孫曉梅+黃金光

摘要： 克隆獲得禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）2個(gè)甾醇14α脫甲基酶CYP51蛋白（CYP51A、CYP51B）基因cDNA序列，明確其氨基酸序列典型特征，為研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及其抗藥性機(jī)制奠定基礎(chǔ)。采用RT-PCR技術(shù)，克隆2個(gè)CYP51蛋白基因cDNA序列，利用相關(guān)生物信息軟件對(duì)其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果克隆到2條cDNA序列，長度分別為1 524、1 581 bp，分別編碼507、526個(gè)氨基酸；2個(gè)蛋白分子量分別為57.5、59.3 ku，等電點(diǎn)分別為693、7.08，不穩(wěn)定系數(shù)分別為49.43、39.05；2個(gè)蛋白均含有細(xì)胞色素P450家族成員典型的保守結(jié)構(gòu)域；不具有信號(hào)肽的屬于非分泌性蛋白，具有跨膜結(jié)構(gòu)域，是親水性蛋白；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)最主要的結(jié)構(gòu)元件是α螺旋、無規(guī)則卷曲，并散布于整個(gè)蛋白中；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，CYP51A蛋白主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體等細(xì)胞器中，而CYP51B主要位于細(xì)胞質(zhì)中。研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究CYP51蛋白生物學(xué)功能及其蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)提供參考。

關(guān)鍵詞： 禾谷鐮刀菌；甾醇14α脫甲基酶；基因克隆；抗藥性；生物信息學(xué)分析；cDNA

中圖分類號(hào)： S182；Q785 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）03-0031-05

