駱海燕，竇冰然，姜開維，洪厚勝,3

(1. 南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211800；

2.南京工業(yè)大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，江蘇南京211800；

3.南京匯科生物工程設(shè)備有限公司，江蘇南京210009)

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攪拌式動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器研究應(yīng)用與發(fā)展

駱海燕1，竇冰然2，姜開維1，洪厚勝1,3

(1. 南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，江蘇南京211800；

2.南京工業(yè)大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，江蘇南京211800；

3.南京匯科生物工程設(shè)備有限公司，江蘇南京210009)

摘要：隨著動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的治療型重組蛋白的應(yīng)用越來越廣，動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)備受關(guān)注，其中，機(jī)械攪拌式動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器得到了廣泛應(yīng)用。本文對攪拌式動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)罐的結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行了系統(tǒng)性的介紹，總結(jié)了其特性及國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀與應(yīng)用，最后指出其研發(fā)尚存在的問題及對未來的展望。

關(guān)鍵詞：大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)；攪拌式生物反應(yīng)器；結(jié)構(gòu)；應(yīng)用

近年來，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展極大地推進(jìn)了現(xiàn)代生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1-4]。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于單克隆抗體的制備、重組蛋白藥物的研發(fā)、人造器官移植等行業(yè)，成為生物制藥領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)之一。隨著全球?qū)ι镏破沸枨蟮目焖僭鲩L[5]，動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)也越來越受到人們的青睞，而作為動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)中不可代替的主要設(shè)備——生物反應(yīng)器，在生物制品的生產(chǎn)中也起到了越來越重要的作用。它能夠有效增加細(xì)胞單位體積的培養(yǎng)密度，從而為動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模生產(chǎn)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器種類多樣，常規(guī)應(yīng)用較多的有機(jī)械攪拌式[6]、激流式[7]、氣升式[8]、一次性袋式[9]、籠式通氣攪拌[10]和固定床式[11]等，其中，攪拌式動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器研究較為成熟，其操作與微生物發(fā)酵罐相似，工藝操作簡單易行，成為生物制品生產(chǎn)的主流趨勢。

1攪拌式動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器定義及特點(diǎn)

攪拌式動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器的主要容器為類似發(fā)酵罐的罐體，罐內(nèi)安裝攪拌裝置，密閉狀態(tài)下由電動(dòng)機(jī)帶動(dòng)槳葉混合培養(yǎng)液，批次培養(yǎng)、流加培養(yǎng)或灌注培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞使之增殖擴(kuò)大，因此可定義為機(jī)械攪拌式動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)罐。它是最早被采用且工藝技術(shù)較為成熟的一種生物反應(yīng)器。在諸多生物反應(yīng)器類型中，該反應(yīng)器最能體現(xiàn)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)專用生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)理念。攪拌式動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器通常由罐體、攪拌器、管路、閥門、泵及電動(dòng)機(jī)組成，由電動(dòng)機(jī)帶動(dòng)攪拌槳葉混合培養(yǎng)液，通過攪拌器的作用使細(xì)胞和養(yǎng)分在培養(yǎng)液中均勻分布，并且，在罐體安裝的不同傳感器，用以在線持續(xù)檢測培養(yǎng)液的pH、溫度、溶氧(DO)等重要參數(shù)，以維持細(xì)胞生存環(huán)境的穩(wěn)定性。小罐通常采用硅硼酸鹽玻璃制作，用于實(shí)驗(yàn)室研究使用；大罐采用不銹鋼材質(zhì)，用于大規(guī)模生產(chǎn)。

目前，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的主流生產(chǎn)工藝是以機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器為前提下的流加培養(yǎng)工藝，這也是當(dāng)前動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的主流工藝。機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器優(yōu)點(diǎn)在于工藝簡單、操作靈活，并且對于不同的貼壁細(xì)胞系或懸浮細(xì)胞系都能有良好的適用性；其培養(yǎng)工藝容易放大，可以為細(xì)胞生長和增殖提供均質(zhì)的環(huán)境；產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，非常適合于工廠化生產(chǎn)生物制品；管路布置較為簡單，提供較好的無菌條件，細(xì)胞生長過程中不易污染。雖然攪拌所產(chǎn)生的剪切力對細(xì)胞有害，但是通過選擇合適的攪拌槳型并調(diào)整其結(jié)構(gòu)尺寸，或者是在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工藝中加入非離子表面活性劑Pluronic F68、部分血清和牛血清白蛋白和硫酸葡聚糖等[12]，可減弱攪拌和通氣過程中流體剪切力對細(xì)胞造成的損害程度。

