王猛，熊江，張玲，李翠芹,何臘平,3*，陳平，范勁

1(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)，550025)　2(貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng)，550025)　3(貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng)，550025)　4(貴州大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)，550025)　5(貴州大學(xué)理學(xué)院，貴陽(yáng)，550025)

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動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種BZ11的耐氧馴化及降膽固醇性能的研究

王猛1,2，熊江1,3，張玲1,2，李翠芹4,何臘平1,2,3*，陳平5，范勁1

1(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)，550025)2(貴州大學(xué) 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng)，550025)3(貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng)，550025)4(貴州大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)，550025)5(貴州大學(xué)理學(xué)院，貴陽(yáng)，550025)

摘要為了提高動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種BZ11對(duì)有氧環(huán)境的耐受性，采用逐漸增加培養(yǎng)基中的氧分壓和有氧、厭氧條件下交替培養(yǎng)兩種方案對(duì)其進(jìn)行了耐氧馴化。通過(guò)對(duì)馴化前后菌株的生長(zhǎng)特性進(jìn)行分析得出逐漸增加培養(yǎng)基中的氧分壓的馴化方案取得了更好的效果。經(jīng)最優(yōu)方案馴化后的菌株在有氧條件下培養(yǎng)20 h后，活菌數(shù)可達(dá)到6.30×108 CFU/mL，是初始菌株的2.24倍。馴化后菌株的降膽固醇率為27.31%± 0.80%，與初始菌株相比沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。通過(guò)鑒定得出，動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種BZ11在耐氧馴化前后保持了相似的形態(tài)及生理生化特征。因此，馴化后的菌株有望作為1株潛在益生菌被開(kāi)發(fā)利用。

關(guān)鍵詞雙歧桿菌；耐氧馴化；降膽固醇；鑒定

雙歧桿菌是一種專性厭氧、不運(yùn)動(dòng)、不產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性桿菌，其染色不規(guī)則[1]，最早是由法國(guó)巴斯德研究所的HENRY于1899年從母乳喂養(yǎng)嬰幼兒的糞便中分離得到[2]，后來(lái)發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于人和動(dòng)物的腸道、女性生殖道、反芻動(dòng)物的瘤胃等環(huán)境中，是母乳喂養(yǎng)嬰幼兒腸道的主要微生物[3]。

雙歧桿菌作為一種能夠定植腸道的微生物，已被證實(shí)可以通過(guò)多種機(jī)制對(duì)人體健康產(chǎn)生有益的影響[4]。最近，它們的降膽固醇特性已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注[5]。目前，已經(jīng)有不少體內(nèi)實(shí)驗(yàn)報(bào)道服用含一定數(shù)量益生菌的產(chǎn)品能夠有效降低人體系統(tǒng)中的膽固醇水平和血脂濃度，這對(duì)由高血清膽固醇而引起的人類心腦血管疾病的治療是一個(gè)利好消息[6]。通常采用傳統(tǒng)藥物對(duì)心腦血管疾病進(jìn)行治療時(shí)，收效甚微，且副作用較大；而雙歧桿菌可通過(guò)同化吸收和菌體吸附等多種機(jī)制有效清除腸道中的膽固醇，降低人體對(duì)其的吸收利用，不產(chǎn)生有害代謝產(chǎn)物，且不影響人體對(duì)其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用[7]。

然而，多數(shù)雙歧桿菌屬于專性厭氧菌，當(dāng)將其作為功能性成分添加到食品中時(shí)，由于周圍環(huán)境中氧化壓力的存在，不可避免的會(huì)對(duì)其活菌數(shù)及益生特性產(chǎn)生影響，而人們?cè)谙M(fèi)時(shí)通常選擇和接受的產(chǎn)品所含的益生菌活菌量為106個(gè)/g[8]，這給雙歧桿菌的實(shí)際應(yīng)用帶來(lái)了較多不便。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，有些專性厭氧菌株經(jīng)人工耐氧馴化后可以在有氧的環(huán)境中生長(zhǎng)。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者從多方面對(duì)雙歧桿菌的耐氧機(jī)理進(jìn)行了探討，并采用不同的方法對(duì)雙歧桿菌進(jìn)行了耐氧馴化，如逐漸增加培養(yǎng)基中的氧分壓[9]，在有氧和厭氧環(huán)境下交替培養(yǎng)[10]，進(jìn)行物理或者化學(xué)方法誘變[11]，原生質(zhì)體融合及基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)[12]等，這些方法起到了較好的馴化效果。