小麥赤霉?。╢usarium head blight，F(xiàn)HB）是我國小麥生產(chǎn)中最主要的病害之一，由鐮刀菌屬（Fusarium spp.）多種真菌引起[1]。在全世界范圍內(nèi)，禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）是小麥赤霉病主要的病原菌，在2012年Molecular Plant Pathology上發(fā)表的十大病原真菌中，由于其發(fā)生的普遍性和重要性，居于第4位[2]。使用殺菌劑是控制赤霉病發(fā)生和危害的主要手段，通常用于防治小麥赤霉病的殺菌劑為苯并咪唑類殺菌劑多菌靈[3]。但是長期、單一、大量使用，使其產(chǎn)生了嚴(yán)重的抗藥性，造成防效顯著下降。因此，明確禾谷鐮刀菌對(duì)唑類殺菌劑產(chǎn)生抗性機(jī)制具有重要的理論、生產(chǎn)實(shí)踐價(jià)值。殺菌劑作用于甾醇生物合成中的14α脫甲基酶（CYP51），CYP51屬于細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450，簡(jiǎn)稱CYP）家族第5類中唯一的一個(gè)家族，與P450其他家族相比，CYP51功能非常保守，作用于移除甾醇前體14α位的甲基，又稱為甾醇14α脫甲基酶，催化酵母、真菌羊毛甾醇或齒孔醇，植物鈍葉醇和哺乳動(dòng)物二氫羊毛甾醇的14α位脫甲基反應(yīng)，具有較強(qiáng)的底物特異性[4-6]。病原真菌中含有多個(gè)CYP51基因，對(duì)唑類藥劑產(chǎn)生抗性的病原菌中，CYP51基因點(diǎn)突變是病原菌對(duì)唑類殺菌劑產(chǎn)生抗性的主要機(jī)制[7-9]。由于唑類殺菌劑中均含有1個(gè)含氮雜環(huán)，雜環(huán)上的氮原子可以與CYP51蛋白血紅素-鐵活性中心以配位鍵結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)底物的結(jié)合位點(diǎn)，使酶的活性受到抑制。當(dāng)唑類殺菌劑結(jié)合區(qū)域的氨基酸位點(diǎn)發(fā)生突變后，使藥劑與CYP51蛋白的結(jié)合能力下降，引起病原菌的抗藥性。在人類病原菌白色念珠菌（Candida albicans）點(diǎn)突變研究中已經(jīng)證實(shí)了上述假設(shè)，如F145L[10]、Y132H、R467K[11]等突變。迄今為止，CYP51突變引起抗藥性報(bào)道最多的真菌是C. albicans，其引起抗性的突變位點(diǎn)多達(dá)50個(gè)。對(duì)已報(bào)道的突變位點(diǎn)的位置進(jìn)行分析，大部分突變位點(diǎn)集中在2個(gè)區(qū)域，分別為CYP51蛋白的N端、C端，這可能與蛋白折疊后的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)中底物和藥劑的結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)[12]。CYP51蛋白N端包括α螺旋B、B′、C及其中間的Loop連接部分，在這個(gè)區(qū)域的點(diǎn)突變中，尤其以位于α螺旋B′和C之間的1個(gè)酪氨酸突變引起的抗性報(bào)道最多，包括C. albicans中CYP51的Y132F位點(diǎn)突變[13]，以及其他真菌斐濟(jì)球腔菌（Mycosphaerella fijiensis）、白粉病菌（Blumeria graminis f. sp.）中的Y136F[14-15]，禾生球腔菌（Mycosphaerella graminicola）中的Y137F[16]，以及葉銹菌（Puccinia triticina）中的Y134F位點(diǎn)突變等[17]。M. graminicola中的Y137F突變使三唑醇不能夠再與酶結(jié)合，引起抗性的發(fā)生[18]。第2個(gè)突變區(qū)域?yàn)?CaCYP51 蛋白氨基酸序列的428～459位或MgCYP51蛋白氨基酸序列的438～463位[19]。MgCYP51中保守位點(diǎn)Y459、G460及Y461的突變或/和缺失都能夠引起唑類殺菌劑敏感性下降[20]。可見，CYP51蛋白氨基酸突變使病原菌對(duì)藥劑產(chǎn)生抗藥性。CYP51功能非常保守，但是不同生物中CYP51氨基酸序列的同源性不高，生物界之間其氨基酸的相似性只有 22%～30%；而同一生物界中，其氨基酸序列的同源性較高，在動(dòng)物、植物、真菌中CYP51的相似性分別為64%、41%、42%[21]。禾谷鐮刀菌含有3個(gè)CYP51基因FGCYP51A、FGCYP51B、FGCYP51C，這3個(gè)基因雖然序列同源性較高，卻發(fā)揮著不同的功能。Fan等對(duì)這3個(gè)基因的功能進(jìn)行了遺傳學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)FGCYP51A與FGCYP51B編碼甾醇14α脫甲基酶，與病原菌對(duì)唑類殺菌劑的敏感性密切相關(guān)[22]。

目前，病原真菌中CYP51蛋白三維結(jié)構(gòu)未見報(bào)道，且有關(guān)CYP51抗藥性機(jī)制研究集中在基因遺傳突變研究。因此，有必要從CYP51的蛋白結(jié)構(gòu)入手研究其抗藥性機(jī)制。解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)首先要對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，構(gòu)建包含主要功能域的表達(dá)載體，進(jìn)而體外純化出高質(zhì)量的目標(biāo)蛋白，為后續(xù)生物學(xué)功能及生化功能試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。本研究采用RT-PCR技術(shù)，克隆2個(gè)CYP51蛋白基因cDNA序列，利用生物信息學(xué)方法，對(duì)禾谷鐮刀菌FGCYP51A、FGCYP51B基因編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，包括氨基酸組成、預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域、信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)域及亞細(xì)胞定位等，以期為進(jìn)一步研究CYP51蛋白晶體結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種 本試驗(yàn)菌種為禾谷鐮刀菌（F. graminearum）PH-1[23]。

