張思源+柴志欣+鐘金城

摘要： 人們對不同海拔地區(qū)的動(dòng)物進(jìn)行解剖學(xué)比較并利用基因組學(xué)等現(xiàn)代生物技術(shù)進(jìn)行系統(tǒng)分析，得到了低氧適應(yīng)解剖學(xué)依據(jù)并挖掘出100多種與低氧適應(yīng)相關(guān)的重要候選基因，初步揭示了一些高原動(dòng)物低氧適應(yīng)的遺傳基礎(chǔ)和分子機(jī)制。牦牛是生活在青藏高原上的特有物種，是研究高原適應(yīng)極好的模式動(dòng)物，具有重要的研究價(jià)值。本文從牦牛的組織解剖、生理生化、低氧適應(yīng)基因等方面綜合分析了牦牛對低氧環(huán)境適應(yīng)的研究進(jìn)展，為揭示牦牛低氧適應(yīng)的分子機(jī)制和牦牛遺傳育種研究提供理論依據(jù)和參考資料。

關(guān)鍵詞： 牦牛；低氧適應(yīng)；分子機(jī)制；低氧適應(yīng)基因；研究進(jìn)展

中圖分類號： S823.8+52 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0013-05

氧氣是大多數(shù)生物生存的基礎(chǔ)物質(zhì)，生物有機(jī)體的能量供應(yīng)與代謝都與氧氣密不可分，海拔3 000 m以上的高原地區(qū)空氣中氧氣的含量是海平面的73%，海拔5 000 m地區(qū)氧氣含量僅是海平面的一半。當(dāng)環(huán)境中氧氣濃度出現(xiàn)變化時(shí)，生物有機(jī)體會(huì)通過一系列調(diào)控來適應(yīng)環(huán)境變化，平原地區(qū)生活的人或動(dòng)物在高原生活一段時(shí)間，會(huì)對高原環(huán)境產(chǎn)生適應(yīng)性，稱為“獲得性習(xí)服”，高原世居的人或動(dòng)物在生理、生化和機(jī)體結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出穩(wěn)定的遺傳特征，對高原環(huán)境有較好的適應(yīng)，稱為“遺傳性適應(yīng)”[1-2]。生物機(jī)體對高原環(huán)境適應(yīng)能力不足時(shí)，會(huì)對動(dòng)物的生長、發(fā)育和繁殖等生理過程造成有害影響。經(jīng)過數(shù)億年的自然選擇與進(jìn)化，高原哺乳動(dòng)物以特有的方式在高原低氧環(huán)境中生長繁衍[3]。常見的高原哺乳動(dòng)物有牦牛、藏羚羊等，研究這些高原動(dòng)物的低氧適應(yīng)機(jī)制對畜牧業(yè)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)都有重要的意義，同時(shí)低氧是癌癥等重大疾病產(chǎn)生和發(fā)展的重要原因，進(jìn)行低氧適應(yīng)原理研究，可為相關(guān)疾病的治療提供重要思路。

牦牛生活在海拔3 000 m以上的青藏高原及其周邊地區(qū)，是高原動(dòng)物的代表物種之一，經(jīng)過長期的自然選擇與人工選擇，牦牛在解剖結(jié)構(gòu)、生理生化指標(biāo)和基因功能等方面都已獲得穩(wěn)定、獨(dú)特的高原低氧適應(yīng)特征與機(jī)制，為當(dāng)?shù)啬撩裉峁┝瞬豢苫蛉钡纳a(chǎn)、生活資料[4]。國內(nèi)外對牦牛低氧適應(yīng)性的研究已開展了多年，從組織器官水平到細(xì)胞分子水平的研究取得了一定的成就，本文從牦牛的組織解剖、生理生化指標(biāo)、與低氧適應(yīng)相關(guān)的基因等方面綜合分析了牦牛對低氧環(huán)境適應(yīng)的研究進(jìn)展，為揭示牦牛低氧適應(yīng)的機(jī)制和牦牛遺傳育種研究提供一些理論依據(jù)和參考資料。

1 組織解剖結(jié)構(gòu)與生理生化指標(biāo)