2攪拌式動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與功能

攪拌式動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器整套系統(tǒng)由罐體、支架管路和控制器三大部分組成。通常選用觸摸屏軟件控制，并且具備計(jì)算機(jī)終端遠(yuǎn)程控制功能，可以實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)罐中攪拌轉(zhuǎn)速、溫度、pH、溶氧等自動(dòng)控制，另外具備數(shù)據(jù)記錄和歷史記錄查找功能。

2.1罐體

不同規(guī)模罐體設(shè)計(jì)材質(zhì)不一樣，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模性的小型罐體(10 L以內(nèi))可選擇硼硅酸鹽玻璃；10 L以上則由耐腐蝕的316不銹鋼或者一次性無菌袋制成，用于大規(guī)模生產(chǎn)，罐體內(nèi)壁面光滑，按壓力容器要求設(shè)計(jì)。罐體外壁或法蘭盤安裝溫度、pH、DO、液位和消泡等傳感器，在線連續(xù)監(jiān)測和調(diào)整細(xì)胞生長過程，對于不銹鋼型細(xì)胞罐，還配置燈鏡、視鏡、取樣閥和放料閥等。罐體內(nèi)部主要由擋板、攪拌槳、氣體分布器和擋板組成，這3個(gè)部件與培養(yǎng)罐內(nèi)物料混合傳質(zhì)密切相關(guān)。擋板加強(qiáng)罐內(nèi)流體湍動(dòng)效果，避免形成大旋渦，一般4塊擋板就能達(dá)到全擋板條件；攪拌槳是核心結(jié)構(gòu)，攪拌槳葉應(yīng)具備低剪切和良好的混合特性，讓細(xì)胞正常生長；氣體分布器用于曝氣，達(dá)到細(xì)胞的溶氧需求。圖1是攪拌式動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器罐體的基本模型及其結(jié)構(gòu)。

圖1　　　攪拌式動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器結(jié)構(gòu)Fig.1　　　Structure of stirred tank bioreactor

2.1.1攪拌器的類型與特征

不同細(xì)胞培養(yǎng)罐的攪拌器有不同的選擇，如籃式、籠式、雙層推進(jìn)式、旋轉(zhuǎn)濾器結(jié)合推進(jìn)式及象耳式(Elephant Ear)等。圖2是不同攪拌槳葉的實(shí)物圖。其中籃式和籠式屬于細(xì)胞提升式槳，前者應(yīng)用于貼壁類細(xì)胞固定化培養(yǎng)，其中細(xì)胞貼附在聚酯纖維紙片[13]上，紙片直徑6 mm時(shí)在罐內(nèi)流動(dòng)緩慢，適合溶氧需求低、對剪切敏感的貼壁細(xì)胞，如HEK-293細(xì)胞；后者配通氣攪拌槳適用于貼壁細(xì)胞微載體培養(yǎng)，如培養(yǎng)Vero細(xì)胞，微載體直徑在60～200 μm[13]間，常用的商品化微載體有Cytodex1、Cytodex2、Cytodex3、Cytopore和Cytoline[14-18]。籠式槳軸外包有75 μm不銹鋼絲網(wǎng)作為通氣腔，即氣體曝氣后產(chǎn)生氣泡經(jīng)絲網(wǎng)破碎，分成氣、液兩部分，多余的氣泡上升到頂部消泡腔，進(jìn)一步破碎最終從尾氣排走，微載體直徑比絲網(wǎng)孔大，進(jìn)不去通氣腔，這樣在保證傳氧需求時(shí)大大減弱氣體破裂過程中的剪切力，攪拌轉(zhuǎn)速一般在30～60 r/min范圍內(nèi)，所以通氣量可根據(jù)細(xì)胞需求適當(dāng)提高。

