王文勝 陳偉 沈保磊 許波 張俐

【摘 要】目的：建立去勢后原發(fā)性膝骨關節(jié)炎大鼠模型，觀察強骨寶對模型鼠關節(jié)軟骨形態(tài)學及軟骨基質的影響，為進一步研究提供基礎。方法：①去勢后原發(fā)性膝骨關節(jié)炎模型建立：麻醉下摘除雙側卵巢1周后行疲勞性跑步訓練，跑臺坡度-15°，頻率28 m·min-1，60 min·d-1，每周6 d，建立膝骨關節(jié)炎模型。分別于2，4，6周后檢測尿液中Ⅱ型膠原羧基端肽（CTX-Ⅱ），制作股骨髁病理切片鑒定模型。②動物分組與給藥：將造模成功的大鼠隨機分為模型對照組、強骨寶組、陽性對照組，分別給予相應處理。③取材與檢測：給藥4周后，取尿液、血清、雙側股骨髁，檢測尿液中CTX-Ⅱ含量，股骨髁軟骨經(jīng)HE染色處理后行Mankin評分。結果：①模型鑒定：根據(jù)尿液CTX-Ⅱ含量及軟骨Mankin評分結果，造模

4周后關節(jié)軟骨開始退變，6周后退變明顯，模型成功。②給藥治療：Mankin評分及CTX-Ⅱ含量測定結果，與空白對照組比較，模型對照組、強骨寶組、陽性對照組均增高（P < 0.01或P < 0.05）；與模型對照組比較，強骨寶組、陽性對照組均降低（P < 0.05）；與陽性對照組比較，強骨寶組差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。結論：強骨寶可減緩原發(fā)性膝骨關節(jié)炎模型鼠的軟骨損傷進程。

【關鍵詞】 骨關節(jié)炎，膝；強骨寶；動物模型；大鼠；實驗研究

doi：10.3969/j.issn.2095-4174.2016.04.002

Experimental Study on the Effect of Qianggu Bao （強骨寶） on the Articular Cartilage of Primary Knee Osteoarthritis in Ovariectomized Rats

WANG Wen-sheng，CHEN Wei，SHEN Bao-lei，XU Bo，ZHANG Li

【ABSTRACT】Objective：To observe the effect of Qianggu Bao（強骨寶）on the articular cartilage of primary

knee osteoarthritis in ovariectomized rats.Methods：①Establishing models of ovariectomized rats with primary knee osteoarthritis：After anesthesia，bilateral ovariectomy was performed for the experimental rats.After one week，they were forced to do fatigued running training on 15-degree treadmill with frequency of 28 m·min-1，60 min·d-1，for 6 days a week to establish knee osteoarthritis models.CTX-Ⅱin urine was detected respectively after 2，4 and 6 weeks，making pathological identification model of femoral condyle.②Grouping and administration：Successfully modeled rats were randomly divided into a model group，a Qianggu Bao group and a positive control group，and each group was given corresponding treatment.③Sanjmpling and detection：After 4 weeks of administration，urine，serum and bilateral femoral condyle were sampled to detect the content of CTX-Ⅱin urine and make Mankin scores to femoral condyle cartilage after HE staining.Results：①Model identification：According to the content of

CTX-Ⅱin urine and Mankin scores of femoral condyle cartilage，articular cartilage degeneration began after 4 weeks of modeling，which was obvious after 6 weeks，so the models were successfully established.

② Administration for treatment：Compared with the blank control group，Mankin score and CTX-Ⅱcontent of the model control group，the Qianggu Bao group and the positive control group all increased （P < 0.01 or P < 0.05）；compared with the model control group，those of the Qianggu Bao group and the positive control group decreased （P < 0.05）；and the difference between the positive control group and the Qianggu Bao group had no statistical significance （P > 0.05）.Conclusion：Qianggu Bao can slow down the process of cartilage damage in model rats with primary knee osteoarthritis.