高原動(dòng)物長期生活在高原低氧環(huán)境中，組織器官形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理生化指標(biāo)都有相應(yīng)的適應(yīng)性變化。在器官水平上，高原動(dòng)物具有完善的氧氣輸送系統(tǒng)和強(qiáng)大的心肺攝氧、儲(chǔ)氧能力。在細(xì)胞水平上，高原動(dòng)物相較于移居高原的同一物種在有氧代謝反應(yīng)中所完成同一做功時(shí)耗氧量較少。研究結(jié)果表明高原世居動(dòng)物很大程度上依靠組織適應(yīng)性。

1.1 肺組織解剖學(xué)

肺行使氧和二氧化碳交換功能，還參與機(jī)體多種物質(zhì)的合成與代謝，是呼吸系統(tǒng)中重要的功能器官。牦牛的肺質(zhì)量約占體質(zhì)量的1.1%～1.7%，肺臟有6個(gè)肺葉，左側(cè)2個(gè)——尖葉、膈葉，右側(cè)4個(gè)——尖葉、中葉、膈葉和副葉，肺表面有漿膜組成的胸膜臟層覆蓋，血管與淋巴管等間質(zhì)結(jié)締組織深入肺內(nèi)，將實(shí)質(zhì)分為許多完整的肺小葉。肺臟由導(dǎo)氣部和呼吸部2個(gè)部分組成，肺導(dǎo)氣部包括葉支小管、小支氣管、細(xì)支氣管和終末細(xì)支氣管，肺呼吸部則由呼吸性細(xì)支氣管、肺泡管、肺泡囊和肺泡組成。牦牛肺部氣管粗大，呼吸性細(xì)支氣管結(jié)構(gòu)明顯，管壁由假復(fù)層柱狀上皮和單層立方上皮間錯(cuò)排列，上有肺泡開口[5]。肺泡管的斷面數(shù)量多，其管壁具有典型的膨大結(jié)節(jié)。肺泡是構(gòu)成肺和肺進(jìn)行氣體交換的主要結(jié)構(gòu)。牦牛肺泡表面積大且多為多面形囊泡、球形或半球形狀，大多數(shù)是扁平的Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞，位于肺泡壁，其上皮出現(xiàn)小孔，而立方的Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞突出在肺泡腔。肺泡隔有2種，一種是肺泡隔厚的區(qū)域呈淡紅色半透明薄膜狀，中間可以觀察到一些紅細(xì)胞，偶爾可見其他細(xì)胞成分，另一種是肺泡隔薄的區(qū)域呈線狀，可見扁平的細(xì)胞核，無紅細(xì)胞[6]。

對不同海拔地區(qū)牦牛肺臟解剖學(xué)研究表明，高海拔地區(qū)牦牛明顯比低海拔地區(qū)牦牛單位面積內(nèi)肺泡數(shù)目多，高海拔牦牛肺泡隔的厚度明顯增加，同時(shí)也觀察到肺泡隔內(nèi)毛細(xì)血管明顯而豐富，在肺泡隔中占很大的比例。高原牦牛較平原黃牛，氣管短而粗大，軟骨環(huán)距離較大，含有較豐富的肌肉、纖維組織和支氣管軟骨。牦牛肺泡隔厚度顯著大于黃牛，且肺泡發(fā)育速度較快。牦牛氣-血屏障隨日齡逐漸減小，黃牛則不斷增厚。牦牛肺泡隔充分呼吸呈細(xì)線狀，肺泡的快速發(fā)育，氣管的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，氣-血屏障厚度的變化等都為了滿足牦牛在生長發(fā)育的過程中對氧氣的需求，更方便于牦牛肺部的氣體交換，便于牦牛個(gè)體發(fā)育與適應(yīng)高原低氧環(huán)境[7]。

1.2 心血管形態(tài)學(xué)與血液生理指標(biāo)

