王　征，劉建利，唐志書(shū)*，宋忠興

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

陜西省風(fēng)濕與腫瘤類(lèi)中藥制劑工程技術(shù)研究中心，陜西 咸陽(yáng) 712083；

2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 西部資源與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710069)

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千年健寒熱藥性的實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)

王征1，劉建利2，唐志書(shū)1*，宋忠興1

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

陜西省風(fēng)濕與腫瘤類(lèi)中藥制劑工程技術(shù)研究中心，陜西 咸陽(yáng) 712083；

2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 西部資源與現(xiàn)代生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710069)

摘要：目的通過(guò)前期建立的中藥寒熱藥性的細(xì)胞評(píng)價(jià)方法評(píng)價(jià)中藥千年健的寒熱藥性。方法用噻唑藍(lán)(MTT)比色法考察千年健對(duì)SGC-7901細(xì)胞體外增殖的影響，倒置顯微鏡觀(guān)察千年健對(duì)細(xì)胞形態(tài)特征的影響，臺(tái)盼藍(lán)染色法分析千年健的細(xì)胞毒作用。結(jié)果千年健在5 μg/mL(含5 μg/mL)以下對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。形態(tài)學(xué)觀(guān)察表明千年健在5 μg/mL(含5 μg/mL)以下使細(xì)胞密度增加，細(xì)胞結(jié)構(gòu)致密、生長(zhǎng)旺盛。臺(tái)盼藍(lán)染色表明千年健對(duì)這2種細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒作用。結(jié)論千年健藥性應(yīng)為溫?zé)?，且?duì)所用細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒作用。

關(guān)鍵詞：千年健；寒熱藥性；MTT法；SGC-7901細(xì)胞；臺(tái)盼藍(lán)染色

千年健始載于《本草綱目拾遺卷五》，為天南星科多年生草本植物千年健Homalomenaocculta(Lour.)Schott的根莖[1]?！侗静菰傩隆费云湮犊?，性寒?！吨兴帉W(xué)》認(rèn)為其味苦，性溫[2]。上述文獻(xiàn)表明對(duì)千年健寒熱藥性的認(rèn)識(shí)存在分歧，為了對(duì)其寒熱屬性有一個(gè)客觀(guān)的認(rèn)識(shí)，有必要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。本實(shí)驗(yàn)室在前期的工作中，基于細(xì)胞模型建立了評(píng)價(jià)中藥寒熱藥性的方法[3-5]。該方法基于溫?zé)崴幙梢允股矬w的生理功能亢奮，而寒涼藥則使得生物體生理功能表現(xiàn)為抑制[6]。用動(dòng)物模型也可得出同樣的結(jié)論，即用寒藥造?？梢允箘?dòng)物的體溫降低，中樞興奮抑制以及代謝減慢，而熱藥的作用則相反[7-8]。由此可以推測(cè)，寒熱藥對(duì)生物體最小的組成單位細(xì)胞也應(yīng)該有一定的影響，即寒藥會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖,而熱藥則會(huì)表現(xiàn)出促進(jìn)作用。在前期的工作中已經(jīng)驗(yàn)證了這一想法，已用本法對(duì)野菊花、白頭翁、丹參及白薇等寒熱藥性文獻(xiàn)記載不一的中藥藥性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)。本文用MTT法對(duì)寒熱藥性進(jìn)行評(píng)價(jià)，MTT進(jìn)入活細(xì)胞后被線(xiàn)粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為藍(lán)紫色的甲臜(Formazan)結(jié)晶并在細(xì)胞中沉積。結(jié)晶可以被二甲基亞砜(DMSO)溶解，并在490 nm波長(zhǎng)處具有最大吸收，以此間接反映活細(xì)胞數(shù)量[9]。臺(tái)盼藍(lán)染色(Trypan Blue)是檢測(cè)細(xì)胞膜完整性最常用的方法。由于細(xì)胞死亡后細(xì)胞膜的完整性喪失，通透性增加，因此細(xì)胞可以被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色，而活細(xì)胞由于細(xì)胞膜的存在而使得臺(tái)盼藍(lán)難于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。經(jīng)染色后的細(xì)胞可以通過(guò)顯微鏡觀(guān)察，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)細(xì)胞存活率進(jìn)行比較精確地分析。

