楊瀟，羅靜，張廣峰，秦佳

1(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都，610039)　2(小金縣夾金山天然野櫻桃酒業(yè)有限公司，四川 小金，624200)

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超臨界CO2萃取所得細(xì)齒櫻桃籽油和揮發(fā)油的抗氧化活性和成分分析

楊瀟1*，羅靜1，張廣峰1，秦佳2

1(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，四川 成都，610039)2(小金縣夾金山天然野櫻桃酒業(yè)有限公司，四川 小金，624200)

摘要采用超臨界CO2工藝萃取得到細(xì)齒櫻桃籽油及其揮發(fā)油并對(duì)其抗氧化活性和化學(xué)成分進(jìn)行分析。結(jié)果表明: 細(xì)齒櫻桃籽油具有較高的抗氧化活性，其成分由14種脂肪酸組成, 其中不飽和脂肪酸占88.12%，主要為油酸(47.09%)和亞油酸(38.69%)。細(xì)齒櫻桃籽揮發(fā)油經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用-自動(dòng)質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)(gas chromatography-mass spectrometry-automocted mass spectral deconfolotion and iderclification system, GC/MS/AMDIS)分析,鑒定出17種主要物質(zhì), 其中主要成分是具有多種藥理學(xué)活性的β-谷甾醇(60.3%)。

關(guān)鍵詞細(xì)齒櫻桃籽油；揮發(fā)油；抗氧化；成分分析

細(xì)齒櫻桃(CerasusserrulaFranch. Yu et Li)，又名“四川櫻桃”、“野櫻桃”，屬薔薇科(Rosaceae)李亞科 (Prunoideae) 櫻屬(Cerasus)細(xì)齒組 (Sect.Serrula)喬木。主要分布于四川、云南、西藏，生長于海拔2 600～3 900 m的山坡草地和山谷林中[1]。屬地域性稀缺特種資源，營養(yǎng)極為豐富，果肉和果皮可入藥，具清肺利咽，止咳的功效。由于生長海拔高，少有病蟲害浸襲和農(nóng)藥的污染，是不可多得的綠色食品。但細(xì)齒櫻桃鮮果為低糖、高酸且不耐運(yùn)輸儲(chǔ)藏，基本沒有鮮果銷售的商業(yè)價(jià)值。目前主要作為野櫻桃果酒、罐頭、果脯等深加工的原料，而在這些加工過程中產(chǎn)生的大量櫻桃籽，則大部分用作動(dòng)物飼料生產(chǎn)或直接廢棄，造成極大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。

由于目前針對(duì)細(xì)齒櫻桃籽開發(fā)的基礎(chǔ)研究較少，本研究對(duì)采用超臨界CO2萃取的細(xì)齒櫻桃籽油和揮發(fā)油的抗氧化活性、理化性質(zhì)及化學(xué)成分進(jìn)行了全面的研究。

1材料與方法

1.1材料與試劑

細(xì)齒櫻桃由小金縣夾金山天然野櫻桃酒業(yè)有限公司提供；CO2(純度>99．0%)，成都僑源氣體有限公司；1,1-二苯基-2-苦肼基(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl，DPPH)，購自美國Sigma公司; 石油醚、KOH、無水乙醚、三氯甲烷、無水Na2SO4，均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

HA 221-50-06型超臨界萃取裝置，南通市華安超臨界萃取設(shè)備有限公司；BS323S電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司；XFB-400小型粉碎機(jī)， 中南制藥機(jī)械廠；GCMS-2010 plus 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津；SOX-406脂肪測(cè)定儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；M100多功能酶標(biāo)儀，奧地利Tecan公司。

1.3櫻桃籽預(yù)處理

將櫻桃果肉與櫻桃籽進(jìn)行分離，并將櫻桃籽清洗后置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中50 ℃烘干、粉碎，60目過篩后，置于干燥器內(nèi)室待用。