本實(shí)驗(yàn)室從香豬源篩選得到1株動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種BZ11(CGMCC No.10224)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該菌株在耐氧馴化前具有一定的降膽固醇能力，為了進(jìn)一步提高菌株的耐氧能力，本研究采用逐漸增加培養(yǎng)基中氧分壓和有氧、厭氧條件下交替培養(yǎng)兩種方案對(duì)該株菌進(jìn)行了耐氧馴化，并考察其耐氧馴化后的生長(zhǎng)及降膽固醇能力，為后期進(jìn)一步研究該株菌的高密度發(fā)酵和實(shí)際應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1菌株來(lái)源

菌株BZ11為本實(shí)驗(yàn)室從貴州省特色資源小香豬腸道內(nèi)溶物中篩選得到，并經(jīng)中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)鑒定為動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)，保藏編號(hào)為：CGMCC No.10224。

1.1.2雙歧桿菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基

PTYG培養(yǎng)基[13]：胰蛋白胨 5 g、大豆蛋白胨5 g、酵母粉10 g、葡萄糖10 g、吐溫80 1 mL、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.05 g、鹽溶液4 mL、蒸餾水1 000 mL；調(diào)pH 值7.0，121 ℃，滅菌20 min。

鹽溶液配方：CaCl20.2 g、K2HPO41.0 g、KH2PO41.0 g、MgSO4·7H2O 0.48 g、Na2CO310 g、NaCl 2 g、蒸餾水1 000 mL，溶解后備用。

降膽固醇培養(yǎng)基[14]：將膽固醇膠束加入到PTYG培養(yǎng)基中使其中含有膽固醇質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL。1 000 mL的液體培養(yǎng)基含0.1 mg/mL膽固醇膠束的制備：用分析天平準(zhǔn)確稱取0.1 g膽固醇放入小燒杯中，然后依次稱取0.2 g膽鹽，0.1 g蔗糖八乙酸酯，1 mL吐溫80于小燒杯中攪拌均勻，然后移取5 mL的冰乙酸加熱溶解，超聲處理15 min后快速加入到液體PTYG培養(yǎng)基中，邊加入邊攪拌，最終使其形成均一穩(wěn)定的膠體溶液，調(diào)pH 值7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3實(shí)驗(yàn)設(shè)備

厭氧培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SW-185I水套式二氧化碳培養(yǎng)箱，上海三騰儀器有限公司；SPX型生化培養(yǎng)箱，上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；SKY-100C恒溫?fù)u床，上海百典儀器設(shè)備有限公司；SHHW2恒溫水箱，上海東星建材試驗(yàn)設(shè)備有限公司；GBJS-5LS自動(dòng)發(fā)酵罐，上海百侖生物科技有限公司；TGL 20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，長(zhǎng)沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司；海爾超低溫保存箱；SW-CJ-2D型雙人凈化工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)；JM-A15002電子天平，余姚市紀(jì)銘稱重校檢設(shè)備有限公司；CX21FS1型OLYMPUS顯微鏡，奧林巴斯中國(guó)有限公司；pH計(jì)，上海鴻蓋儀器設(shè)備公司；T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)方法

將在-80 ℃低溫冰箱里甘油保藏的菌種管取出，在37 ℃恒溫水箱快速解凍，然后采用PTYG 培養(yǎng)基進(jìn)行活化，置于厭氧培養(yǎng)箱(CO2-5%，H2-10%，高純N2-85%)37 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落進(jìn)行劃線純化[13]，取同批次活化后的初始菌株進(jìn)行耐氧馴化。

1.2.2菌體形態(tài)觀察

采用革蘭氏染色，顯微鏡鏡檢法[15]。

1.2.3菌體OD600值的測(cè)定

利用可見(jiàn)分光光度計(jì), 以未接種的PTYG液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，在600 nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行光電比濁測(cè)定，記錄光密度值[15]。

1.2.4活菌數(shù)的測(cè)定

采用平板菌落計(jì)數(shù)法[15]。

1.2.5pH 值的測(cè)定

三角瓶實(shí)驗(yàn)利用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定，發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)通過(guò)發(fā)酵罐配套使用的pH電極進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)控制面板進(jìn)行讀數(shù)。