1材料

1.1細(xì)胞株人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，由第四軍醫(yī)大學(xué)提供。1.2實(shí)驗(yàn)儀器μQuant 酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek)、CO2培養(yǎng)箱(Sanyo公司)、細(xì)胞96孔培養(yǎng)板、普通倒置光學(xué)顯微鏡、超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

1.3藥品與試劑千年健(購(gòu)自西安藻露堂醫(yī)藥超市,經(jīng)西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院房敏峰高級(jí)工程師鑒定為正品藥材)、HyClone改良型RPMI-1640培養(yǎng)液(賽默飛世爾生物化學(xué)制品北京有限公司)、四季青無(wú)支原體胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、MTT、二甲基亞砜(DMSO)、PBS(磷酸緩沖液)、0.25%胰蛋白酶(西安舟鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)、臺(tái)盼藍(lán)染料(西安沃爾森生物技術(shù)有限公司)。

2方法

2.1受試藥品溶液的制備稱(chēng)取千年健20 g,煎煮3次,30 min/次,合并煎液,濃縮,定容至20 mL,質(zhì)量濃度為1 g/mL。藥液10 000 r/min,離心30 min,上清液用0.22 μm的微孔濾膜濾過(guò),無(wú)菌水稀釋至10 mg/mL,備用。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)將SGC-7901細(xì)胞在含有10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(pH 7.0～7.4)、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中、5%CO2及飽和濕度條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.3MTT試驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、密度為5×107/L的SGC-7901細(xì)胞接種于含200 μL RPMI-1640培養(yǎng)基的96孔板上,置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,待細(xì)胞貼壁后更換新鮮培養(yǎng)液(200 μL/孔),實(shí)驗(yàn)組設(shè)8個(gè)濃度梯度，分別為2、5、10、20、50、100、200、400 μg/mL，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。加藥完畢后96 孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后更換培養(yǎng)基(180 μL/孔),然后加入新鮮配制的MTT溶液(5 g/L)20 μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸棄上清液,每孔加入150 μL DMSO,在37 ℃恒溫?fù)u床上震蕩10 min(60次/min)后，測(cè)定490 nm處吸光度(A)值。按下列公式計(jì)算細(xì)胞抑制率[10]，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

2.4臺(tái)盼藍(lán)染色參照2.3中步驟將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化后接種于96孔板培養(yǎng)48 h后，更換新鮮培養(yǎng)基,每孔加入20 μL、0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染液,作用5 min后在普通光鏡下觀(guān)察。

3結(jié)果

3.1MTT法檢測(cè)用MTT法分別檢測(cè)千年健在2～400 μg/mL濃度范圍內(nèi)SGC-7901細(xì)胞體外增殖的影響見(jiàn)表1。

表1　 千年健對(duì)SGC-7901細(xì)胞體外增殖的影響

注：與對(duì)照組比較，#P<0.05，## P<0.01

從表1可以看出，千年健濃度為2、5 μg/mL時(shí)，可以促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞的增殖。在2 μg/mL濃度下促進(jìn)作用顯著，抑制率為17.52%，而隨著濃度的增大促進(jìn)作用逐漸減弱，在5 μg/mL濃度下幾乎對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖不起作用。而當(dāng)濃度大于5 μg/mL時(shí)則對(duì)SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖表現(xiàn)出抑制作用。為了能更加直觀(guān)的看出千年健對(duì)SGC-7901細(xì)胞的抑制率隨濃度變化的趨勢(shì)，以抑制率對(duì)濃度作圖，所得曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。

圖1　千年健對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率變化

從圖1中可以直觀(guān)的看到千年健對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的作用隨濃度從低到高而表現(xiàn)為先促進(jìn)后抑制，抑制作用與濃度的增大有關(guān)，并且隨著濃度的進(jìn)一步增大，抑制作用還會(huì)加強(qiáng)。根據(jù)筆者以前所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷，千年健性溫?zé)?。此與《中藥學(xué)》所述一致，并為《中藥學(xué)》所述提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支撐。

3.2千年健對(duì)SGC-7901細(xì)胞形態(tài)的影響觀(guān)察對(duì)照組與加藥組在倒置顯微鏡下的觀(guān)察拍照的照片。

選取2、400 μg/mL濃度下的細(xì)胞照片與空白對(duì)照組照片比較?？梢郧宄目吹脚c空白對(duì)照組相比較，2 μg/mL濃度下的細(xì)胞密度增加，而400 μg/mL濃度下細(xì)胞密度明顯降低，細(xì)胞形態(tài)也發(fā)生變化。正常的SGC-7901細(xì)胞呈不規(guī)則的多邊形，細(xì)胞核膜、核仁輪廓明顯，細(xì)胞延展且扁平。在2 μg/mL濃度下細(xì)胞形態(tài)良好，結(jié)構(gòu)致密，生長(zhǎng)旺盛。而400 μg/mL處細(xì)胞密度明顯下降，細(xì)胞變圓，細(xì)胞顆粒感增加。