雙層推進(jìn)式和旋轉(zhuǎn)濾器結(jié)合推進(jìn)式都裝配推進(jìn)式軸流槳。前者罐內(nèi)容易形成大的流體軸向循環(huán)流動(dòng)，推進(jìn)式剪切力低，適用于大部分中懸浮細(xì)胞培養(yǎng)；后者裝配旋轉(zhuǎn)過濾器和推進(jìn)式槳葉，用于懸浮細(xì)胞灌注高密度培養(yǎng)，旋轉(zhuǎn)過濾器作用是細(xì)胞截留功能，旋轉(zhuǎn)壁面上分布各個(gè)篩孔，一般篩孔大小為20～50 μm，具體篩孔大小需要針對所培養(yǎng)細(xì)胞大小對應(yīng)設(shè)計(jì)。然而長時(shí)間的高密度培養(yǎng)容易造成細(xì)胞的結(jié)團(tuán)，從而導(dǎo)致旋轉(zhuǎn)過濾器的堵塞，因而選擇好合適孔徑的同時(shí)，篩網(wǎng)材料選擇也很重要，不銹鋼加特氟龍表面就有很好的防粘效果[19]。另外，Deo等[20]發(fā)現(xiàn)高的轉(zhuǎn)速可使旋轉(zhuǎn)過濾器免于堵塞，無堵塞下的最大灌注速率與篩網(wǎng)表面的切向速度的平方相關(guān)。

圖2　　　攪拌槳葉的類型Fig.2　　　Different impellers of stirred tank bioreactor

除此之外，象耳槳也廣泛應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。趙曉偉[21]結(jié)合CFD數(shù)值模擬方法分析象耳式(Elephant Ear)槳與其他3種常用攪拌槳葉在流場傳質(zhì)性能及剪切大小進(jìn)行仿真對比，得出該槳葉綜合了軸流槳和徑流槳的優(yōu)點(diǎn)：流場分布均勻，產(chǎn)生的剪切較小，能適用于大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器。Zhu等[22]應(yīng)用PIV實(shí)驗(yàn)研究了Elephant Ear槳在不通氣與不同通氣量情況下所產(chǎn)生的流場，高速相機(jī)拍下的液體運(yùn)動(dòng)軌跡圖像證明了該槳具有良好的混合性能，另外流場中的湍動(dòng)能比較小，即對細(xì)胞造成的損傷小。2.1.2氣體分布器的類型及特征

傳統(tǒng)的氣體分布器包括3種類型：鉆孔L型結(jié)構(gòu)簡單，加工便利，適用于小型細(xì)胞罐內(nèi)，屬于細(xì)胞罐前期產(chǎn)品開發(fā)中設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)，但目前大多公司較少采用；金屬燒結(jié)微泡型最先由美國Mott公司開發(fā)設(shè)計(jì)，氣體分布器采用重力燒結(jié)和冷等靜壓過程制成，曝氣后氣體在燒結(jié)層內(nèi)部多次打碎氣泡，然后進(jìn)入罐內(nèi)，氣泡尺度較小，溶氧效果可觀，但容易“堵孔”，目前在德國賽多利斯商品化細(xì)胞罐中使用；鉆孔環(huán)型分布器在中小規(guī)模發(fā)酵罐中常常使用，在動(dòng)物細(xì)胞罐中同樣適用，在適量通氣速度下，開孔大小在1 mm[23]曝氣溶氧效果可觀，目前國內(nèi)外多家公司都選擇使用鉆孔環(huán)型氣體分布器。

2.2支架管路

支架管路系統(tǒng)復(fù)雜，集成蒸汽滅菌管路、控溫管路、通氣管路、取樣管路、補(bǔ)料管路和放料管路，對于實(shí)驗(yàn)室臺(tái)式玻璃罐，管路選配醫(yī)藥衛(wèi)生級硅膠軟管，設(shè)計(jì)無菌管路連接口方便實(shí)驗(yàn)操作；對于不銹鋼罐的管路，物料管路必須選擇316 L不銹鋼，設(shè)計(jì)最好能滿足全自動(dòng)在位滅菌(SIP)和在位清洗(CIP)功能。

2.3控制器

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)罐的控制器，采集系統(tǒng)運(yùn)行時(shí)的各種狀態(tài)參數(shù)，如轉(zhuǎn)速、pH、溫度和溶氧，如果設(shè)備自動(dòng)化程度高，只需要手動(dòng)操作控制器就可在位滅菌和在位清洗。目前以西門子公司的PLC模塊控制為技術(shù)最優(yōu)，搭配觸摸屏和與罐體相連的各種傳感器，保證設(shè)備正常操作運(yùn)轉(zhuǎn)。