1.2.6初始菌株生長(zhǎng)能力測(cè)定

將經(jīng)厭氧培養(yǎng)箱活化后的初始菌株在PTYG平板上進(jìn)行多次劃線純化后，挑取單菌落到37 ℃生化培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，32 h后按2%的接種量進(jìn)行液體傳代培養(yǎng)1次，每隔4 h取樣測(cè)定菌株在培養(yǎng)32 h生長(zhǎng)過(guò)程中的吸光值，活菌數(shù)及pH的變化情況，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.7雙歧桿菌的耐氧馴化及生長(zhǎng)能力測(cè)定

1.2.7.1耐氧馴化方案一

通過(guò)逐漸增加液體培養(yǎng)基中氧分壓的方案進(jìn)行馴化。首先，在無(wú)菌條件下挑取純化培養(yǎng)后的初始菌株單菌落接種到PTYG培養(yǎng)基在20% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)；然后，采用2%的接種量在20% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行傳代培養(yǎng)，連續(xù)傳代5次后轉(zhuǎn)到生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)；最后，在轉(zhuǎn)速為150 r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)[9]。每次培養(yǎng)時(shí)間均為32 h，培養(yǎng)溫度均為37 ℃，所采用的培養(yǎng)裝置為250 mL帶棉篩三角瓶，裝液量為50 mL。馴化完畢后，測(cè)定菌株在生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)32 h過(guò)程中的生長(zhǎng)狀況。

1.2.7.2耐氧馴化方案二

通過(guò)在厭氧和有氧條件下交替培養(yǎng)的方案進(jìn)行馴化。首先，在無(wú)菌條件下挑取純化培養(yǎng)后的初始菌株單菌落接種到PTYG培養(yǎng)基在20% CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，32 h后挑取菌懸液在PTYG平板上劃線培養(yǎng)；然后，挑取單菌落接種到PTYG培養(yǎng)基在生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，按此方法在20% CO2培養(yǎng)箱和生化培養(yǎng)箱中交替培養(yǎng)10次，之后完全在生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)5次[10]。所采用的培養(yǎng)裝置同上。馴化完畢后，測(cè)定菌株在生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)32 h過(guò)程中的生長(zhǎng)狀況。

1.2.8耐氧馴化前后菌株的形態(tài)及生理生化鑒定

觀察菌株在耐氧馴化前后進(jìn)行有氧培養(yǎng)時(shí)的菌落形態(tài)，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)，并采用雙歧桿菌生化鑒定管對(duì)耐氧馴化前后的菌株進(jìn)行生理生化鑒定。

1.2.9耐氧馴化后菌株發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)生長(zhǎng)性能測(cè)定

將經(jīng)最優(yōu)馴化方案馴化的菌株在5 L發(fā)酵罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，接種量為2%，培養(yǎng)溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，培養(yǎng)基初始pH 7.0。每隔4 h從發(fā)酵罐中進(jìn)行取樣，測(cè)定菌株在培養(yǎng)48 h生長(zhǎng)過(guò)程中吸光值，活菌數(shù)及pH的變化情況，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.2.10耐氧馴化前后菌株的降膽固醇能力的測(cè)定。

將耐氧馴化前后的菌株活化并純化培養(yǎng)3次后，挑取單菌落接種到PTYG培養(yǎng)基中在20% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h后，分別將菌液在10 000 r/min，4 ℃離心10 min收集菌體，調(diào)整菌濃度后按10%的接種量接種于降膽固醇培養(yǎng)基中，在20% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后參照鄰苯二甲醛法(OPA)[14]測(cè)定菌株在耐氧馴化前后的降膽固醇能力。

1.3數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3 次，所得數(shù)據(jù)表示為均值±SD，運(yùn)用Origin Pro7.5進(jìn)行作圖，并用SPSS Statistics 19進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2結(jié)果與分析

2.1動(dòng)物雙歧桿菌的耐氧馴化

將經(jīng)兩種方案耐氧馴化后的菌株及初始菌株分別按照2%接種量接種于有氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)。測(cè)定菌株在培養(yǎng)32 h生長(zhǎng)過(guò)程中的OD600值、活菌數(shù)和pH值，繪制生長(zhǎng)曲線并進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果如圖1，圖2和圖3所示。

圖1　耐氧馴化前后動(dòng)物雙歧桿菌的生長(zhǎng)過(guò)程O(píng)D600值變化的比較Fig.1　Time courses of OD600 values of oxygen-resistant and original strains

圖2　耐氧馴化前后動(dòng)物雙歧桿菌的生長(zhǎng)過(guò)程活菌數(shù)變化比較Fig.2　Comparison of live bacterium number between oxygen-resistant and original strains

圖3　耐氧馴化前后動(dòng)物雙歧桿菌的生長(zhǎng)過(guò)程pH 變化的比較Fig.3　Time courses of growth pH of oxygen-resistant and original strains