1.1.2 主要試劑 總RNA提取試劑（Trizol Reagent）、總反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）、DNase，購自Promega公司；PCR克隆試劑盒TaKaRa RNA PCR Kit、SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit、質(zhì)粒提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit）、Taq酶、pMD18-T，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 RNA提取和RT-PCR 收集禾谷鐮刀菌菌絲體，抽干后置于液氮中速凍并轉(zhuǎn)移，于-80 ℃?zhèn)溆谩囊旱腥〕隼鋬龀楦傻木z約100 mg，置于預(yù)冷的研缽中，磨成粉末，并迅加入1 mL Trizol?？俁NA抽提步驟按Trizol Reagent說明書進(jìn)行，所提取的總RNA用2%的瓊脂糖電泳檢驗(yàn)其分子的完整情況，并用分光光度法檢測(cè)其濃度。以O(shè)ligo（dT）18為引物、1 μg總RNA為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit操作說明書合成第1鏈 cDNA。通過國際禾谷鐮刀菌網(wǎng)站（http：//www.broadinstitute.org/annotation/genome/fusarium_graminearum/MultiHome.html）查找CYP51蛋白2個(gè)基因，分別為FGCYP51A、FGCYP51B，根據(jù)此序列設(shè)計(jì)引物（表1），并通過 PCR 克隆2個(gè)基因的cDNA片段（圖1）。引物序列由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR 擴(kuò)增條件均為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)后，回收目的片段，純化后克隆至載體pMD18-T，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E. coli JM109。所篩選的陽性克隆經(jīng)檢測(cè)后由上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 分析方法 利用在線軟件protparam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析CYP51蛋白氨基酸序列[24]；用NCBI網(wǎng)站在線軟件Conserved Domains（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域[25]；用在線軟件NetPhos（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）分析磷酸化位點(diǎn)；用protscale（http：//web.expasy.org/protscale/）分析氨基酸序列的疏水性/親水性；利用PSORT Ⅱ（http：//psort.hgc.jp/form2.html）進(jìn)行亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)；利用SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù) 測(cè) 信 號(hào)肽；利用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域；利用在線軟件sopma（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)二維結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 cDNA的克隆及序列分析

采用RT-PCR方法獲得FGCYP51A、FGCYP51B 2個(gè)基因，其cDNA序列全長分別為1 524、1 581 bp（圖1）。推測(cè)其蛋白質(zhì)分別有507、526個(gè)氨基酸殘基，通過在線軟件 protparam 對(duì)禾谷鐮刀菌CYP51蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析，CYP51A蛋白的分子式為C2606H4053N697O736S19，總計(jì)由8 111個(gè)原子組成，分子量約為57 533.2 u，等電點(diǎn)為6.93，不穩(wěn)定系數(shù)為49.43（40以下為穩(wěn)定蛋白），推測(cè)其為不穩(wěn)定蛋白。該蛋白中亮氨酸、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、纈氨酸、脯氨酸、絲氨酸等含量相對(duì)較多，而半胱氨酸、色氨酸含量相對(duì)較少（圖2-A）。CYP51B蛋白的分子式為 C2680H4144N720O754S23，總計(jì)由8 321個(gè)原子組成，分子量約為 59 252.1 u，等電點(diǎn)為7.08，不穩(wěn)定系數(shù)為39.05（40以下為穩(wěn)定蛋白），推測(cè)其為穩(wěn)定蛋白。該蛋白中丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸、纈氨酸、絲氨酸等含量相對(duì)較多，而半胱氨酸、色氨酸含量相對(duì)較少（圖2-B）。

2.2 CYP51蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

利用Conserved Domains程序?qū)YP51蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，從圖3可以看出，CYP51A蛋白第36～499位氨基酸和CYP51B蛋白第72～525位氨基酸分別組成了細(xì)胞色素P450家族成員典型的保守結(jié)構(gòu)域。