3攪拌式動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器研究現(xiàn)狀

3.1國外研究現(xiàn)狀

國內(nèi)外眾多企業(yè)都致力于動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器的研究[24]，其中國外多家公司投入大量資金和人力研究開發(fā)動(dòng)物培養(yǎng)罐，并早已進(jìn)入商品化、產(chǎn)業(yè)化時(shí)期。雖然多種規(guī)模類型培養(yǎng)罐都已開發(fā)齊全，但是機(jī)械攪拌動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)罐仍是主流產(chǎn)品。如Lonza公司應(yīng)用20 000 L機(jī)械攪拌動(dòng)物細(xì)胞罐懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)抗體；Genentech公司應(yīng)用機(jī)械攪拌動(dòng)物細(xì)胞罐培養(yǎng)CHO細(xì)胞生產(chǎn)t-PA重組蛋白，放大規(guī)模到12 000 L。

美國的生物工程巨頭企業(yè)全球居多，其中美國New Brunswick Scientific(NBS)公司是世界著名的生物反應(yīng)器制造公司，在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)罐銷售制造方面也是領(lǐng)頭羊角色。該公司開發(fā)的CelliGen BLU小型玻璃培養(yǎng)罐是種多功能型通用式罐，根據(jù)槳葉或通氣量的不同，既能培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞，又能培養(yǎng)微生物，該罐體沒有夾套，采用玻璃罐壁電加熱，罐體容量在5 L以內(nèi)；CelliGen 310是典型的機(jī)械攪拌動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)罐，對不同貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞，細(xì)胞批次培養(yǎng)、流加培養(yǎng)或灌注培養(yǎng)配制不同結(jié)構(gòu)攪拌系統(tǒng)，精確的自控軟件設(shè)計(jì)系統(tǒng)使之操作簡易，保證細(xì)胞正常生長；BioFlo Pro是不銹鋼型攪拌式細(xì)胞培養(yǎng)罐，用于中試生產(chǎn)，采用SIP消毒系統(tǒng)保證無菌要求，符合GMP標(biāo)準(zhǔn)，循環(huán)水控溫和通氣系統(tǒng)設(shè)計(jì)穩(wěn)定可靠。

德國的默克密理博公司研發(fā)的一次性無菌塑料袋有50 和200 L 2種規(guī)模，主要用于工業(yè)生產(chǎn)，采用一次性袋式細(xì)胞培養(yǎng)罐時(shí)，免去了復(fù)雜的滅菌和清洗步驟，袋子通過無菌空氣可最終鼓成圓柱型，并有多個(gè)無菌接口連接攪拌軸、傳感器及氣體分布器管路，外部的不銹鋼夾套不僅能固定袋子隨著流體運(yùn)動(dòng)，同時(shí)起到了控溫效果。德國貝朗公司研發(fā)的BIOSTAT.B是實(shí)驗(yàn)室臺(tái)式玻璃細(xì)胞罐，產(chǎn)品設(shè)計(jì)精巧靈活，專為研發(fā)、工藝開發(fā)而設(shè)計(jì)，全觸摸屏彩色圖像化操控界面，具有參數(shù)曲線趨勢圖顯示功能，有效工作體積可選擇1、2、5和10 L。BIOSTAT.D-DCU是目前德國最新設(shè)計(jì)的中試、生產(chǎn)用不銹鋼動(dòng)物培養(yǎng)罐系列，罐體規(guī)模從10～200 L可選擇，采用全自動(dòng)SIP/CIP、頂蓋自動(dòng)提升、空氣濾器在位完整性測試和雙排氣濾器等，接種取樣接口設(shè)計(jì)合理，目前在世界各國推廣銷售；而BIOSTAT.STR為可放大一次性使用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)罐，設(shè)計(jì)功能和默克密理博相似，規(guī)模可放大到2 000 L，適用于工業(yè)生產(chǎn)。

荷蘭Applikon公司是全球生物反應(yīng)器最頂尖的品牌生產(chǎn)商之一。其研發(fā)的3種培養(yǎng)罐分別是BioBundle、BioBench和Pilot Plant。BioBundle是實(shí)驗(yàn)室玻璃臺(tái)式型，供4路氣入罐體，采用MFC保證通氣溶氧自動(dòng)控制精度，設(shè)計(jì)大方精巧，可選擇夾套控溫或加熱毯控溫，同時(shí)用于灌注培養(yǎng)時(shí)可選配Biosep聲頻灌流裝置；BioBench是原位滅菌型培養(yǎng)罐，滅菌過程手動(dòng)控制，適合細(xì)胞培養(yǎng)和微生物發(fā)酵，并且采用磁力耦合攪拌保證密封效果，無菌程度高；Pilot Plant是工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用型細(xì)胞培養(yǎng)罐，管路復(fù)雜自動(dòng)化程度高，全自動(dòng)CIP/SIP，頂部磁力耦合攪拌保證細(xì)胞培養(yǎng)過程無菌要求。