由圖1，圖2，圖3及統(tǒng)計(jì)分析表明，與初始活菌數(shù)相比，菌株在耐氧馴化前后均可以在有氧條件下顯著生長(zhǎng)(P<0.05)，菌株在培養(yǎng)4 h后便可以進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(P<0.05)。按第一種方案馴化后的菌株在培養(yǎng)16 ～28 h處于穩(wěn)定期(P>0.05)，在20 h處活菌數(shù)達(dá)到最大為6.30×108CFU/mL，培養(yǎng)液OD600值為0.938，pH值下降到3.38。按第二種方案馴化后的菌株也在培養(yǎng)16 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，在20 h處活菌數(shù)達(dá)到最大為3.80×108CFU/mL，培養(yǎng)液OD600值為0.928，pH值下降到3.49。而未經(jīng)過(guò)馴化的菌株，在培養(yǎng)4 h后進(jìn)入快速增長(zhǎng)期，8 h后進(jìn)入緩慢增長(zhǎng)期，28 h后進(jìn)入衰亡期，在培養(yǎng)24 h后活菌數(shù)達(dá)到最大為2.82×108CFU/mL，此時(shí)培養(yǎng)液OD600值為0.923，pH值下降到3.54。對(duì)耐氧馴化前后的菌株在有氧條件下培養(yǎng)32 h過(guò)程中的達(dá)到的最大活菌數(shù)檢測(cè)結(jié)果及方差分析見(jiàn)表1、表2。

表1　不同方案馴化動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種BZ11的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：1) 標(biāo)有同一字母的數(shù)據(jù)間差異不顯著；2) 方差分析采用Duncan新復(fù)極差法。

表2　不同方案馴化動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種BZ11

注：1)F0.05(2,6)=5.14；2) F0..01(2,6)=10.92；2) * *表示顯著性P<0.01。

由表1結(jié)果可知，經(jīng)方案一馴化后的菌株活菌數(shù)最大，是馴化前初始菌株的2.24 倍。表2方差分析表明，幾種馴化方案馴化效果差異顯著。采用Duncan新復(fù)極差法可知，方案一與方案二差異顯著。另對(duì)最大活菌數(shù)對(duì)應(yīng)的pH值分析表明，馴化后的菌株較馴化前產(chǎn)酸能力更強(qiáng)(P<0.05)。因此，確定方案一為最優(yōu)馴化方案。

2.2耐氧馴化前后菌株形態(tài)及生理生化特征的比較

2.2.1形態(tài)特征

將耐氧馴化前后菌株在有氧條件下進(jìn)行活化培養(yǎng)后進(jìn)行平板稀釋涂布，觀察所長(zhǎng)出的菌落的形態(tài)特征，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色并在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，對(duì)比結(jié)果如表3，圖4和圖5所示。

表3　耐氧馴化前后動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種BZ11形態(tài)特征

圖4　耐氧馴化前動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種BZ11菌體形態(tài)(×1000)Fig.4　Morphological photography of B. animalis subsp.lactis BZ11 before oxygen domestication

圖5　耐氧馴化后動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種BZ11菌體形態(tài)(×1000)Fig.5　Morphological photography of B. animalis subsp.lactis BZ11 after oxygen domestication

2.2.2耐氧馴化前后菌株的生理生化鑒定

采用雙歧桿菌生化鑒定管對(duì)耐氧馴化前后的菌株進(jìn)行鑒定，鑒定管內(nèi)液體呈黃色為陽(yáng)性，如呈現(xiàn)紫色或紫灰色為陰性。鑒定結(jié)果如表4所示。

從表3、表4及圖4、圖5得出的菌株在耐氧馴化前后的形態(tài)及生理生化特征基本保持一致，所以確定菌株在耐氧馴化后沒(méi)有發(fā)生變異。

表4　耐氧馴化前后動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種BZ11的

注：表中“+”表示陽(yáng)性反應(yīng)；“-”表示陰性反應(yīng)。

2.3馴化后菌株在發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)生長(zhǎng)能力的測(cè)定

將經(jīng)第一種方案馴化后的菌株在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，生長(zhǎng)曲線如圖6所示。由圖6看出，在培養(yǎng)過(guò)程中馴化后的動(dòng)物雙歧桿菌沒(méi)有明顯的延滯期，在培養(yǎng)4 h后便進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在24 h處活菌數(shù)達(dá)到最大為5.50×108CFU/mL，比初始活菌數(shù)顯著提高了近兩個(gè)數(shù)量級(jí)(P<0.05)。另外，OD600值在32 h處達(dá)最大為1.442，OD600值是活菌數(shù)和死菌數(shù)總體變化情況，所以最大OD600值時(shí)間與最大活菌數(shù)時(shí)間并不一致。