2.3 CYP51蛋白氨基酸序列翻譯后的磷酸化修飾

預(yù)測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)磷酸化在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要的作用，研究報(bào)道共有3種主要的磷酸化部位——絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸結(jié)合位點(diǎn)。大多數(shù)蛋白質(zhì)是在絲氨酸、蘇氨酸殘基上磷酸化，而許多與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的蛋白質(zhì)還在酪氨酸位置上被磷酸化。利用在線軟件NetPhos分析可看出，在CYP51A中含有11個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，9個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，13個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)（圖4-A）；在CYP51B中含有14個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，9個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)（圖4-B）。CYP51蛋白磷酸化后，改變蛋白質(zhì)的活性，這種改變可能為激活，也可能是抑制作用。

2.4 CYP51蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

多肽鏈借助氫鍵排列成沿一維方向而呈現(xiàn)有規(guī)則的重復(fù)構(gòu)象的二級(jí)結(jié)構(gòu)，是氨基酸順序與三維構(gòu)象之間的橋梁。二級(jí)結(jié)構(gòu)借助范德華力、氫鍵、靜電和疏水等相互作用形成蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，從而發(fā)揮正常的生物學(xué)功能。利用SOPMA軟件對(duì)CYP51蛋白的氨基酸序列的二維結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，由圖5可知，CYP51A、CYP51B均含有α螺旋、無規(guī)則卷曲、β折疊延伸鏈、β轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，其中α螺旋結(jié)構(gòu)部分較多，分別占37.08%、4125%，其次為無規(guī)則卷曲，分別占36.09%、36.50%，β折疊片層結(jié)構(gòu)分別占19.13%、15.40%，最少的是β轉(zhuǎn)角，分別占7.69%、6.84%?？梢姦谅菪?、無規(guī)卷曲是CYP51A、CYP51B的最主要二級(jí)結(jié)構(gòu)，分布于整條肽鏈中。

2.5 CYP51蛋白的信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域分析

利用相關(guān)軟件對(duì)CYP51蛋白的信號(hào)肽和跨膜域進(jìn)行預(yù)測(cè)，由圖6-A可知，CYP51A的C值最大切割點(diǎn)在第22個(gè)氨基酸位置，分值為0.392，綜合剪切點(diǎn)分值（Y值）最高也在第22個(gè)氨基酸位置，為0.412，信號(hào)肽最大分值（S值）在第2個(gè)氨基酸位置，為0.666，因此判斷CYP51A沒有信號(hào)肽，屬于非分泌性蛋白。CYP51B的C值最大切割點(diǎn)在第16個(gè)氨基酸位置，分值為0.111，綜合剪切點(diǎn)分值（Y值）最高在第25個(gè)氨基酸位置，為0.131，信號(hào)肽最大分值（S值）在第19個(gè)氨基酸位置，為0.202，因此判斷CYP51B沒有信號(hào)肽（圖6-B），屬于非分泌性蛋白。由圖6-C可知，CYP51A蛋白30～507位氨基酸在膜外，1～6位氨基酸在膜內(nèi)，7～29位氨基酸（YPLWVLVALFAVIIANLLYQQLP）組成跨膜結(jié)構(gòu)域。CYP51B蛋白有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，分別為20～42位氨基酸（PLGQQVGIGFAVFLVLSVVLNVL）、55～77位氨基酸（MVFHWFPFVGSTITYGMDPPTFF），1～19、78～526位氨基酸在膜外，43～54位氨基酸在膜內(nèi)（圖6-D）。

2.6 CYP51蛋白氨基酸序列疏水性/親水性分析

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特征是疏水/親水間的平衡，了解氨基酸序列疏水性/親水性對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)有一定的作用。用protscale分析CYP51蛋白氨基酸序列的疏水性/親水性，根據(jù)氨基酸分值越高疏水性越強(qiáng)、得分越低親水性越強(qiáng)的規(guī)律，從圖7-A可以看出CYP51A在30、60、230、250、410位氨基酸附近分別包含1個(gè)親水頭部，親水性區(qū)域超過疏水性區(qū)域，屬于親水性蛋白。可以看出CYP51B在80、170、250、270、420、440位氨基酸附近分別包含1個(gè)親水頭部，親水性區(qū)域超過疏水性區(qū)域，也屬于親水性蛋白（圖7-B）。

