李虹霖，徐　飛，夏昆鵬，張　淼，王玉玨*

(.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 150001；2.黑龍江省醫(yī)院，哈爾濱 150001)

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頭穴叢刺對AD大鼠神經(jīng)細胞凋亡的影響

李虹霖1，徐飛2，夏昆鵬1，張淼1，王玉玨1*

(.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，哈爾濱 150001；2.黑龍江省醫(yī)院，哈爾濱 150001)

摘要：目的觀察頭穴叢刺對阿爾茨海默病(AD)大鼠神經(jīng)細胞凋亡的影響。方法48只清潔級Wistar大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、治療組、對照組各12只。采用Aβ1-42寡聚體進行造模，造模成功后，治療組采用頭穴叢刺治療，對照組采用傳統(tǒng)頭針治療，模型組與假手術(shù)組不進行任何手段干預(yù)。1次/d，6 d為1個療程，間隔1 d，治療4個療程后，通過免疫組化方法測定海馬區(qū)bcl-2、bax、caspase-3表達的變化。結(jié)果治療組、對照組海馬區(qū)bax、caspase-3表達較模型組均顯著下降(P<0.01),治療組表達低于對照組(P<0.05),bcl-2陽性神經(jīng)元計數(shù)較模型組顯著升高(P<0.01),治療組表達高于對照組(P<0.05)。結(jié)論頭穴叢刺能有效抑制AD大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞凋亡進而提高認知水平。

關(guān)鍵詞：阿爾茨海默病；針灸療法；頭穴叢刺；神經(jīng)細胞凋亡

阿爾茨海默病(AD)又稱老年性癡呆[1]，是一種大腦原發(fā)性神經(jīng)退行性病變[2]，多于早老期發(fā)病[3]。主要以近記憶功能障礙為首要臨床表現(xiàn),繼而出現(xiàn)學(xué)習(xí)能力減退、判斷力下降、言語障礙及運動障礙等[4]。對于本病的發(fā)病機制目前仍不甚明確，中醫(yī)學(xué)認為其與氣滯、痰阻有關(guān)[5]。隨著世界人口步入老齡化社會，AD的發(fā)病率也逐年上升[6]，流行病學(xué)調(diào)查[7]顯示，我國超過60歲老人AD的發(fā)病率為4.2%，家庭及社會承受日漸加重的負擔(dān)，因此對AD治療方法的研究已成為熱門課題。本實驗采用免疫組織化學(xué)染色方法,研究頭穴叢刺對Aβ1-42所致AD模型大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡相關(guān)因子表達的影響,為進一步闡明頭穴叢刺對AD模型大鼠神經(jīng)細胞保護性作用及機制提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1動物分組清潔級Wistar大鼠48只，體質(zhì)量250～300 g，普通環(huán)境喂養(yǎng)。將其隨機分為4組:假手術(shù)組、模型組、對照組、治療組，每組各12只。

1.2模型制備參照大鼠腦立體定位圖譜,給大鼠稱重，大鼠深麻醉以10%水合氯醛由腹腔給藥。用腦立體定位儀固定大鼠，取平顱頭位。大鼠頭部皮膚用乙醇進行消毒，手術(shù)刀剃毛，將皮膚剪開，仔細除去硬腦膜(過氧化氫法剔除)。以囪門、右側(cè)前囟向后3 mm、中線向右旁開2 mm定位海馬背側(cè)部，其深度為顱骨下2.9 mm。鉆孔后將Aβ1-42溶液通過微量進樣器注入海馬區(qū)，用時5 min結(jié)束注射，5 min后出針以保障溶液擴散完全。出針后局部常規(guī)消毒，縫合，連續(xù)進行3 d的青霉素治療，防止感染。假手術(shù)組僅向CA1區(qū)注射等量生理鹽水，手術(shù)操作過程同前。

1.3分組處理治療組：采用于志順教授頭部腧穴七區(qū)劃分法[8]，取頂區(qū)(百會穴及左、右旁開5 mm)、頂前區(qū)(前頂穴及左、右旁開5 mm)、額區(qū)(神庭穴及左、右旁開5 mm)，常規(guī)剪毛消毒。以毫針(規(guī)格：0.35 mm×15 mm)平刺，深度為5mm，行1 min快速捻轉(zhuǎn)手法后留針2 h，期間每30 min 快速捻轉(zhuǎn)1次，1次/d，6 d為1個療程，間隔1 d，治療4個療程。對照組：取百會、四神聰，沿皮分別刺入2 mm，采用平補平瀉手法，快速捻轉(zhuǎn)1 min 后留針2 h。1次/d，6 d為1個療程，間隔1 d，治療4個療程。假手術(shù)組、模型組：每日同一時間段以相同手法進行抓取和固定，但不進行任何治療干預(yù)。

1.4 指標測定

1.4.1取材與切片大鼠以10%水合氯醛(40 mg/100 g)腹腔注射麻醉，經(jīng)心升主動脈插管，先后用生理鹽水、4 ℃、沖洗和灌注、取腦。從腦內(nèi)注射點前0.5 mm處冠狀位切開，由冠狀位向前切取厚約4 mm的腦塊，4 ℃、4%多聚甲醛磷酸緩沖液中固定過夜。常規(guī)石臘包埋，連續(xù)切片，片厚4 μm。