3.3臺(tái)盼藍(lán)染色SGC-7901細(xì)胞經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后均未見(jiàn)有著色細(xì)胞，說(shuō)明千年健在本實(shí)驗(yàn)所選濃度范

圍內(nèi)對(duì)SGC-7901細(xì)胞沒(méi)有細(xì)胞毒作用。

4結(jié)論

千年健作為一種傳統(tǒng)的中藥，歷來(lái)對(duì)其寒熱藥性說(shuō)法不一?！侗静菰傩隆费云湮犊?，性寒，而《中藥學(xué)》認(rèn)為其性溫。寒熱藥性多是歷代醫(yī)家根據(jù)自己的用藥經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而來(lái)，長(zhǎng)期以來(lái)缺少一個(gè)科學(xué)的評(píng)價(jià)寒熱藥性的實(shí)驗(yàn)方法，因而無(wú)法形成統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)。依據(jù)所建立的評(píng)價(jià)中藥寒熱藥性的方法，通過(guò)MTT法檢測(cè)了千年健對(duì)SGC-7901細(xì)胞體外增殖的影響，在低濃度下千年健對(duì)SGC-7901細(xì)胞的增殖表現(xiàn)為促進(jìn)作用，而當(dāng)濃度大于5 μg/mL時(shí)則表現(xiàn)出抑制作用。且經(jīng)過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色觀(guān)察到千年健對(duì)SGC-7901細(xì)胞不產(chǎn)生細(xì)胞毒性。根據(jù)熱藥可能會(huì)促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖，而寒藥會(huì)表現(xiàn)為抑制，可以得出千年健性溫?zé)徇@一科學(xué)的結(jié)論。這與《中藥學(xué)》所載一致，并且為《中藥學(xué)》的觀(guān)點(diǎn)提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支撐。

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Evaluating cold and hot characteristic ofHomalomenaocculta(Lour.) Schott by experimental method

WANG Zheng1,LIU,Jianli2,TANG Zhishu1*,SONG Zhongxing1

(1.Shaanxi Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization,Shaanxi province key laboratory of new drugs and Chinese medicine foundation research,Shaanxi rheumatism and tumor center of TCM engineering technology research,Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang 712083,China;2.Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China,Ministry of Education,College of Life Science,Northwest University,Xi’an 710069,China)

Abstract:ObjectiveEvaluate the cold and hot characteristic of Homalomena occulta (Lour.) Schott by cellular models.MethodsMTT assay was used to investigate the effect of Homalomena occulta (Lour.) Schott on the growth of SGC-7901 in vitro.Morphological changes of SGC-7901 treated with Homalomena occulta (Lour.) Schott were observed through invert microscope.Trypan-blue staining was used to analyze the cytotoxicity of Homalomena occulta (Lour.) Schott.ResultsHomalomena occulta (Lour.) Schott can promote the growth and proliferation of SGC-7901 in the concentration range of 2-5 μg/mL.Morphological observation showed Homalomena occulta (Lour.) Schott could increase the density of SGC-7901 in the same concentration range.Trypan-blue staining showed Homalomena occulta (Lour.) Schott had no cytotoxicity on SGC-7901.ConclusionThe results reveal in this work that Homalomena occulta (Lour.) Schott shows a hot or warm characteristic and have no cytotoxicity.

Keywords：Homalomena occulta (Lour.) Schott;cold and hot characteristic;MTT assay;SGC-7901;trypan-blue staining

(收稿日期:2015-09-25)

文章編號(hào)：2095-6258(2016)02-0266-03

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

*通信作者：唐志書(shū)，教授，電子信箱-tzs6565@163.com

作者簡(jiǎn)介：王征(1980-)，男，中藥學(xué)博士，講師，主要從事中藥活性成分的仿生合成與結(jié)構(gòu)修飾研究。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(20872118);教育部博士點(diǎn)基金(20070697012);陜西省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(2012KCT-20)。

DOI:10.13463/j.cnki.cczyy.2016.02.016