心臟是血液循環(huán)的動(dòng)力器官，血液循環(huán)是攜帶氧氣供應(yīng)全身的唯一循環(huán)系統(tǒng)，在能量代謝上起著重要的生理功能。牦牛心臟占總體質(zhì)量的0.5%～0.8%，對牦牛心臟解剖顯示牦牛右心室肉柱側(cè)壁與室間相連處較明顯，左心室肉柱較少且位于隔壁下部，心臟主動(dòng)脈半月瓣比較發(fā)達(dá)，在心臟主動(dòng)脈口的纖維環(huán)處出現(xiàn)心骨[9]。紅細(xì)胞（RBC）、血紅蛋白（HB）和紅細(xì)胞壓積容量（PCV）是反映動(dòng)物呼吸、運(yùn)輸?shù)葯C(jī)體性能的重要生理指標(biāo)，采用顯微鏡法和氰化高鐵法等對牦牛血液進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)RBC、HB和PCV含量在公、母牦牛間無顯著差異；而不同海拔地區(qū)牦牛進(jìn)行比較，生活在高海拔地區(qū)的牦牛血液中RBC、HB和PCV明顯偏高[10]。心臟解剖發(fā)現(xiàn)牦牛左心室壁較厚且還擁有粗大的心肌纖維素。微循環(huán)是血液循環(huán)中的最小功能單位，針對牦牛心肌微動(dòng)脈研究認(rèn)為：心室壁微動(dòng)脈走形彎曲甚至扭曲成團(tuán)、入肌束后呈“T”形甚至呈“Y”形，這些都與狗等平原家畜相似，是經(jīng)典的“樹皮樣”結(jié)構(gòu)[11]。牦牛心室壁毛細(xì)血管的前微動(dòng)脈表面有明顯的環(huán)狀縮窄，同一動(dòng)脈分出的毛細(xì)血管很少匯入同一靜脈，牦牛微靜脈以其獨(dú)特的“樹根樣”區(qū)別于其他家畜的“生姜根樣”，微靜脈血管肌束間比肌束內(nèi)粗大，且微靜脈垂直于心肌纖維，有利于血液循環(huán)[11-12]。

牦牛機(jī)體血液中含氧量下降時(shí)，造血功能增強(qiáng)促使RBC、HB和PVC升高，以滿足機(jī)體對氧的需求。牦牛微動(dòng)脈的扭曲有效地增加了血流阻力，從而調(diào)節(jié)血流量，微靜脈的形狀結(jié)構(gòu)有利于血液的回流，肌束內(nèi)外大小的差異是承受不同壓力的結(jié)果。牦牛同時(shí)還存在肺泡內(nèi)毛細(xì)血管多而明顯，血管壁較薄和肺動(dòng)脈不高等特點(diǎn)。這些形態(tài)結(jié)構(gòu)有利于血液循環(huán)和氧氣的輸送，增加氧氣利用率，為牦牛高原低氧適應(yīng)提供解剖形態(tài)學(xué)和生理生化依據(jù)[10，12-13]。

2 低氧適應(yīng)分子基礎(chǔ)研究

2.1 血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）基因

血管是動(dòng)物血液流動(dòng)的生命管道，起著運(yùn)輸氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的作用，血管內(nèi)皮生長因子（ vascular endothelial growth factor，VEGF） 又稱血管通透因子（vascular permeability factor，VPF），廣泛分布于人和動(dòng)物各個(gè)組織，有完整的血小板衍生性生長因子（plate-derived growth factor，PDGF）家族蛋白結(jié)構(gòu)功能域，是內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管再生的關(guān)鍵調(diào)控因子，該蛋白質(zhì)是親水性分泌蛋白，N端有分泌信號。VEGF蛋白的不同亞型是由基因的不同剪接方式?jīng)Q定的，是唯一對血管能特異性形成的生長因子。據(jù)研究VEGF是最強(qiáng)的血管通透性因子，比組織胺強(qiáng)5 000倍，不受組織胺抑制劑抑制，能形成纖維素網(wǎng)絡(luò)，為毛細(xì)血管芽生長延伸提供基質(zhì)。給兔靜脈滴注VEGF可導(dǎo)致動(dòng)脈壓下降，低氧環(huán)境可以刺激VEGF-A及其受體在動(dòng)物和人組織細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)揮促進(jìn)新生血管內(nèi)皮細(xì)胞生長增殖及增加血管通透性的功能。VEGF是通過小泡囊形狀的細(xì)胞器（vesichlar vacuolar organelle，VVO）引起內(nèi)皮細(xì)胞窗子開放，進(jìn)而導(dǎo)致血管通透性增加。VEGF對心肌力收縮基本無影響，卻能降低血管外周阻力，增加心率和心輸出量[16]。