1.4.2免疫組化SP法檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3石蠟切片常規(guī)脫臘后置于3%H2O2去離子水中進行10 min孵育；室溫條件下正常山羊血清孵育10 min；一抗分別滴加兔抗鼠 Bcl-2、Bax、Caspase-3 多克隆抗體(1∶200)4 ℃孵育過夜；生物素標記37 ℃條件下孵育10 min；辣根酶標記鏈酶卵白素工作液37 ℃條件下孵育10 min；DAB顯色，清水沖洗終止反應(yīng)；蘇木精復(fù)染，脫水，透明，中性樹脂封片。PBS代替一抗做陰性對照，其余操作相同。每組隨機選取5張切片進行觀察，每張切片在高倍鏡下隨機取4個4 mm視野，對視野中陽性細胞數(shù)進行計數(shù)，相加后取各組平均值。

2結(jié)果

各組大鼠海馬區(qū)bcl-2、bax、caspase-3陽性細胞數(shù)變化，見表1。

mm2

注：與假手術(shù)組比較，##P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01；與對照組比較，▲P<0.05

3討論

本實驗采用頭穴叢刺療法，以于志順教授通過長年臨床及實驗研究總結(jié)提出“針場”[8]為理論依據(jù)，選取頭針七區(qū)中的頂區(qū)、頂前區(qū)及額區(qū)等映射學(xué)習(xí)記憶能力、認知功能及人格障礙的代表區(qū)[9]，通過大量臨床觀察證明頭穴叢刺能改善AD患者學(xué)習(xí)記憶，療效確切[10]。以此為臨床基礎(chǔ)，通過實驗室研究進一步探討頭穴叢刺改善AD患者學(xué)習(xí)記憶能力的作用機制。

學(xué)習(xí)記憶以神經(jīng)元作為物質(zhì)基礎(chǔ)[11]，研究[12]顯示，神經(jīng)元的丟失與AD認知能力下降之間關(guān)系密切，AD腦內(nèi)的神經(jīng)元的丟失機制主要與細胞凋亡有關(guān)[13]。細胞凋亡具有非常復(fù)雜的發(fā)生機制，受多種凋亡促進或抑制因素的影響。Bcl-2蛋白為抗凋亡蛋白之一，其超表達可抑制細胞凋亡的發(fā)生，而Bax蛋白在Bcl-2家族中屬于前凋亡蛋白，其作用為促進細胞凋亡的發(fā)生[14-15]，capase-3是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，在細胞凋亡過程中起至關(guān)重要的作用[16]。死亡因子激動下使bax轉(zhuǎn)移至線粒體膜上，促使促凋亡因子cyt-c的釋放，使capase-3得以激活，進而啟動capase級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細胞凋亡的進行；而超表達的bcl-2可抑制bax轉(zhuǎn)位的發(fā)生，從而阻斷細胞凋亡進程[17]。研究[18]顯示，AD病人腦中bcl-2蛋白明顯的下調(diào)、bax及capase-3蛋白表達上調(diào)。本研究結(jié)果表明，頭穴叢刺可上調(diào)bcl-2表達、下調(diào)bax及capase-3的表達，從而改善AD大鼠行為認知能力。

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Cluster needling of scalp point therapy on neuron apoptosis of Alzheimer’s disease rats

LI Honglin1,XU Fei2,XIA Kunpeng1,ZHANG Miao1,WANG Yujue1*,

(1.The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150001,China;2.Heilongjiang Provincial Hospital,Harbin 150001,China)

Abstract：ObjectiveTo observe the effect of cluster needling of scalp point therapy on neuron apoptosis of Alzheimer’s disease rats.MethodsForty eight wistar rats were randomized into four groups including model group,sham operation group,observation group and control group.Establish model with Alzheimer’s disease by injecting Aβ1-42oligomer into bilateral hippocampus.After successful modeling,the observation group was intervened by cluster needling of scalp point,the control group only received traditional needling of scalp,and the model group and the sham operation group took no treatment.All rats were treated once a day.One course of treatment was comprised of six days and one day interval.After four courses of treatment,observe the changes of bcl-2,bax and caspase-3 by immunohistochemistry.ResultsCompared with the model group,the expression of bax and caspase-3 of the observation group and the control group decreased significantly (P<0.01).While,there was a lower expression in the observation group than in the control group (P<0.05).Compared with the model group,the expression of bcl-2 of the observation group and the control group increased significantly (P<0.01).While,there was a higher expression in the observation group than in the control group (P<0.05).ConclusionThe cluster needling of scalp point therapy could improve cognitive level by effectively inhibiting neuron apoptosis in hippocampus area of Alzheimer’s disease rats.

Keywords：Alzheimer’s disease;acupuncture therapy;cluster needling of scalp point therapy;neuron apoptosis

(收稿日期:2015-08-26)

文章編號：2095-6258(2016)02-0245-03

中圖分類號：R246.1

文獻標志碼：A

*通信作者：王玉玨，電話-13936262644，電子信箱-wangyujue201314@126.com

作者簡介：李虹霖(1981-)，女，在站博士后，副主任醫(yī)師，主要從事針灸康復(fù)治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

基金項目：黑龍江省自然科學(xué)基金項目(H201476);黑龍江省博士后流動站資助基金“頭穴叢刺對Aβ1-40致AD大鼠MAPK級聯(lián)信號通路影響的研究”(LBH-Z14199)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.02.008