1.4櫻桃籽中粗脂肪含量和揮發(fā)油含量的測(cè)定

根據(jù)“GB/T 14772—2008 食品中粗脂肪的測(cè)定”所提供方法測(cè)定細(xì)齒櫻桃籽中的粗脂肪含量。根據(jù)”GB/T 30385—2013 香辛料和調(diào)味品揮發(fā)油含量的測(cè)定”所提供方法檢測(cè)細(xì)齒櫻桃籽中揮發(fā)油含量。

1.5超臨界CO2萃取櫻桃籽油和揮發(fā)油

稱取500 g櫻桃籽粉裝入超臨界CO2萃取裝置中，在萃取溫度50 ℃、萃取時(shí)間120 min、CO2流量20 L/h的條件下進(jìn)行萃取，分離釜1的壓力10 MPa，溫度40 ℃。分離釜2壓力為5 MPa，溫度30 ℃。從分離釜1和分離釜2中收集樣品。

1.6超臨界CO2萃取細(xì)齒櫻桃籽油的理化性質(zhì)測(cè)定

取超臨界CO2萃取的細(xì)齒櫻桃籽油，參照GB/T 5530—2005提供方法測(cè)定其酸值;參照“GB/T5532—2008 動(dòng)植物油脂碘值的測(cè)定”中提供的方法測(cè)定碘值;參照“GB/T 5527—2010 動(dòng)植物油脂折光指數(shù)的測(cè)定”中提供的方法測(cè)定折光指數(shù);參照“GB/T 5534—2008 動(dòng)植物油脂皂化值的測(cè)定” 中提供的方法測(cè)定皂化值;參照“GB/T 5535.1—2008 動(dòng)植物油脂不皂化物測(cè)定”中提供的方法測(cè)定不皂化物含量;參照“GB/T 5537—2008 糧油檢驗(yàn)磷脂含量的測(cè)定”中提供的方法測(cè)定磷脂含量。

1.7櫻桃籽油和揮發(fā)油抗氧化活性測(cè)定

采用DPPH(1,1-diphenyl-2-picryhydrazyl)法進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定[2-3]，通過檢測(cè)對(duì)DPPH自由基清除率來比較超臨界CO2萃取所得櫻桃籽油和揮發(fā)油的抗氧化活性。取5 μL樣品加入120 μL無水乙醇稀釋，置于96孔酶標(biāo)板中，加入275 μL的DPPH溶液，于酶標(biāo)儀內(nèi)室溫避光反應(yīng)90 min，同時(shí)以無水乙醇為空白，每5 min于517 nm波長處測(cè)定吸光值。 每個(gè)樣品取4個(gè)平行樣，按下列公式計(jì)算DPPH自由基清除率。同時(shí)以油酸為對(duì)照組。

DPPH自由基清除率/%=[1-(As-Ac)/A0]×100

式中:A0,125 μL無水乙醇 + 275 μL DPPH溶液的吸光度值;As,125 μL樣品稀釋液 + 275 μL DPPH溶液的吸光度值;Ac,125 μL樣品稀釋液 + 275 μL無水乙醇的吸光度值。

1.8櫻桃籽油中脂肪酸組成分析

準(zhǔn)確稱取0.5 g 櫻桃籽油于10 mL具塞試管中，分別加入5.0 mL 0.4 mol/L NaOH-甲醇溶液，渦旋混合20 s，每5 min搖勻1次，室溫下反應(yīng)40 min,分別加入5.0 mL正己烷，搖勻，靜置分層，取上清液分別加入0.5 g無水Na2SO4干燥，用0.22 μm過濾器過濾后，供GC-MS聯(lián)用儀分析。

分析條件如下：氣相色譜條件：Rtx-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m ×0.25 mmID×0.25 μm)； 采用程序升溫，100℃維持6 min，6 ℃/min，升至230 ℃，停留10 min；載氣為高純He (99.999%)，載氣流量1.0 mL/min；柱前壓57.4 kPa；汽化室溫度為250 ℃；進(jìn)樣量1 μL；分流比10∶1。質(zhì)譜條件：EI 離子源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度：200 ℃；接口溫度250 ℃；電子能量70 eV；倍增器電壓1.8 kV；溶劑延時(shí)4 min；掃描方式：SCAN；質(zhì)量掃描范圍40～550 amu。

