周權(quán)明，楊小朋，錢(qián)章林，徐廣建，王繼超， 陳剛

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子832000；2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院；3蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院)

機(jī)械吹打法、胰酶消化法分離新生大鼠腦組織神經(jīng)干細(xì)胞效果觀察

周權(quán)明1，楊小朋2，錢(qián)章林2，徐廣建2，王繼超2， 陳剛3

(1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆石河子832000；2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院；3蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院)

目的 對(duì)比觀察機(jī)械吹打法、胰酶消化法分離培養(yǎng)新生大鼠腦組織神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)的效果。方法 取出生3天的新生SD大鼠大腦皮質(zhì)，分別用機(jī)械吹打法、胰酶消化法分離培養(yǎng)(分別記為機(jī)械吹打組和胰酶消化組)，通過(guò)免疫熒光法對(duì)NSCs進(jìn)行鑒定和誘導(dǎo)分化；分別于培養(yǎng)第2、5、7天計(jì)數(shù)細(xì)胞球直徑及數(shù)目；通過(guò)MTT法檢測(cè)兩組原代及第3亞代細(xì)胞的克隆增殖能力；選取第3亞代細(xì)胞進(jìn)行凍存、復(fù)蘇，計(jì)算細(xì)胞復(fù)蘇后的存活率。結(jié)果 兩組均可從新生SD大鼠大腦皮質(zhì)分離得到NSCs，并均可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。培養(yǎng)5、7天時(shí)，機(jī)械吹打組獲得的細(xì)胞球數(shù)量和直徑均高于相同培養(yǎng)時(shí)間的胰酶消化組(P均<0.05)。機(jī)械吹打組原代細(xì)胞培養(yǎng)2、5、7天細(xì)胞克隆增殖能力均高于相同培養(yǎng)時(shí)間的胰酶消化組(P均<0.05)，第3亞代細(xì)胞培養(yǎng)2、5 天細(xì)胞克隆增殖能力均優(yōu)于相同培養(yǎng)時(shí)間的胰酶消化組(P均<0.05)。兩組第3亞代細(xì)胞凍存、復(fù)蘇后存活率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 機(jī)械吹打法、胰酶消化法均可成功分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化新生大鼠NSCs，機(jī)械吹打法分離培養(yǎng)的NSCs克隆增殖能力高于胰酶消化法。

神經(jīng)干細(xì)胞分離；機(jī)械吹打法；胰酶消化法；大腦皮質(zhì)；大鼠

神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)具有多向分化潛能和自我更新能力，能夠分化為多種神經(jīng)細(xì)胞[1]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷、缺血及退行性病變的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。但目前NSCs的培養(yǎng)及凍存復(fù)蘇技術(shù)尚不完善。2014年12月～2015年10月，本研究采用機(jī)械吹打法和胰酶消化法從新生鼠腦實(shí)質(zhì)中分離培養(yǎng)原代NSCs，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 動(dòng)物：出生3天的清潔級(jí)SD大鼠25只，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SYXK(新)-2011-0004。主要試劑：基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM/F12(1∶1)，美國(guó)Gibco公司；青霉素-鏈霉素雙抗，Hyclone公司；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，英國(guó)PeproTech公司；抗巢蛋白抗體(Nestin)、神經(jīng)絲蛋白200抗體(NF-200)、神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗體(GFAP)、FITC、TRITC標(biāo)記羊抗兔IgG、MTT試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 NSCs體外培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察 取新生大鼠大腦皮質(zhì)，解剖顯微鏡下用顯微手術(shù)鑷去除軟腦膜和血管組織。用眼科剪將腦組織剪成約1 mm3的小塊并隨機(jī)分為機(jī)械吹打組及胰酶消化組。機(jī)械吹打組采用巴氏吸管輕微吹打，吹打后形成由大量單細(xì)胞和少量小細(xì)胞球組成的細(xì)胞懸液；胰酶消化組采用0.125%胰蛋白酶(含0.01% EDTA)消化組織10 min，以FBS終止消化，得到細(xì)胞懸液。用200目不銹鋼濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸液，4 ℃、800 r/min離心5 min，棄上清。臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)活細(xì)胞，以1×106/mL密度分別接種細(xì)胞于25 mL培養(yǎng)瓶，37 ℃、5% CO2、飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。培養(yǎng)基成分均為DMEM/F12(1∶1)、2% B27、20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF。每2天半量換液1次。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，隨機(jī)選取10個(gè)高倍視野，記數(shù)神經(jīng)球的個(gè)數(shù)、直徑及細(xì)胞分化情況。