圖6　5 L發(fā)酵罐中耐氧馴化后動(dòng)物雙歧桿菌BZ11發(fā)酵曲線圖Fig.6　Fermentation curve of domesticated B. animalis subsp.lactis BZ11 in 5L fermentor

2.4耐氧馴化前后菌株的降膽固醇能力的測(cè)定

按照OPA方法分別測(cè)定了耐氧馴化前后菌株在培養(yǎng)48 h后菌株降膽固醇率，耐氧馴化后菌株的降膽固醇率達(dá)到27.31%±0.80%，耐氧馴化前菌株的降膽固醇率為27.10%±0.92%，將菌株耐氧馴化前后的降膽固醇率進(jìn)行t檢驗(yàn)得出無(wú)顯著性差異(P=0.823>0.05)。因此得出，菌株在耐氧馴化前后降膽固醇能力并未受到較大影響。

3討論

本文研究結(jié)果表明當(dāng)采用逐漸增加培養(yǎng)基中氧分壓對(duì)動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種BZ11進(jìn)行耐氧馴化后，可以促進(jìn)菌株更好地適應(yīng)有氧環(huán)境。馴化后的菌株較馴化前在培養(yǎng)過(guò)程中推遲達(dá)到穩(wěn)定期，且活菌數(shù)也有顯著提高。杜少平[9]也曾采用逐漸增加培養(yǎng)基中氧分壓的方法對(duì)兩歧雙歧桿菌進(jìn)行耐氧馴化取得了較好的效果，與本研究的不同之處在于所采用的CO2濃度為5%，而本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采用的CO2濃度為20%。KAZUAKI[16]曾采用不同的CO2濃度對(duì)長(zhǎng)雙歧桿菌培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)了當(dāng)CO2濃度為20%時(shí)，所獲得的細(xì)胞量和胞外多糖量均可達(dá)到最大。由此得出，適當(dāng)增加CO2的濃度有助于厭氧菌株更好地進(jìn)行生長(zhǎng)和代謝。當(dāng)然也有其他的馴化方案，如吳敏[17]曾采用了逐漸降低培養(yǎng)基中的抗氧化劑含量對(duì)嬰兒雙歧桿菌進(jìn)行耐氧馴化，李麗[12]也成功運(yùn)用了原生質(zhì)體融合技術(shù)顯著改善了德氏乳桿菌的耐氧性。

關(guān)于雙歧桿菌的耐氧機(jī)制，國(guó)內(nèi)外多位學(xué)者已對(duì)其進(jìn)行了探討，TALWALKAR等[18]研究表明, 不同的氧氣濃度能促使雙歧桿菌的NADH 氧化酶活力和NADH過(guò)氧化物酶活力提高1.5～3倍，從而能抵制氧的毒性作用。然而KAWASAKI等[19]發(fā)現(xiàn)，NADH 氧化酶和NADH 過(guò)氧化物酶活力不是造成它們耐氧性差異的主要原因，并進(jìn)一步研究表明：在pH 5.0～6.0時(shí), 耐氧性高的雙歧桿菌的NADH 氧化酶以NADH-H2O 活性為主，而耐氧性低的雙歧桿菌的NADH 氧化酶以NADH-H2O2活性為主, 這表明NADH 氧化酶的類型也影響著雙歧桿菌的耐氧性。趙建云[20]研究了長(zhǎng)雙歧桿菌在氧氣脅迫下菌體生長(zhǎng)以及葡萄糖代謝中關(guān)鍵酶基因mRNA的變化情況，得出長(zhǎng)雙歧桿菌耐氧性與葡萄糖代謝酶有一定關(guān)聯(lián)。左芳雷[21]曾對(duì)B.longum BBMN68的耐氧機(jī)制進(jìn)行了探討，提到該菌對(duì)氧脅迫的應(yīng)答是一個(gè)涉及到全基因組的全面而復(fù)雜的過(guò)程，包括一系列的抵御和適應(yīng)性機(jī)制，進(jìn)一步對(duì)其氧脅迫相應(yīng)中的差異表達(dá)基因的功能進(jìn)行驗(yàn)證，得出AhpC是雙歧桿菌清除有氧產(chǎn)生的內(nèi)源氧化物的主要酶類。關(guān)于本實(shí)驗(yàn)所采用的動(dòng)物雙歧桿菌所涉及到的耐氧機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