利用分子克隆技術(shù)和生物信息學(xué)等方法對牦牛VEGF-A基因進(jìn)行分析，VEGF-A基因序列長度為653 bp，開放閱讀框長573 bp，可編碼190個(gè)氨基酸；編碼的多肽鏈具有親水性，該蛋白是一種表面蛋白，有4個(gè)磷酸化位點(diǎn)。牦牛VEGF-A基因中檢測到2個(gè)SNP，PCR-RFLP分型認(rèn)為在SNP g.15853G>A位點(diǎn)上G>A可更好地適應(yīng)高原低氧，中性檢測證實(shí)2個(gè)位點(diǎn)受牦牛所處地理環(huán)境的選擇作用。Real-time PCR技術(shù)對高原牦牛和高原黃牛不同組織比較發(fā)現(xiàn)，牦牛VEGF-A基因在肺部、胰腺中表達(dá)量更高一些。牦牛與黃牛VEGF-A基因蛋白序列相同，肺部表達(dá)量不同說明低氧適應(yīng)可能與基因表達(dá)量有關(guān)，且低氧適應(yīng)調(diào)節(jié)主要在肺和脾[17]。

2.2 內(nèi)皮PAS1蛋白（EPAS1）基因

紅細(xì)胞是攜帶氧氣，供機(jī)體代謝的運(yùn)輸載體。各個(gè)組織器官的氧氣交換都與血管和紅細(xì)胞密不可分，通過對世居高原人和動(dòng)物的全基因組掃描（whole genome scans）以及候選基因分析[18]，挖掘出3個(gè)與低血紅蛋白（Hb）濃度有關(guān)的基因：EPAS1、EGLN1（EGL nine homolog1）和PPARA（peroxisome proliferator activated-α）基因。內(nèi)皮PAS1蛋白（EPAS1）又稱缺氧誘導(dǎo)因子2（hypoxia induced factor-2，HIF-2），其主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞，大多數(shù)由低氧引起的因子或酶的變化均通過EPAS1作用，EPAS1是應(yīng)激缺氧的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[19]。EPAS1 蛋白是由HIF-1β和HIF-2α組成的異二聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物，HIF-2α是調(diào)節(jié)亞基[20]，由bHLH（Basic helix-loop-helix）、PAS（Per/Arnt/Sim）、ODD（oxygen-dependent degradation）和TAD（transactivation domain）4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其中前2個(gè)結(jié)構(gòu)域可以介導(dǎo)α和β亞基形成二聚體，與缺氧反應(yīng)元件（HRE）結(jié)合，ODD結(jié)構(gòu)域被脯氨酞羥化酶羥化后使HIF-2α泛素化被蛋白水解酶降解，從而在正常氧濃度情況下細(xì)胞內(nèi)含量較少，處于動(dòng)態(tài)平衡。缺氧條件下，HIF-2α泛素化降解途徑被抑制，形成穩(wěn)定EPAS1誘導(dǎo)靶基因發(fā)揮功能，TAD結(jié)構(gòu)域在HIF-1α和HIF-2α特異調(diào)節(jié)靶基因中起主導(dǎo)作用。EPAS1 作用的靶基因主要是與能量代謝、血管生長和骨髓造血等相關(guān)的基因，這些靶基因中都含有缺氧反應(yīng)元件（ HRE），EPAS1 通過識(shí)別核心序列與結(jié)合誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)細(xì)胞對缺氧的應(yīng)答[21]。Morita 等發(fā)現(xiàn)EPAS1 是 EPO 的主要調(diào)節(jié)者[22]，隨后研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境中氧氣濃度下降時(shí)，細(xì)胞會(huì)上調(diào)VEGF-A和EPO等一系列低氧調(diào)節(jié)基因的表達(dá)量，其中 EPO 的表達(dá)量增加是由于 EPAS1 的高表達(dá)導(dǎo)致的，在上調(diào)表達(dá)量的過程中EPAS1蛋白起著紐帶作用，所以多數(shù)低氧引起上述酶或因子的變化EPAS1蛋白起關(guān)鍵作用。關(guān)于人類進(jìn)入高原腸內(nèi)鐵的吸收量增加，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)也與EPAS1有關(guān)[23]。

吳曉云等對牦牛EPAS1基因的研究顯示，該基因開放閱讀框長2 613 bp，可編碼870個(gè)氨基酸，蛋白表現(xiàn)為親水性，是非分泌蛋白?；蛑袡z測到3個(gè)特異性的SNP，群體中的SNP位點(diǎn)都是高度連鎖的狀態(tài)，某一基因型表現(xiàn)顯著的海拔差異性。EPAS1基因可作為低氧適應(yīng)的分子信標(biāo)，該基因在肺部的表達(dá)量豐富，在牦牛體內(nèi)表達(dá)量顯著低于平原黃牛，同時(shí)EPAS1基因?qū)EGF-A基因也有調(diào)控作用[17]。