1.9櫻桃籽揮發(fā)油成分的GC/MS/AMDIS分析

取從分離釜2中收集所得櫻桃籽揮發(fā)油，用甲醇按5%的比例將其稀釋后采用GC/MS 聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)，分析條件如下：氣相色譜條件：Rtx-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m ×0.25 mmID×0.25 μm)； 采用程序升溫，150 ℃維持3 min，5 ℃/min，升至280 ℃，停留6 min；載氣為高純He (99.999%)，載氣流量1.0 mL/min；柱前壓57.4 kPa；汽化室溫度為220 ℃；進(jìn)樣量1 μL；分流比20∶1。質(zhì)譜條件：EI 離子源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度：200 ℃；接口溫度280 ℃；電子能量70 eV；倍增器電壓1.8 kV；溶劑延時(shí)4 min；掃描方式：SCAN；質(zhì)量掃描范圍40～450 amu。由于櫻桃籽揮發(fā)油中成分十分復(fù)雜，總離子流色譜圖(TIC)中可能存在著重疊峰，甚至內(nèi)嵌峰，從而影響成分的鑒別。因此可通過自動(dòng)質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)(AMDIS，version 2.69, National Institute of Standards and Technology)進(jìn)行重疊峰拆分分析[4]，再應(yīng)用NIST質(zhì)譜搜索程序(version 2.0 d, National Institute of Standards and Technology)從NIST11譜庫中檢索出相應(yīng)的化合物。

2結(jié)果與討論

2.1超臨界CO2萃取細(xì)齒櫻桃籽油的理化性質(zhì)

細(xì)齒櫻桃籽中粗脂肪含量為(8.9±0.2) %，揮發(fā)油含量為(0.56±0.15) %。采用超臨界CO2萃取后，從分離釜1中收集到呈淡黃色透明狀的櫻桃籽油, 從分離釜2中收集到呈無色透明狀，具有芳香氣味的櫻桃籽揮發(fā)油。其中櫻桃籽油經(jīng)檢測(cè)，其主要理化性質(zhì)見表1。

表1　細(xì)齒櫻桃籽油理化性質(zhì)

2.2超臨界CO2萃取細(xì)齒櫻桃籽油的抗氧化活性分析

細(xì)齒櫻桃籽油、揮發(fā)油與油酸對(duì)DPPH自由基清除率的時(shí)間效應(yīng)變化見圖1。當(dāng)反應(yīng)體系中存在5 μL/mL 油樣的條件下，三者對(duì)DPPH自由基清除率均隨著時(shí)間的延長先急劇增加而后趨于平穩(wěn)。而細(xì)齒櫻桃籽油對(duì)DPPH自由基的清除能力在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)上均顯著高于油酸，最終的自由基清除率超過50%，表明細(xì)齒櫻桃籽油具有較高的抗氧化能力；而櫻桃籽揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基的清除能力卻略低于油酸，表明其抗氧化能力并不高。這暗示著細(xì)齒櫻桃籽油和揮發(fā)油具有完全不同的成分。

圖1　櫻桃籽油和揮發(fā)油自由基清除率時(shí)間效應(yīng)曲線Fig.1　Time effect curve of free radicals clearance rate from serration cherry seed oil and volatile oil

2.3超臨界CO2萃取細(xì)齒櫻桃籽油的的脂肪酸組成

通過超臨界CO2萃取工藝所得細(xì)齒櫻桃籽油甲酯化處理后, 經(jīng)GCMS分析所得TIC圖見圖2,經(jīng)NIST08庫比對(duì)檢索，共檢測(cè)出14種主要脂肪酸(見表2)。其中以油酸、亞油酸、亞麻酸為主的不飽和脂肪酸含量達(dá)88.18%，高于目前文獻(xiàn)所報(bào)道的普通櫻桃籽油中不飽和脂肪酸含量[5-7]。由于不飽和脂肪酸具有保證細(xì)胞的正常生理、酯化膽固醇降低血脂、改善血液微循環(huán)、提高腦細(xì)胞的活性等生理功能[8]，因此細(xì)齒櫻桃籽油具有較高的營養(yǎng)價(jià)值。但是油脂中不飽和脂肪酸含量較高又存在著易于氧化變質(zhì)的問題，因此當(dāng)以細(xì)齒櫻桃籽為原料進(jìn)行油脂加工時(shí)應(yīng)實(shí)施抗氧化保護(hù)。