對(duì)經(jīng)最優(yōu)馴化方案馴化前后菌株的降膽固醇能力進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)耐氧馴化前菌株的降膽固醇率為27.10%±0.92%，而耐氧馴化后菌株的降膽固醇率達(dá)到了27.31%±0.80%，菌株在耐氧馴化前后降膽固醇能力并沒(méi)有受到太大的影響。HOV等[22]曾研究發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌GL-03能夠明顯降低高血脂老鼠的總膽固醇和甘油三酯的水平，其中降膽固醇率能夠達(dá)到56.11%±3.58%。MUKESH等[23]曾對(duì)培養(yǎng)24 h后干酪乳桿菌和德氏乳桿菌的降膽固醇能力進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)降膽固醇率分別達(dá)到了22%和26%，后來(lái)用富含2株菌的飼料喂養(yǎng)小鼠發(fā)現(xiàn)能夠明顯降低小鼠血清總膽固醇水平而其他組織沒(méi)有發(fā)現(xiàn)病理性變化。而目前關(guān)于耐氧性能好且能降膽固醇的雙歧桿菌還少有報(bào)道。LYE[24]曾對(duì)5種乳酸菌在模擬腸道環(huán)境下降膽固醇的機(jī)制進(jìn)行了研究，提到了5種主要機(jī)制分別是菌株生長(zhǎng)過(guò)程中的同化吸收；細(xì)胞表面的黏附；膽固醇膠束的裂解；膽鹽的解離和酸性環(huán)境下膽鹽水解酶的酶解。關(guān)于何種降膽固醇機(jī)制起主導(dǎo)作用有待進(jìn)一步深入研究。

將馴化后菌株在5 L發(fā)酵罐進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，菌株在培養(yǎng)24 h后活菌數(shù)最高可達(dá)5.50×108CFU/mL，說(shuō)明了馴化后的菌株在有氧條件下已具備一定的生長(zhǎng)能力，且滿足雙歧桿菌揮益生作用的濃度。經(jīng)形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定得出馴化后的菌株較馴化前并未發(fā)生變異。在對(duì)其進(jìn)行安全評(píng)價(jià)通過(guò)后有望被添加到食品制品中進(jìn)行擴(kuò)大生產(chǎn)和利用，從而能更好地滿足人們的生活需求。

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Studies on oxygen domestication and cholesterol degradation property ofBifidobacteriumanimalissubsp.lactisBZ11

WANG Meng1,2,XIONG Jiang1,3,ZHANG Ling1,2, LI Cui-qin4,HE La-ping1,2,3*,CHEN Ping5,FAN Jin1

1(School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University, Guiyang 550025,China)2(Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Store & Processing of Guizhou Province, Guiyang 550025,China)3(Fermentation Engineering and Biopharmacy,Guizhou University,Guiyang 550025,China)4(School of Chemistry and Chemical Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China)5(College of Science,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

ABSTRACTTo improve the aerotolerant capacity of Bifidobacterium animalis subsp.lactis BZ11 in aerobic environment, two ways including gradual increase of the partial pressure of oxygen in medium and alternate incubation between aerobic and anaerobic were taken. After analyzing the growth characteristics of the strain pre- and post- domestication, the first method obtained a better effect and cell concentration of the domesticated strain reached 6.30×108 CFU/mL after cultivating in aerobic conditions for 20 h, which was 2.24 times of the concentration of the original strain. The cholesterol degradation rate of the strain after oxygen-domestication was 27.31%±0.80%, which didn’t show significant difference (P>0.05) compared with the original strain. Moreover, identification results indicated that the physiological and morphological characteristics of domesticated Bifidobacterium animalis subsp.lactis BZ11 kept similar to those of the original strain. So it can be used as a potential probiotics for further in-depth development and utilization.

Key wordsBifidobacterium; oxygen- domestication; cholesterol degradation; identification

收稿日期：2015-10-20，改回日期：2015-12-07

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(31160002)；貴州省豬肉制品工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目(黔科合農(nóng)G字[2013]4001號(hào))；貴州省豬肉特色制品深加工關(guān)鍵技術(shù)研究及產(chǎn)業(yè)化示范(黔科合重大專項(xiàng)字[2015]6004號(hào))

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603001

第一作者：碩士研究生(何臘平教授為通訊作者，E-mail：helaping@163.com)。