2.3 促紅細(xì)胞生成素（EPO）基因

促紅細(xì)胞生成素（EPO）主要由腎臟合成，少部分由肝臟和有核紅細(xì)胞等合成。EPO促進(jìn)進(jìn)入紅細(xì)胞系的骨髓多能造血干細(xì)胞的增生、分化，進(jìn)而調(diào)節(jié)紅細(xì)胞數(shù)量的主要刺激因子，由低氧誘導(dǎo)和雌激素誘導(dǎo)產(chǎn)生，基因的3′非編碼區(qū)包含低氧誘導(dǎo)因子反應(yīng)元件[24]。EPO的促進(jìn)紅細(xì)胞生成生物學(xué)功能是通過特異的促紅細(xì)胞生成素受體（EPOR）介導(dǎo)完成的；兩者相互結(jié)合后，通過信號傳導(dǎo)途徑來調(diào)節(jié)紅細(xì)胞系的增生與分化[25]。EPOR是造血細(xì)胞因子受體超家族成員之一，屬于細(xì)胞因子受體，其結(jié)構(gòu)可分為3個(gè)部分：胞質(zhì)部分，跨膜區(qū)域，細(xì)胞外部分。胞質(zhì)部分不具有酪氨酸激酶活性，是因?yàn)槿鄙倮野彼峒っ傅奶卣髋帕许樞?，所以只?種亞單位與EPO作用形成同源二聚體，再通過JAK/STAT途徑和Ras/MAP途徑等來傳導(dǎo)信號[26]。色氨酸-絲氨酸-X-色氨酸-絲氨酸結(jié)構(gòu)（WSXWS）是造血細(xì)胞超家族共有的特征，而EPOR是此家族中的一員。研究認(rèn)為WSXWS 結(jié)構(gòu)對EPOR正確構(gòu)象的形成、蛋白體的組裝、配體的激活等具有重要的作用[27]。

牦牛EPO基因由5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子組成，不同地區(qū)牦牛該基因大小約在3 260 bp左右，編碼區(qū)長1 527 bp，編碼508個(gè)氨基酸，彼此同源性較高，但有差異。對不同地區(qū)牦牛EPO基因多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性比較豐富，基因型與牦牛所處海拔有明顯關(guān)系[28-29]。

2.4 低氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）基因

低氧誘導(dǎo)因子1（Hypoxia inducible factor-1 alpha，HIF-1）是參與缺氧誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)中重要的蛋白轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[30]，具有DNA結(jié)合活性。HIF-1是氧濃度敏感性元件，正氧（normoxia）條件下不穩(wěn)定，半衰期低于5 min，一直處于被合成和降解的狀態(tài)，在缺氧環(huán)境培養(yǎng)的細(xì)胞核中可以檢測到。HIF-1由α和β 2種亞基構(gòu)成，2個(gè)亞基均為含有PAS和bHLH結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子家族成員，α與β亞基還包括入核信號（NLS）和羧基末端的反應(yīng)活化結(jié)構(gòu)域（TAD），可能參與轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物反應(yīng)，從而影響基因轉(zhuǎn)錄。α亞基是調(diào)節(jié)HIF-1活性的功能單位，而β亞基則是組成性表達(dá)，與保持HIF-1結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和活性構(gòu)象轉(zhuǎn)變有關(guān)[31]。目前發(fā)現(xiàn)α亞基有HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α 3種，三者表現(xiàn)形式均不相同，都受氧氣濃度調(diào)節(jié)，與β結(jié)合發(fā)揮不同的靶基因調(diào)控功能，并能夠作為核心與基因產(chǎn)物一起組成復(fù)雜的低氧調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。對高原人群全基因組掃描（GWADS）[32]發(fā)現(xiàn)HIF-2α基因在人對低氧環(huán)境中的調(diào)節(jié)起核心作用。HIF-1作為低氧適應(yīng)的主要調(diào)控因子（表1）[33]，可以參與調(diào)控血管形成和紅細(xì)胞生成、糖酵解與糖代謝、應(yīng)激反應(yīng)等過程。

利用半定量反轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)研究表明，在牦牛心、肝、肺和肌肉等組織中HIF-1均有表達(dá)，其中睪丸與脾中表達(dá)量最高，肌肉表達(dá)量最低[34]。