【Keywords】 osteoarthritis，knee；Qianggu Bao（強骨寶）；animal model；rats；experimental study

膝骨關節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）屬于退行性病變，致殘率高達53%，全國40歲以上人群患病率為46.3%，其中女性患病率為50.4%[1]。本病的病理改變以關節(jié)軟骨損害為主，累及整個關節(jié)，出現(xiàn)關節(jié)及其周圍軟組織疼痛、腫脹、功能障礙、畸形等臨床表現(xiàn)[2]，嚴重影響患者的身心健康。強骨寶是我國骨傷泰斗張安楨教授的經(jīng)驗方，由骨碎補、補骨脂、木瓜、當歸、川芎、三七、甘草7味藥組成，臨床治療骨關節(jié)疾病效果顯著。本方藥性以辛、溫為主，辛以活血行氣，溫以祛寒除濕；歸經(jīng)以肝、脾、腎三經(jīng)為主。骨碎補苦溫入腎，入腎而治骨，補骨脂苦辛溫燥，善壯腎陽，二藥相須而用，為本方君藥，共奏強筋壯骨之功。當歸長于補血，兼散寒活血止痛；川芎為“血中之氣藥”，善活血行氣，兼祛風通絡止痛；三七專于活血化瘀止痛，兼補虛強壯之功；木瓜味酸入肝，溫香入脾，舒筋活絡化濕除痹之力俱強；此4味共為臣藥，輔助君藥補肝腎，強筋骨，并兼顧氣虛血瘀、風寒濕阻等標證。甘草為佐使，調和諸藥，防止溫熱太過而傷陰，減輕長期服用骨碎補產(chǎn)生的毒性，又可增強緩急止痛的功效。前期研究表明，強骨寶可降低模型鼠血清及關節(jié)軟骨一氧化氮合成酶（induced nitric oxide synthase，iNOS）含量，降低血清中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達，提高血清超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）表達[3]，本研究進一步觀察強骨寶對關節(jié)軟骨退變的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 6月齡SPF級SD大鼠，78只，雌性，體質量（360±20） g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，動物合格證書號SCXK（滬）2012-0002。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學動物實驗中心SPF級動物房，合格證號2009-0001。

1.2 實驗藥物 8萬單位硫酸慶大霉素注射液（福州海生福王制藥有限公司）；0.9%生理鹽水（福州海生福王制藥有限公司）；強骨寶顆粒劑（福建省中醫(yī)藥科技開發(fā)總公司）；筋骨痛消丸（河南省洛正制藥廠，國藥準字Z10970117）。

1.3 實驗試劑和儀器 ZH-PT動物跑臺（淮北正華生物儀器設備有限公司）； ELX800型全自動酶標儀（美國Biotek公司）；DMI 6000+型生物倒置顯微鏡（德國Leica儀器有限公司）；大鼠血清、尿液CTX-Ⅱ ELISA試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

2 方 法

2.1 造模方法 隨機選取24只為空白對照組，

18只為去勢組，36只為模型組。去勢組僅摘除卵巢，模型組摘除卵巢并造模，造模方法參照文獻[4]中去卵巢后聯(lián)合疲勞損傷誘導法：麻醉下摘除雙側卵巢，1周后運用小動物跑步臺行疲勞性跑步訓練，跑臺坡度-15°，頻率28 m·min-1，60 min·d-1，每周6 d。

2.2 模型鑒定方法 分別于造模2，4，6周時，各組隨機選取6只處死，鑒定模型，共用54只。取材：代謝籠收集24 h尿液后實施安樂死，取雙側股骨髁。經(jīng)腹主動脈采集動脈血，靜置1 h后離心機3000 r·min-1離心10 min，取上層血清，

-80 ℃凍存。檢測：截取雙側膝關節(jié)，4%多聚甲醛固定48 h，股骨髁經(jīng)10%EDTA脫鈣6周，石蠟包埋，切片蘇木素-伊紅（HE）染色后對比形態(tài)學改變，記錄Mankin評分；采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法，檢測尿液中CTX-Ⅱ濃度。

2.3 分組方法 將造模成功后剩余的18只模型組大鼠隨機分為模型對照組、陽性對照組、強骨寶組，每組6只，給予相應治療。

2.4 給藥方法 空白對照組予以常規(guī)飼養(yǎng)；模型對照組于造模成功后常規(guī)飼養(yǎng)；陽性對照組選用筋骨痛消丸灌胃，藥物濃度為0.5 g·mL-1；強骨寶組給予強骨寶灌胃，藥物濃度為0.7 g·mL-1。給藥劑量均定為0.5 mL·（100 g）-1，每日2次，共給藥4周。給藥治療4周后全部處死，取材，檢測（方法同2.2中取材與檢測），統(tǒng)計分析強骨寶作用。

