緩解效應(yīng)。

1）制作脯氨酸標準曲線。按照脯氨酸含量的測定方法[13，14]，以脯氨酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，其線性回歸方程為y=0.023 6x+0.001 3（R2=0.988 2），如圖1所示。

2）樣品測定。稱取0.5 g兜唇石斛葉片放到具塞試管中（3次重復(fù)），加入5 mL 3%的5-磺基水楊酸溶液，沸水浴10 min，冷卻后吸取上清液。具塞試管中加入2 mL上清液，2 mL冰醋酸和2 mL酸性茚三酮，進行沸水浴30 min。冷卻后向具塞試管中加入4 mL的甲苯充分振蕩，以萃取紅色物質(zhì)。在3 000 r/min下離心5 min，靜置分層后吸取甲苯層，以甲苯溶液為對照，在分光光度計520 nm波長下比色，測得各處理下試管苗中脯氨酸的吸光度。

根據(jù)回歸方程計算出2 mL測定液中脯氨酸的含量，然后計算樣品中脯氨酸含量百分數(shù)。計算公式如下[14]：

脯氨酸（μg/g FW或DW）=（C×V/a）/W （1）

式中，C為提取液中脯氨酸含量（μg），由標準曲線求得；V為提取液總體積（mL）；a為測定時所吸取提取液的體積（mL）；W為樣品質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 兜唇石斛苗的擴繁

經(jīng)過50 d的觀察，兜唇石斛的生長狀況如圖2所示。培養(yǎng)過程中兜唇石斛污染率為0，死亡率為3.25%。在培養(yǎng)基MS+15 g蔗糖+6.5 g瓊脂+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA培養(yǎng)條件下組培苗的長勢最好，葉色由剛開始培養(yǎng)的淡綠變?yōu)樯罹G，植株健壯且無病害。

2.2 NaCl脅迫下GABA對兜唇石斛組培苗生長的影響

在逆境條件下，植物體內(nèi)的脯氨酸含量顯著增加，脯氨酸是植物體內(nèi)的一種重要調(diào)節(jié)物質(zhì)[15]，植物通過不斷積累脯氨酸來適應(yīng)不同的鹽堿環(huán)境。因此，不同濃度NaCl脅迫下，兜唇石斛苗體內(nèi)的脯氨酸含量不同。為避免分光光度計測量值造成誤差，在測量組培苗中脯氨酸含量前，先繪制脯氨酸的標準曲線，得到脯氨酸濃度（X）與吸光度（Y）的回歸方程Y=0.068 1X+0.006 4（R2=0.988 2）。用分光光度計測定組培苗脯氨酸提取液的吸光度，代入回歸方程得出不同處理下兜唇石斛組培苗體內(nèi)所含的脯氨酸濃度；將得到的脯氨酸濃度再代入公式（1），得到脯氨酸含量。加入GABA后，不同NaCl濃度處理下兜唇石斛組培苗葉片內(nèi)的吸光度、脯氨酸濃度和脯氨酸含量如表2所示。此培養(yǎng)過程中兜唇石斛組培苗的污染率為4.0%，死亡率為7.35%。

由于植物體內(nèi)GABA能在一定程度上增強逆境脅迫下植物的抗性，由表2中所得數(shù)據(jù)對比后發(fā)現(xiàn)，在相同濃度的NaCl脅迫條件下，加入GABA可顯著提高兜唇石斛組培苗中脯氨酸含量，說明外源GABA對兜唇石斛組培苗有明顯的緩解效應(yīng)。

圖3為不同濃度NaCl脅迫下，不同濃度GABA對兜唇石斛組培苗葉片內(nèi)脯氨酸含量的影響。由圖3可看出，在相同NaCl濃度脅迫下，組培苗葉片內(nèi)的脯氨酸含量在一定程度上呈上升趨勢；不同NaCl濃度脅迫下，隨著GABA濃度的上升，脯氨酸的含量逐漸上升，并在7 mmol/L時達到最高，然后開始下降；在NaCl脅迫的條件下，緩解兜唇石斛組培苗鹽脅迫效果最佳的外源GABA濃度為7 mmol/L。

3 小結(jié)與討論

3.1 兜唇石斛的擴繁

外源激素對于兜唇石斛組織培養(yǎng)有著顯著影響，6-BA是細胞分裂類激素，有利于細胞的分化及出芽[16，17]。NAA是生長素類激素，對于植物體的生根有重要作用[18]。在MS培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入適宜濃度的6-BA和NAA，可使組培苗生長得更快。

3.2 NaCl脅迫下GABA對兜唇石斛組培苗生長的影響

逆境脅迫下，GABA作為一種特殊的氨基酸，與植物體內(nèi)碳素和氮素兩大代謝途徑密切相關(guān)，而且外源GABA能夠通過參與植株體內(nèi)活性氧代謝，在調(diào)節(jié)植物細胞對逆境的適應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用[19]。植物遇到生理脅迫和病蟲害等逆境條件時，體內(nèi)的GABA含量會迅速增加[20-22]。正常條件下，植物組織中GABA的內(nèi)源水平在0.03～32.5 μmol/g（FW），而當植物受到環(huán)境脅迫（缺氧、冷害、熱刺激以及機械損傷等）時，體內(nèi)GABA含量會增加幾倍或幾十倍[23，24]。羅黃穎等[25]研究了外源GABA浸種處理對NaCl脅迫下番茄種子萌發(fā)及幼苗生長和生理代謝的影響，結(jié)果表明，外源GABA浸種處理能夠通過促進番茄種子萌發(fā)和幼苗生長緩解鹽脅迫的傷害，其中10 mmol/L處理效果較好。趙九洲等[10]研究表明，當GABA噴施濃度在25～50 mmol/L時，對鹽堿脅迫下甜瓜幼苗生長有一定緩解作用，其中50 mmol/L緩解鹽堿脅迫效果最好，而75 mmol/LGABA無有效緩解作用。田小磊等[11]以玉米黃化幼苗為材料，分析在鹽脅迫條件下外源GABA對玉米種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，推斷GABA可通過提高保護酶系統(tǒng)活性緩解鹽脅迫對植物的傷害。李巖巖[12]通過分析GABA對小麥生長狀況及其生理生化產(chǎn)生的影響，推斷出GABA能提高小麥的耐鹽性。

本試驗研究不同濃度外源GABA對兜唇石斛組培苗在不同濃度NaCl脅迫下的緩解效應(yīng)，結(jié)果表明，在相同濃度NaCl脅迫下，加入GABA可顯著提高兜唇石斛組培苗中脯氨酸含量，說明外源GABA對兜唇石斛組培苗有明顯的緩解效應(yīng)；在不同NaCl濃度脅迫下，隨著外源GABA濃度的升高，脯氨酸含量逐漸上升，并在7 mmol/L時達到最高，然后開始下降。因此，在NaCl脅迫下，緩解兜唇石斛組培苗鹽脅迫效果最佳的外源GABA濃度為7 mmol/L。

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