2.7 CYP51蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

了解蛋白的亞細(xì)胞定位可為蛋白功能預(yù)測(cè)提供基礎(chǔ)。利用在線軟件PSORT Ⅱ?qū)YP51蛋白的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，CYP51A蛋白分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)概率為55.6%，高爾基體為33.3%，細(xì)胞質(zhì)膜為11.1%。CYP51B蛋白分布在細(xì)胞質(zhì)中概率為39.1%，細(xì)胞核及線粒體均為17.4%，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為13.0%，囊泡分泌系統(tǒng)、高爾基體及過氧化物酶體均占4.3%。

3 討論與結(jié)論

CYP51被認(rèn)為是細(xì)胞色素P450超級(jí)家族中最古老的家族，存在于幾乎所有的生物中，包括動(dòng)物、植物、酵母、真菌等真核生物以及原生動(dòng)物和細(xì)菌等原核生物，因此推測(cè)其在主要的真核生物族群分化之前就已經(jīng)形成[26-27]。雖然CYP51的功能非常保守，但是不同生物中CYP51氨基酸序列的同源性并不相同。Lepesheva 等對(duì)180多個(gè)已知的CYP51氨基酸序列，包括原核、真核生物中的CYP51進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所有生物中都保守的氨基酸有15個(gè)，所有真核生物中都保守的氨基酸有24個(gè)[6]。此外，真菌 CYP51 中還含有1個(gè)真菌特異性 C端結(jié)構(gòu)域，其中包括1段只在真菌中保守的序列 DF/YGF/YG[19]。因此，以病原真菌的CYP51為靶標(biāo)而開發(fā)的殺真菌劑，對(duì)真菌具有特異性。

Becher等對(duì)38個(gè)子囊菌中的CYP51基因進(jìn)行分析，其中18個(gè)種的真菌中含有1個(gè)CYP51基因，15種真菌中包括2個(gè)CYP51基因，其他5種真菌中含有3個(gè)CYP51基因，其中含有2個(gè)及以上CYP51基因的真菌數(shù)量在總數(shù)的50%以上[28]。真菌CYP51蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，CYP51分為3支，分別為CYP51A、CYP51B、CYP51C。在所有比對(duì)序列中，單一CYP51基因都聚類為CYP51B；而除鐮刀菌屬之外，含有2個(gè)以上CYP51基因的真菌，其CYP51基因聚類為CYP51A或者CYP51B。禾谷鐮刀菌（F. graminearum）含有3個(gè)CYP51基因FGCYP51A、FGCYP51B、FGCYP51C，它們分別編碼507、526、517個(gè)氨基酸，蛋白序列間的一致性為6165%。其中FGCYP51A、FGCYP51B基因編碼甾醇14α脫甲基酶，與禾谷鐮刀菌抗藥性產(chǎn)生有關(guān)。本研究對(duì)這2個(gè)蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，CYP51蛋白沒有信號(hào)肽，具有跨膜結(jié)構(gòu)域，屬于親水性蛋白；二者具有細(xì)胞色素P450家族成員典型的保守結(jié)構(gòu)域；具有多個(gè)絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化修飾位點(diǎn)，可能與其表達(dá)的生物學(xué)功能相適應(yīng)；二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，CYP51蛋白以無規(guī)卷曲和α螺旋為主，推測(cè)與其活性位點(diǎn)形成有關(guān)。

本研究克隆了FGCYP51A、FGCYP51B基因的cDNA，為進(jìn)一步構(gòu)建蛋白表達(dá)載體進(jìn)行蛋白表達(dá)純化，進(jìn)而開展蛋白結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究。利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了CYP51蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位等基本信息，這些結(jié)果也為構(gòu)建不同長度及功能域的表達(dá)載體提供了線索，為后期蛋白純化提供了依據(jù)。

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