2.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)性分布以表示，各組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內(nèi)前后比較采用配對樣本t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學

意義。

3 結 果

3.1 模型的鑒定 根據(jù)尿液CTX-Ⅱ含量及軟骨Mankin評分結果，造模4周后關節(jié)軟骨開始退變，6周后退變明顯，模型成功。見表1、圖1。

3.2 治療后各組軟骨CTX-Ⅱ和Mankin評分含量觀察 與空白對照組比較，其余3組均顯著增高

（P < 0.01或P < 0.05），與模型對照組比較，強骨寶組與陽性對照組均降低（P < 0.01），強骨寶組與陽性對照組間差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表2、圖2。

4 討 論

中醫(yī)學從整體觀的角度認知KOA的發(fā)病與防治，本病之病變雖在關節(jié)局部筋骨，但究其病根在肝脾腎三臟虛衰；另外，工作生活帶來的慢性損傷及風寒濕邪的入侵是發(fā)病的重要條件?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》有云：“肝主筋?！薄澳I主骨。”“脾主肌肉。”“風寒濕三氣雜至合而為痹?！薄芭悠咂呷蚊}虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通；男子七八肝氣衰，筋不能動?！薄毒霸廊珪吩疲骸吧w痹者閉也，以氣血為邪所閉，不得通行而病也?！比说街心?，尤其是女性，進入圍絕經(jīng)期后，正氣日衰，肝脾腎漸虧，精氣血瘀滯，復感外邪或外傷勞損，極易罹患本病，其病機特點可概括為“本虛標實，本痿標痹，痹痿并存”[5-6]。

《內(nèi)經(jīng)》有云：“上工治未病?！盞OA屬于慢性退行性疾病，早期治療對減輕患者病痛，延緩疾病的發(fā)展進程均具有積極的意義。KOA發(fā)病初期以關節(jié)軟骨變性損傷為主要病理改變，關節(jié)軟骨屬中醫(yī)學“筋骨”范疇，CTX-Ⅱ是Ⅱ型膠原最主要的降解產(chǎn)物，屬于非新合成產(chǎn)物，全部以小肽的形式經(jīng)過血液循環(huán)進入尿液，與其他軟骨代謝產(chǎn)物相比具有較長時間的穩(wěn)定性和可靠性，可作為骨關節(jié)炎早期診斷的有效指標[7]。有學者研究表明，軟骨潮線漂移是骨關節(jié)炎軟骨退變進程中必經(jīng)的病理變化[8]。

補腎祛瘀法是中國傳統(tǒng)醫(yī)學治療骨關節(jié)炎的經(jīng)典治法之一，可有效降低多種細胞因子水平，從而實現(xiàn)改善慢性滑膜炎癥，控制或減輕關節(jié)軟骨的損傷進程，減輕疼痛，增強肌肉耐力及關節(jié)活動能力等效果[9]。強骨寶是在補腎祛瘀的思路下組方，以補腎祛瘀藥為君，此類中藥是歷代醫(yī)家治療KOA的方藥中應用較多，研究較深入的一類[10]，整方立意攻補兼施，祛瘀而不傷正，補虛而不留邪，可獲正盛而邪去，實現(xiàn)防治KOA的目的，這與婁多峰的“虛邪瘀”思想有異曲同工之妙[11]。本研究結果顯示，與模型對照組比較，強骨寶組關節(jié)軟骨Mankin評分及尿液CTX-Ⅱ濃度明顯降低，與陽性對照組比較無明顯差異，說明該方可降低大鼠早期膝關節(jié)軟骨的損傷程度，可在KOA的預防與治療中發(fā)揮積極作用，值得進一步研究運用。

5 參考文獻

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結[J].風濕病與關節(jié)炎，2015，4（7）：43-46.

收稿日期：2015-11-23；修回日期：2016-01-04