1.3 NSCs鑒定及誘導(dǎo)分化 將兩組原代細(xì)胞分別培養(yǎng)7天，收集形成的細(xì)胞球，按照1×106/mL密度進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取傳3代后形成的神經(jīng)球，一部分接種于多聚賴(lài)氨酸包被的24孔板，于DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，行Nestin多克隆抗體免疫熒光染色；另一部分接種于含10% FBS培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天，行NF-200、GFAP多克隆抗體免疫熒光染色。倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照。

1.4 NSCs的克隆增殖能力觀察 分別取上述兩種方法獲得的原代NSCs、傳代后的第3亞代NSCs懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，各吸取100 μL懸液至96孔板，分別于培養(yǎng)第2、5、7天計(jì)數(shù)接種原代NSCs的培養(yǎng)孔中細(xì)胞球數(shù)量及直徑；通過(guò)MTT法檢測(cè)兩組原代及第3亞代NSCs的克隆增殖能力，方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處各孔吸光光度值(OD值)。

1.5 NSCs凍存、復(fù)蘇及存活率檢測(cè) 選取兩組第3亞代細(xì)胞進(jìn)行凍存、復(fù)蘇。凍存液由70% DMEM、20% BSA、10% DMSO組成。具體方法：取凍存后復(fù)蘇的細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)染色，在計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)四角大格內(nèi)的細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算細(xì)胞復(fù)蘇后的存活率。存活率=存活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1 NSCs形態(tài)學(xué)觀察 培養(yǎng)2天時(shí)，倒置顯微鏡下可見(jiàn)機(jī)械吹打組出現(xiàn)懸浮的小細(xì)胞團(tuán)，胰酶消化組基本處于單細(xì)胞狀態(tài)。培養(yǎng)3～5天時(shí)，機(jī)械吹打組細(xì)胞團(tuán)內(nèi)細(xì)胞增多，形成由幾十個(gè)到上百個(gè)圓球形細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞球，懸浮生長(zhǎng)；胰酶消化組也可見(jiàn)細(xì)胞球，但數(shù)量和大小不及機(jī)械吹打組。培養(yǎng)6～7天時(shí)，機(jī)械吹打組可見(jiàn)含數(shù)十至數(shù)百個(gè)細(xì)胞的集落懸浮于培養(yǎng)基中，形態(tài)較之前更規(guī)則，有部分細(xì)胞球死亡，失去周?chē)鈺?，中央?yún)^(qū)暗淡；胰酶消化組上述改變?nèi)跤跈C(jī)械吹打組。

2.2 NSCs的鑒定和誘導(dǎo)分化 兩組第3代細(xì)胞免疫熒光染色均可見(jiàn)紅色熒光，即Nestin染色均陽(yáng)性及NF-200、GFAP免疫熒光染色均呈陽(yáng)性。

2.3 NSCs的克隆增殖能力 見(jiàn)表1、2。

2.4 第3亞代細(xì)胞凍存、復(fù)蘇及存活率 兩組凍存的第3亞代NSCs凍存前與凍存復(fù)蘇后細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)速度及其他生物學(xué)特性無(wú)明顯差別， 細(xì)胞均懸浮生長(zhǎng)，培養(yǎng)2～4天均形成干細(xì)胞球，Nestin免疫熒光染色均呈陽(yáng)性。機(jī)械吹打組和胰酶消化組細(xì)胞復(fù)蘇后存活率分別為85%、89%，兩組比較P>0.05。

表1 兩組原代NSCs不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞球直徑和數(shù)量比較±s)

注：與胰酶消化組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05。

表2 兩組原代及第3亞代NSCs不同培養(yǎng)時(shí)間克隆增殖能力比較(OD值，±s)

注：與胰酶消化組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05。

3 討論

NSCs具有廣泛的臨床應(yīng)用前景，有望用于治療多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。但是，由于控制NSCs增殖和分化的因素還不明確[2，3]，尤其是NSCs移植到受損中樞神經(jīng)區(qū)域如何向特定神經(jīng)細(xì)胞分化的機(jī)制還未取得突破性進(jìn)展[4]。因此，探索NSCs分離培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化的技術(shù)意義重大。