2.5 線粒體基因

線粒體是一個(gè)半自主細(xì)胞器，細(xì)胞內(nèi)約90%的O2被線粒體的氧化磷酸化過程消耗，線粒體處于能量傳遞的中心，是生物體代謝的主要能量供應(yīng)“工廠”[35]。線粒體基因組編碼區(qū)有37個(gè)基因，包括12S rRNA和16S rRNA等2個(gè)rRNA、TA和TR等22個(gè)tRNA，包含3個(gè)細(xì)胞色素C氧化酶的13個(gè)編碼蛋白質(zhì)的功能基因。這些基因都參與到呼吸鏈中構(gòu)成酶或反應(yīng)復(fù)合物的組成，這些基因的突變與表達(dá)量的差異都會(huì)直接或間接影響呼吸鏈的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，在低氧適應(yīng)中起著重要作用。作為動(dòng)物中對低氧反應(yīng)最敏感的細(xì)胞器，線粒體在低氧環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用，高原動(dòng)物線粒體基因通過多態(tài)性來適應(yīng)高原低氧的環(huán)境。細(xì)胞在低氧環(huán)境中應(yīng)激時(shí)最大的威脅是電子傳遞鏈中電子受體氧分子供應(yīng)不足導(dǎo)致大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生[36]。ROS可以使蛋白質(zhì)、脂類和DNA等一些大分子物質(zhì)氧化損傷，甚至有些細(xì)胞器也被氧化，進(jìn)而影響細(xì)胞及機(jī)體的正常代謝。科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)線粒體通過自噬的方式解決這一難題，來增加生物機(jī)體的高原低氧適應(yīng)，同時(shí)線粒體還可以改變自身的形態(tài)結(jié)構(gòu)、數(shù)目[37]以及優(yōu)化呼吸鏈反應(yīng)體系提高呼吸鏈作用效率來應(yīng)對低氧環(huán)境[38-39]。

通過測定牦牛心肌、骨骼肌線粒體總抗氧能力（T-AOC）、乳酸脫氫酶（LDH）和超氧化物歧化酶（SOD）等的含量來研究線粒體氧自由基代謝，結(jié)果顯示線粒體抗氧化能力隨海拔升高而不斷增強(qiáng)。對牦牛骨骼肌線粒體的平均截面積、平均體積和面數(shù)密度等超微結(jié)構(gòu)與平原黃牛對比研究，發(fā)現(xiàn)牦牛線粒體小而多，密度大，面積隨年齡有先降后升的特點(diǎn)，在出生和發(fā)育過程線粒體結(jié)構(gòu)形態(tài)的變化都表現(xiàn)出良好的遺傳學(xué)特點(diǎn)[40-41]。

2.6 其他重要基因

在低氧環(huán)境中，細(xì)胞中一部分控制糖代謝的酶類和相關(guān)基因的表達(dá)量將上調(diào)，使得細(xì)胞內(nèi)主要通過糖酵解來維持ATP的供應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)因谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST） 基因的存在使得長期生活在高海拔地區(qū)的人或動(dòng)物體內(nèi)并未產(chǎn)生過多引起脂質(zhì)氧化的活性氧。閆惠琴等[3]研究發(fā)現(xiàn)GSTT1缺失基因型頻率在高原與平原人之間存在著顯著差異，GSTT1-105變異基因型頻率差異也十分顯著，所以GSTT1和GSTP這2種基因可能與高原低氧適應(yīng)有關(guān)。通過群體遺傳學(xué)統(tǒng)計(jì)的方法用基因組掃描和外顯子測序技術(shù)對藏族人高海拔環(huán)境適應(yīng)性進(jìn)行研究，挖掘出EPAS1、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARA）和脯氨酸羥化酶-2（EGLN2）等候選基因參與能量代謝通路調(diào)控過程，與低氧誘導(dǎo)因子活性也密切相關(guān)[18，32]。熱休克蛋白（ heat shock protein，HSP）基因具有保護(hù)機(jī)體或細(xì)胞的功能，其中HSP70基因與高原低氧環(huán)境下是否患高山病有很大關(guān)系。研究顯示肺泡表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白（pulmonary surfatcant-associated protein，SP） 基因SP-A能夠增強(qiáng)Ⅱ型肺泡細(xì)胞的氧化能力。對SP的多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)SP基因多個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)與高原低氧適應(yīng)相關(guān)聯(lián)。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1（ glucose transporter 1，GLUT-1）在低氧環(huán)境中其數(shù)量與活性會(huì)明顯升高，對該基因進(jìn)行SNP檢測，同樣也發(fā)現(xiàn)與高原低氧適應(yīng)相關(guān)聯(lián)的SNP[42]。