圖2　細(xì)齒櫻桃籽油脂肪酸甲酯總離子流色譜圖Fig.2　TIC of serration cherry seed oil fatty acid methyl esters

序號(hào)甲酯化產(chǎn)物保留時(shí)間/min名稱結(jié)構(gòu)縮寫相對(duì)含量/%113.913棕櫚酸(hexadecanoicacid)C16∶05.43215.422棕櫚油酸(9-hexadecenoicacid)C16∶10.06315.90315-甲基十六烷酸(methylisoheptadecanoate)C17∶00.05417.209亞油酸(9,12-octadecadienoicacid)C18∶238.69517.352油酸(9-octadecenoicacid)C18∶147.04617.833硬脂酸(octadecanoicacid)C18∶01.62719.957亞麻酸(9,12,15-Octadecatrienoicacid)C18∶31.15820.45711,14-二十碳二烯酸(11,14-Eicosadienoicacid)C20∶20.11920.6687,10,13-二十碳三烯酸(eicosatrienoicacid)C20∶30.291021.01311-二十烯酸(11-eicosenoicacid)C20∶10.841121.483花生酸(eicosanoicacidr)C20∶04.21223.198二十一碳烷酸(heneicosanoicacid)C21∶00.161324.868山崳酸(docosanoicacid)C22∶00.281428.011二十四烷酸(tetracosanoicacid)C24∶00.08

2.4櫻桃籽揮發(fā)油的化學(xué)成分

圖3　細(xì)齒櫻桃籽揮發(fā)油總離子流色譜圖Fig.3　TIC of serration cherry seed volatile oil

超臨界CO2萃取工藝所得細(xì)齒櫻桃籽揮發(fā)油經(jīng)GCMS-AMDIS分析后所得TIC圖見圖3，共鑒定出匹配因子大于750的化合物17種(見表3)，其主要成分為β-谷甾醇、扁桃酰胺等，其中含量最高的β-谷甾醇被證明具有抗炎[9]、解熱、降血脂[10]和抗腫瘤[11]等多種藥理學(xué)活性，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的用途。而最新的研究也表明櫻桃籽揮發(fā)油對(duì)大、小鼠急性炎癥模型都具有顯著的抑炎癥作用[12]。因此本研究的結(jié)果也闡明了櫻桃籽揮發(fā)油中的抗炎癥活性物質(zhì)很可能就是其中高含量的β-谷甾醇。由于β-谷甾醇的含量高達(dá)60.3%，使得細(xì)齒櫻桃籽揮發(fā)油可以作為β-谷甾醇的生產(chǎn)原料而具有重要的商業(yè)價(jià)值。

表3　細(xì)齒櫻桃籽揮發(fā)油成分

3結(jié)論

細(xì)齒櫻桃籽中粗脂肪含量為(8.9±0.2)%，揮發(fā)油含量為(0.56±0.15) %。當(dāng)采用超臨界CO2萃取時(shí)，可同時(shí)提取到櫻桃籽油及揮發(fā)油。細(xì)齒櫻桃籽油中油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸含量達(dá)88.18%，屬于高油酸亞油酸型油脂，具有較高的抗氧化活性。細(xì)齒櫻桃籽揮發(fā)油中β-谷甾醇含量達(dá)60.3%，研究已證明β-谷甾醇具有抗炎癥活性[9]，且最新的研究也證明櫻桃籽揮發(fā)油對(duì)大、小鼠急性炎癥模型都具有顯著的抑炎癥作用[12]。說明細(xì)齒櫻桃籽揮發(fā)油可能具有抗炎癥活性。因此本研究的結(jié)果不僅提示了細(xì)齒櫻桃籽在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域均具有較好的開發(fā)前景，也為細(xì)齒櫻桃的進(jìn)一步精深加工利用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會(huì). 中國植物志，第38卷[M].北京：科學(xué)出版社, 1986：79.