3.2國內(nèi)研究現(xiàn)狀

近年來，國內(nèi)研究者主要研究方向在大腸桿菌、枯草芽胞桿菌和畢赤酵母等微生物表達(dá)載體上，但隨著國外單克隆抗體等癌癥生物藥市場效益越來越高及國內(nèi)生物制藥產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展[25]，國內(nèi)的研究者才開始重視動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體。多數(shù)企業(yè)模仿學(xué)習(xí)國外引進(jìn)的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)罐技術(shù)，也形成一些商品化的細(xì)胞罐供應(yīng)公司，但是設(shè)備的自動(dòng)化控制等技術(shù)水平還需要大幅度提高。

成都英德生物醫(yī)藥裝備技術(shù)有限公司的機(jī)械攪拌動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)罐有350 和650 L 2種規(guī)格，在國內(nèi)屬于較大規(guī)模設(shè)備，設(shè)計(jì)支持CIP/SIP、磁力耦合攪拌、靜密封與零泄漏，符合cGMP要求，常應(yīng)用于獸用疫苗的生產(chǎn)。

南京比瑞生物科技有限公司動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)罐產(chǎn)品，在懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)及微載體培養(yǎng)等細(xì)胞培養(yǎng)罐中都有應(yīng)用。上海日泰醫(yī)藥設(shè)備工程有限公司采用籃式攪拌槳的細(xì)胞固定化培養(yǎng)罐主要應(yīng)用于貼壁類細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞在固流床中培養(yǎng)時(shí)，進(jìn)入片狀聚脂片內(nèi)，處于相對靜止?fàn)顟B(tài)，各種營養(yǎng)物質(zhì)通過液體的流動(dòng)傳送給細(xì)胞，消除了攪拌槳的剪切力對細(xì)胞的傷害，有利于細(xì)胞的生長。同時(shí)在纖維載體內(nèi)部生長的細(xì)胞具有良好的群體效應(yīng)，不易脫落。

杭州安普(AP)生物工程有限公司致力于一次性袋式反應(yīng)器開發(fā)研究，楊凡等[26]使用AP20和AP200一次性激流反應(yīng)器灌注培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞生產(chǎn)口蹄疫疫苗，在AP20最終細(xì)胞收獲量達(dá)到30.0×109cells(活性95%以上)，灌注20 L，細(xì)胞增殖15倍，在AP200最終收獲細(xì)胞53.6×1010cells(活性90%以上)，灌注120 L，細(xì)胞增殖18倍。吳全德等[9]使用AP5一次性激流反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)HEK293細(xì)胞生產(chǎn)Ad-IFNγ，最后細(xì)胞密度到2.0×106個(gè)/mL，產(chǎn)物達(dá)1.49×1013IFU。

4攪拌式動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器應(yīng)用

4.1在獸用疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用

早在1965年，Telling等便成功利用攪拌式動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)罐懸浮培養(yǎng)BHK21細(xì)胞生產(chǎn)口蹄疫苗?，F(xiàn)如今已普遍采用3 000～8 000 L的攪拌式反應(yīng)器對BHK21細(xì)胞生產(chǎn)口蹄疫苗進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。周燕等[27]在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，利用CelliGen反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)Vero細(xì)胞，表達(dá)豬流行性腹瀉病毒，其密度最高可達(dá)到1.74×106個(gè)/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出方瓶培養(yǎng)產(chǎn)率，并且每個(gè)細(xì)胞的豬流行腹瀉病毒含量與方瓶培養(yǎng)相當(dāng)，制備的免疫原性好。

Novartis公司和Baxter公司先后利用攪拌式動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)罐生產(chǎn)Vero細(xì)胞與MDCK細(xì)胞，高產(chǎn)量表達(dá)出禽流感疫苗，并成功上市。