3 低氧適應(yīng)基因組學(xué)研究

為全面了解與低氧適應(yīng)相關(guān)基因的調(diào)節(jié)作用，Karen等利用抑制性消減雜交技術(shù)（subtractive suppression hybridization，SSH）創(chuàng)建了1個(gè) cDNA 文庫來確定低氧反應(yīng)信號轉(zhuǎn)換通路和相關(guān)基因，并使用該文庫創(chuàng)立微陣列檢測，篩選與缺氧耐受能力相關(guān)的基因型。該文庫涵蓋了300多個(gè)低氧上調(diào)表達(dá)的表達(dá)序列標(biāo)記和基因。SSH文庫除擁有低氧適應(yīng)主要相關(guān)基因外還涵蓋了參與糖代謝、細(xì)胞凋亡和神經(jīng)傳導(dǎo)等方面的相關(guān)基因，這些低氧調(diào)節(jié)相關(guān)基因已通過微陣列分析法、實(shí)時(shí) PCR 法和蛋白印跡法得到驗(yàn)證[43]。

對牦?；蚪M水平的進(jìn)化分析，可以識(shí)別進(jìn)化過程中自然選擇對牦牛基因組的影響，并能進(jìn)一步解析牦牛多種抗逆特性的分子機(jī)制及其適應(yīng)高原環(huán)境的能力。使用共線性的方法，從人、黃牛和牦牛等7個(gè)物種中鑒定了8 923個(gè)高質(zhì)量的同源基因，對這些同源基因做抗逆適應(yīng)性進(jìn)化分析，結(jié)果顯示牦牛中與能量代謝和低氧應(yīng)答相關(guān)的基因進(jìn)化速率明顯快于黃牛。將同源基因進(jìn)行自然選擇分析，識(shí)別了5個(gè)（Camk2b、Gcnt3、Hsd17b12、Whscl、Glul）與營養(yǎng)能量代謝以及3個(gè)（Adam17、Arg2、Mmp3）與低氧應(yīng)答相關(guān)的正選擇基因，這些基因可能與牦牛在高原地區(qū)牧草資源稀缺的環(huán)境下維持高效的能量代謝以及低氧環(huán)境生存密切相關(guān)。此外，分子鐘方法估算表明牦牛和黃牛大約在500萬年前分化，這與人和黑猩猩的分化時(shí)間基本相同[44]。

4 展望

我國有上千萬人生活在面積約250萬km2的高原之上，每年有大量的游客去高原，游客中有很多為高原不適應(yīng)者。對低氧適應(yīng)分子機(jī)制的研究將有助于對這些人的體質(zhì)進(jìn)行判斷，并進(jìn)行相應(yīng)的治療。低氧代謝通路與多種疾病如心血管疾病、腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[45]。隨著全球人口的快速增長，高原的戰(zhàn)略地位也愈顯重要。人們在過去的30年里投入了大量的人力物力進(jìn)行低氧分子機(jī)制的研究，高海拔適應(yīng)是許多基因調(diào)控和蛋白結(jié)構(gòu)的協(xié)調(diào)變化，同時(shí)也需這些基因相互作用。目前，對藏羚羊的低氧適應(yīng)“遺傳基礎(chǔ)”[46]與藏獒低氧適應(yīng)機(jī)制[47]研究有了突破性進(jìn)展，對牦牛低氧適應(yīng)的研究雖已經(jīng)取得一定的成績，但就揭示牦牛高原低氧適應(yīng)生理機(jī)理和分子機(jī)制還有一定距離，有許多問題需要進(jìn)一步研究與探討，如基因組分析中基因組的充分注釋、相關(guān)候選基因試驗(yàn)驗(yàn)證和轉(zhuǎn)錄組的研究等。為更全面了解高海拔適應(yīng)的分子機(jī)制，需擴(kuò)大基因組研究的范圍，并對序列多態(tài)性與轉(zhuǎn)錄變異分析等進(jìn)行整合分析。全基因組基因表達(dá)變化的分析增加我們對高原適應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控變異的了解，總的來說研究牦牛對高原低氧適應(yīng)，應(yīng)該多領(lǐng)域、多學(xué)科共同分析與研究。

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