機(jī)械吹打法和胰酶消化法是分離培養(yǎng)NSCs的常用技術(shù)[5]，但不同實(shí)驗(yàn)室建立的培養(yǎng)體系不同，獲得的NSCs增殖、分化能力等也不同[6]。胰酶消化法可以增加單細(xì)胞數(shù)量，但胰酶消化作用的最佳時(shí)間點(diǎn)難以把握，分離消化過(guò)程中多次離心可導(dǎo)致原代NSCs損傷[7]，且在終止胰酶消化過(guò)程中加入的FBS易誘導(dǎo)原代NSCs分化。機(jī)械吹打法僅通過(guò)機(jī)械吹打獲得NSCs，避免了FBS對(duì)原代NSCs的影響。本研究?jī)煞N方法均可獲得NSCs，并可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。但是在原代培養(yǎng)第5天及第7天，機(jī)械吹打法較胰酶消化法獲得細(xì)胞球數(shù)量多、細(xì)胞球直徑大；原代細(xì)胞培養(yǎng)第2、5、7天機(jī)械吹打法獲得細(xì)胞克隆增殖能力明顯高于胰酶消化組，第3亞代細(xì)胞在培養(yǎng)第2、5天機(jī)械吹打組細(xì)胞克隆增殖能力優(yōu)于胰酶消化組。原因可能為機(jī)械吹打法獲得的細(xì)胞懸液中存在大量小細(xì)胞團(tuán)，可形成相對(duì)良好的微環(huán)境，NSCs通過(guò)自分泌或旁分泌產(chǎn)生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子可在該環(huán)境局部達(dá)到相對(duì)高濃度，促進(jìn)NSCs的生長(zhǎng)增殖；而胰蛋白酶消化破壞了影響細(xì)胞存活的細(xì)胞基質(zhì)、胞膜上的受體等，造成細(xì)胞化學(xué)損傷，反復(fù)的離心也增加細(xì)胞損傷的機(jī)會(huì)，形成的亞代克隆球的量較機(jī)械吹打法明顯減少[8～11]。

NSCs的體外培養(yǎng)過(guò)程復(fù)雜，必須注重NSCs的體外凍存與復(fù)蘇等環(huán)節(jié)[12]。本研究取第3亞代NSCs進(jìn)行凍存復(fù)蘇，結(jié)果顯示兩組凍存前與凍存復(fù)蘇后細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)速度及其他生物學(xué)特性無(wú)明顯差別，細(xì)胞均懸浮生長(zhǎng)，培養(yǎng)2～4天均形成干細(xì)胞球，Nestin免疫熒光染色均呈陽(yáng)性，凍存復(fù)蘇后細(xì)胞存活率分別為85%、89%，兩組無(wú)明顯差別，提示兩種方法獲得的NSCs體外凍存、復(fù)蘇穩(wěn)定。

總之，機(jī)械吹打法、胰酶消化法均可從新生鼠腦組織中成功分離培養(yǎng)NSCs，但機(jī)械吹打法分離培養(yǎng)的NSCs克隆增殖能力優(yōu)于胰酶消化法。

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Effects of mechanical isolation and pancreatin digestant isolation in separating neural stem cells from brain tissues of neonatal rats

ZHOUQuanming1,YANGXiaopeng,QIANZhanglin,XUGuangjian,WANGJichao,CHENGang

(1MedicalCollegeofShiheziUniversity,Shihezi832000,China)

Objective To compare the effects of mechanical isolation and pancreatin digestant isolation in separating neural stem cells (NSCs) from brain tissues of neonatal rats. Methods The cerebral cortex of newborn rats within 3 days were isolated and cultured by mechanical and pancreatin digestion, respectively. The NSCs were identified and differentiated by immunofluorescence assay. Diameter and number of cell spheres were detected on day 2, 5 and 7 of culture. The proliferation ability of the primary passage of NSCs and the third-passage NSCs in the two groups were compared by MTT. The third-passage NSCs were frozen and recovered and the survival rate of the cells was calculated. Results Both of these two methods could isolate NSCs from the cerebral cortex of neonatal rats, and those NSCs could be induced to differentiate into neurons and glial cells. On day 5 and 7, the NSCs′ ball number and diameter which came from the mechanical isolation group were higher than those of the pancreatin digestant group in the same culture time (allP<0.05). On day 2, 5 and 7, the prime NSCs which came from the mechanical isolation group had better clonal proliferation ability than those of the pancreatin digestant group in the same culture time (allP<0.05). On day 2 and 5, the third-passage NSCs of the mechanical isolation group had better clonal proliferation ability than those of the pancreatin digestant group in the same culture time (allP<0.05). The survival rates of the third-passage NSCs of the mechanical isolation group and pancreatin digestant group were respectively 85% and 89%, respectively; and there was no significant difference between these two groups (P>0.05). Conclusion Both mechanical isolation and pancreatin digestant isolation can successfully isolate NSCs. NSCs which come from the mechanical isolation group have better clonal proliferation ability than those of the pancreatin digestant group.

neural stem cells; mechanical isolation; pancreatin digestion; cerebral cortex; rats

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(8116055)。

周權(quán)明(1987-)，男，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)急性損傷。E-mail： 909073436@qq.com

楊小朋(1962-)，男，主任醫(yī)師，研究方向?yàn)橹袠猩窠?jīng)系統(tǒng)疾病。E-mail： 307240766@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.20.006

R338

A

1002-266X(2016)20-0018-03

2015-11-13)