4.2在單克隆抗體生產(chǎn)中的應(yīng)用

攪拌式動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器用于單克隆抗體生產(chǎn)的例子也是不勝枚舉的。Schenerman等[28]利用攪拌罐反應(yīng)器生產(chǎn)NS0細(xì)胞，表達(dá)單抗(SynagisTM)，在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，隨著規(guī)模增加、細(xì)胞代數(shù)的增加均不影響抗體的產(chǎn)率，并且在無血清培養(yǎng)的條件下，規(guī)模由20 L成功放大到了10 000 L。隨后Sauer等[29]開發(fā)了攪拌罐反應(yīng)器的無血清培養(yǎng)技術(shù)，能夠普遍應(yīng)用與Sp2/0和NS0細(xì)胞系培養(yǎng)生產(chǎn)人或人源化的IgG抗體。Yang等[30]實(shí)現(xiàn)了攪拌罐懸浮培養(yǎng)的控制流加的灌注培養(yǎng)系統(tǒng)，成功應(yīng)用于無血清培養(yǎng)Sp2/0-Ag14細(xì)胞生產(chǎn)hLL2。

4.3在其他重組生物制品生產(chǎn)中的應(yīng)用

為了使細(xì)胞無需消化、能夠直接接種進(jìn)行微載體培養(yǎng)，在攪拌式動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器內(nèi)部安裝旋轉(zhuǎn)過濾器是一個(gè)十分有效的手段。Kong等[31]應(yīng)用該技術(shù)生產(chǎn)CHO細(xì)胞，高產(chǎn)量表達(dá)出單細(xì)胞克隆抑制因子。Hu等[32]在裝有內(nèi)部旋轉(zhuǎn)過濾器的3 L攪拌罐反應(yīng)器中灌注培養(yǎng)CHO細(xì)胞生產(chǎn)重組人絲鈣素，同時(shí)在60 L規(guī)模中用Sf9細(xì)胞生產(chǎn)hSTC，當(dāng)時(shí)成為機(jī)械攪拌式動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器研究進(jìn)程中的里程碑成果。

5結(jié)論與展望

近年來，我國癌癥患者不斷增加，采用化學(xué)藥物治療對患者副作用大，所以研究生物靶向藥物治療越來越熱，以單克隆抗體為代表的生物藥品對不同癌癥的應(yīng)用性高且對患者副作用小，這些生物制藥都由哺乳動(dòng)物細(xì)胞經(jīng)大規(guī)模培養(yǎng)、表達(dá)而來。然而動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)離不開生物反應(yīng)器，以機(jī)械攪拌式動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)罐為代表的生物反應(yīng)器，適用于動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)和微載體懸浮培養(yǎng)，操作方便且放大可觀，現(xiàn)如今已擴(kuò)大到萬升以上的級別，研究設(shè)計(jì)機(jī)械攪拌動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)罐具有重要意義。

然而，在攪拌動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)罐研發(fā)過程中仍舊存在著諸多有待解決提高的問題，諸如如何開發(fā)出剪切力更低、通氣混合效率更好的攪拌式生物反應(yīng)器，確保生產(chǎn)工藝放大的穩(wěn)定性，建立更為精確的數(shù)學(xué)模型來模擬優(yōu)化細(xì)胞的生長環(huán)境等?？梢灶A(yù)期，相關(guān)的研發(fā)成果將為機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器的進(jìn)一步發(fā)展提供巨大的發(fā)展空間。

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(責(zé)任編輯荀志金)

Progress in stirred tank bioreactor for animal cell culture

LUO Haiyan1,DOU Bingran2,JIANG Kaiwei1,HONG Housheng1,3

(1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China；2. College of Chemistry and Molecular Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China；3. Nanjing Highke Bioengineering Equipment Co. Ltd.,Nanjing 210009,China)

Abstract：Animal cell culture in large-scale reactors becomes critical with the rapid development of animal cell culture technology and the growth of therapeutic protein demand. Stirred tank bioreactor becomes most widely applied. This paper reviews the structure and function of stirred tank bioreactor,introduces the application of hydromechanics in the animal cell culture. We summarize recent literatures about the development of stirred tank bioreactor. Finally we pointed out the difficulties existing in the research,and application prospect of stirred tank bioreactor.

Keywords：large-scale animal cell culture;stirred tank bioreactor;structure;function

中圖分類號：Q813.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1672-3678(2016)02-0075-06

作者簡介：駱海燕(1991—)，女，江蘇鹽城人，研究方向：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)；洪厚勝(聯(lián)系人)，研究員，E-mail:hhs@njtech.edu.cn

基金項(xiàng)目：國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2012AA021201)

收稿日期：2015-10-18

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2016.02.014