[2]LARRAURI J A, SNCHEZ-MORENO C, SAURA-CALIXTO F. Effect of temperature on the free radical scavenging capacity of extracts from red and white grape pomace peels[J]. J Agric：Food Chem, 1998, 46(7): 2 694-2 697.

[3]陳計(jì)巒, 宋麗軍, 張?jiān)? 等. 薰衣草精油抗氧化成分提取及其對(duì)DPPH·清除率的研究 [J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2009, 35(1): 173-176.

[4]王堅(jiān), 陳鴻平, 劉友平, 等. 應(yīng)用自動(dòng)質(zhì)譜退卷積定性系統(tǒng)拆分中藥揮發(fā)油總離子流譜圖中的重疊峰——以青皮為例 [J]. 中國中藥雜志, 2013, 38(10)：1 564-1 569.

[5]耿薇, 鄭敏燕, 尚永輝, 等. 櫻桃仁的脂肪酸組成與含量分析 [J]. 化學(xué)工程師, 2015, 29(3): 18-20.

[6]王春玲. 煙臺(tái)大櫻桃仁油理化性質(zhì)及脂肪酸組成分析 [J]. 中國糧油學(xué)報(bào), 2015, 30(2): 65-67.

[7]張玲麗, 盧奎. 櫻桃仁油的理化性質(zhì)及成分分析 [J]. 中國油脂, 2009, 34(9): 74-76.

[8]HARRIS W S, MOZAFFARIAN D, RIMM E, et al. Omega-6 fatty acids and risk for cardiovascular disease[J]. Circulation, 2009, 119(6): 902-907.

[9]LOIZOU S, LEKAKIS I, CHROUSOS G P, et al. β-Sitosterol exhibits anti-inflammatory activity in human aortic endothelial cells [J]. Molecular Nutrition & Food Research, 2010, 54(4): 551-558.

[10]BASKAR A A, AL NUMAIR K S, GABRIEL P M, et al. β-sitosterol prevents lipid peroxidation and improves antioxidant status and histoarchitecture in rats with 1, 2-dimethylhydrazine-induced colon cancer [J]. Journal of Medicinal food, 2012, 15(4): 335-343.

[11]TALATI R, SOBIERAJ D M, MAKANJI S S,et al. The comparative efficacy of plant sterols and stanols on serum lipids: a systematic review and meta-analysis [J]. Journal of the American Dietetic Association, 2010, 110(5): 719-726.

[12]王松, 張成義, 陳曦. 櫻桃核揮發(fā)油的抗炎作用研究 [J]. 新中醫(yī), 2012, 32(10): 139-140.

Antioxidant activity analysis and composition analysis of seed oil and volatile oil extracted by supercritical CO2from serration cherry

YANG Xiao1*, LUO Jing1, ZHANG Guang-feng1, QIN Jia2

1 (Food and Bioengineering School， Xihua University, Chengdu 610039, China)2 (Xiaojin Jiajin Mountain Natural Wild Cherry Wine Co., Ltd., Xiaojin 624200, China)

ABSTRACTSeed oil and volatile oil from serration cherry have been extracted by supercritical CO2, their antioxidant activities and chemical composition were analyzed. The results show that seed oil had a high antioxidant activity, composed of 14 fatty acids, 88.48% of which was the unsaturated fatty acid. The main components of seed oil were oleic acid (47.09%) and linoleic acid (38.69%). The GC/MS/AMDIS analysis demonstrated that 17 kinds of major substance in volatile oil, 60.3 % of which was β-sitosterol, whith has a variety of pharmacological activities.

Key wordsserration cherry seed oil; volatile oil; antioxidant; component analysis

收稿日期：2015-08-08，改回日期：2015-10-09

基金項(xiàng)目：阿壩州野櫻桃全產(chǎn)業(yè)鏈現(xiàn)代生產(chǎn)技術(shù)集成與產(chǎn)業(yè)化示范(四川省科技廳科技支撐項(xiàng)目，編號(hào)：2015NZ0075)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603037

第一作者：博士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師(本文通訊作者，E-mail：yangxiao19810625@163.com)。