魏貝　曹華

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科　河南 鄭州　450052)

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miRNA-34c在鼻咽癌組織中的表達及意義

魏貝曹華

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科河南 鄭州450052)

【摘要】目的檢測miRNA-34c在鼻咽癌組織中的表達情況，并探討其在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展中的意義。方法以實時定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)方法檢測28例鼻咽癌石蠟包埋組織中相對于28例鼻咽部慢性炎癥石蠟包埋組織中miRNA-34c的差異表達情況，并結合臨床資料及隨訪結果分析miRNA-34c與鼻咽癌病例臨床因素的相關性。結果鼻咽癌組織中miRNA-34c的相對表達量明顯低于鼻咽部慢性炎癥組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。且隨著臨床分期的增高、淋巴結轉移，miRNA-34c的表達呈下降趨勢。結論miRNA-34c可能參與鼻咽癌的發(fā)生與發(fā)展，調控miRNA-34c的表達量有望為鼻咽癌的治療提供一種新的思路或方法。

【關鍵詞】鼻咽癌；miRNA-34c；表達

鼻咽癌是我國高發(fā)惡性腫瘤之一，臨床多采用以放射治療為主的綜合性治療。局部復發(fā)和遠處轉移是治療失敗的主要原因。洪海裕等[1]通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)鼻咽癌5 a無局部復發(fā)率、無遠處轉移率、總生存率分別為85.1%、88.31%和85.71%。早發(fā)現(xiàn)、早治療對提高患者的生存率有重要意義。miRNA作為新一代腫瘤診斷和分子靶向治療的標志物成為研究熱點。大量實驗研究證實，miRNA可作為腫瘤診斷、預后評估的一種重要生物標志物，包括乳腺癌[2]、結腸癌[3]、前列腺癌[4-5]、肝細胞癌[6]、胃癌[7-8]、腎癌[9]、鼻咽癌[10]等。miRNA-34c是miRNA-34家族中的一員，miRNA-34家族的表達可在不同細胞環(huán)境中引起細胞G0/G1期的阻滯。如果能在鼻咽癌組織中檢測到miRNA-34c表達的變化，將給鼻咽癌的早期診斷提供一定的幫助。本研究以鼻咽癌石蠟包埋組織為研究對象，利用實時定量聚合酶鏈式反應(quantitative real-time polymerase chainreaction，qRT-PCR)方法對miRNA-34c在鼻咽癌石蠟包埋組織相對于鼻咽部黏膜慢性炎組織中的差異表達進行檢測，并對其表達量與鼻咽癌各項臨床因素的相關性進行分析。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1標本收集搜集整理鄭州大學第一附屬醫(yī)院2011年4至2013年3月28例初診為鼻咽癌患者的石蠟包埋組織，均經(jīng)病理證實為低分化非角型鱗狀細胞癌。28例鼻咽癌病例年齡19～73歲(中位年齡45歲)，男19例(67.9%)，女9例(32.1%)。根據(jù) UICC 第7版/2010鼻咽癌分期標準：Ⅰ期5例、Ⅱ期8例、Ⅲ期10例、Ⅳ期5例；M021例、M17例。對照組為同期28例病理診斷為鼻咽部黏膜慢性炎患者，年齡33～48歲(中位年齡43歲)，其中男18例(64.3%)，女10例(35.7%)。兩組年齡和性別差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.1.2實驗主要試劑及引物序列石蠟包埋組織miRNA提取試劑盒購于北京天根生物有限公司，逆轉錄PCR試劑盒購于Applied Biosystems公司，qRT-PCR試劑盒購于Vazyme公司，反應體系及實驗流程均參照試劑盒說明書完成。依據(jù)miR Base數(shù)據(jù)庫16.0中人源miR-34c(has-miR-34c-5p)的基因序列，由生工科技設計Q-PCR所需要的miR -34c特異性引物以及內源性參照U6的引物，并由金維智生物科技公司合成。見表1。

表1　引物序列表

1.2方法

1.2.1總miRNA提取總miRNA的提取依照北京天根科技有限公司石蠟包埋組織miRNA提取試劑盒(DP502)說明書嚴格進行。

1.2.2miRNA反轉錄按照Applied Biosystems公司TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription Kit(4366596)說明書進行。反應體系為15 μl。dNTP mix 1 μl，MiltiScribeTMRT enzyme 1 μl，10×RT buffer 0.15 μl，RNase Inhibitor 0.19 μl；莖環(huán)引物3 μl，Total RNA 360 ng，加水至15 μl。將上述反應體系充分吹打混勻，避免產(chǎn)生氣泡。于StepOne擴增儀上16 ℃、30 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min進行反應，合成的cDNA進行下一步實驗或于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3miRNA的RT-PCR反應miRNA的qRT-PCR反應使用反轉錄試劑盒進行，并以小核RNA U6為內參照進行qqRT-PCR。反應體系為20 μl，每個樣品重復3次。AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix 10 μl，正向引物0.4 μl，反向通用引物0.4 μl，ROX Reference Dye 0.4 μl反向引物1 μl。cDNA 2 μl，加水至20 μl。StepOne Plus儀上95 ℃預變性5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，40個循環(huán)。

1.2.4實驗結果數(shù)據(jù)處理qRT-PCR以小核RNA U6為內參照，對目標基因進行歸一化處理，比較各樣品中目標基因的表達量。用2-△△Ct方法[14]統(tǒng)計實驗結果：鼻咽癌組miR-34c△Ct均值=鼻咽癌組miR-34cCt均值-鼻咽癌組U6Ct均值，正常組miR-34c△Ct均值=正常組miR-34cCt均值-正常組U6Ct均值，△△Ct均值=鼻咽癌組miR-34c△Ct均值-正常組miR-34c△Ct均值，2-△△Ct表示相對于正常組，鼻咽癌組患者石蠟包埋組織中miR-34c的相對表達量(均值是平行重復實驗時，同一樣本在兩個反應管中反應所得的基因Ct值的均值，目的是為了消除加樣量誤差，U6作為陽性內參照基因，用來矯正Q-PCR所擴增基因的拷貝數(shù))。

2結果

2.1總miRNA質量檢測總miRNA的濃度為103～434 ng/μl，滿足實驗要求。RNA吸光值的比值滿足1.80

2.2鼻咽癌組與正常組miRNA-34c表達量比較 鼻咽癌組miRNA-34c相對表達量為(0.268±0.087)。鼻咽癌組石蠟包埋組織中miR-34c表達量明顯低于對照組(P<0.05)。

2.3鼻咽癌組中各亞組間miRNA-34c相對表達量比較不同年齡及性別亞組miRNA-34c相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；Ⅲ、Ⅳ期亞組miRNA-34c相對表達量較Ⅰ、Ⅱ期明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；有淋巴結轉移亞組miRNA-34c相對表達量較無淋巴結轉移亞組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2　 鼻咽癌各亞組間miRNA-34c相對表達量的比較

3討論

鼻咽癌是發(fā)生于鼻咽頂壁與后壁交界處的惡性腫瘤，與吸煙、遺傳、EB病毒感染、環(huán)境等多種因素密切相關。鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展過程中存在癌基因的激活和抑癌基因的失活。微小RNA是一類高度保守、長度20～24個核苷酸的非編碼單鏈小RNA。已有研究表明，人類miRNA的編碼基因結合位點有700多個。據(jù)估計，近1/3的人類基因表達受miRNA的調控。miRNA既可作為抑癌基因下調原癌基因的活性，也可作為癌基因下調抑癌基因的活性，還可調節(jié)腫瘤相關基因的表達。其自身突變、缺失、易位及相互調控異常等可導致相關基因的異常表達。多基礎研究一直在致力于尋找不同腫瘤的特異性miRNA表達譜。腫瘤特異性的miRNA表達譜不僅可以找尋低分化腫瘤的原發(fā)灶，而且對確定組織來源并制定個體化治療方案大有裨益。隨著研究的深入，學者們發(fā)現(xiàn)不同的腫瘤中miRNA表達譜也不盡相同，miRNA-34家族中的miRNA-34b/c與miRNA-34a的功能相似，miRNA-34a在各組織中均有表達，而miRNA-34b/c主要在輸卵管、睪丸、肺及氣管中表達[11]，其啟動子區(qū)域在轉移性癌細胞株中呈表觀遺傳學沉默。諸多實驗研究結果顯示：與正常組織對比，miRNA-34c在諸如結直腸癌、頭頸部鱗狀細胞癌、前列腺癌、乳腺癌及卵巢癌等惡性腫瘤中均呈下調表達，尤其是頭頸鱗狀細胞癌[12-13]。已有研究證實，miRNA作為腫瘤標志物比蛋白質更為靈敏，在石蠟包埋組織中依然相當穩(wěn)定，是用于篩選鑒別生物標志物取材的理想選擇[14]。然而，對于miRNA-34c，既往研究多是以腫瘤細胞系為研究對象，對于人類鼻咽癌低分化鱗狀細胞癌實體腫瘤中miRNA-34c差異表達的相關報道相對較少。本研究通過提取石蠟包埋組織中的miRNA，并以實時熒光定量技術檢測miRNA-34c的相對表達量。結果顯示，鼻咽癌組織中miRNA-34c的相對表達量明顯低于正常組織；有淋巴結轉移的病例miRNA-34c的相對表達量明顯低于無淋巴結轉移的病例；隨著病理分期的增加，miRNA-34c的表達量呈下降趨勢。這與相關研究[15-17]結果基本相符。以上研究表明，miRNA-34c參與了鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展，調控其表達量有望為鼻咽癌的治療提供一種新的思路或方法，但具體機制尚需進一步的研究。

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The expression and significance of miRNA-34c in patients with nasopharyngeal carcinoma

Wei Bei, Cao Hua

(DepartmentofOtolaryngology-HeadandNeckOncology,theFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversityy,Zhengzhou450052,China)

【Abstract】ObjectiveTo detect the expression of miRNA-34c in nasopharyngeal carcinoma tissues, and investigate the significance in the occurrence and development of nasopharyngeal carcinoma. MethodsThe relative expression of miRNA-34c in 28 cases of nasopharyngeal carcinoma with respect to 28 cases of chronic nasopharyngeal flammation tissues were detected by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). The correlation of miRNA-34c and clinicopathological parameters were analyzed with the clinical and follow-up data. ResultsThe relative expression of miRNA-34c in nasopharyngeal carcinoma tissues was lower than the chronic nasopharyngeal inflammation tissues, and the difference was statistically significant (P<0.05). With the increasing of clinical stages and lymph node metastasis, miRNA-34c expression was on the decline. ConclusionmiRNA-34c may participate in the occurrence and development of nasopharyngeal carcinoma. Regulating the expression of miRNA-34c volume is expected to provide new train of thought or method in the treatment of nasopharyngeal carcinoma.

【Key words】nasopharyngeal carcinoma; miRNA-34c; expression

(收稿日期：2015-10-24)

【中圖分類號】R 739.6

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.03.005

通訊作者：曹華，E-mail：951996078@qq.com。