許洪波 耿長安 張雪梅 馬云保 黃曉燕 陳紀(jì)軍

[摘要]對香附Cyperusrotundus化學(xué)成分進(jìn)行研究，采用多種色譜技術(shù)（硅膠、氧化鋁、Sephadex LH20、MCI gel CHP20P、HPLC等） 分離純化，根據(jù)波譜學(xué)數(shù)據(jù)（IR，MS，1D，2DNMR）進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。從香附中分離得到13個化合物，其中包括3個倍半萜，3個三萜，4個酰胺，1個木脂素及2個其他類化合物。它們的結(jié)構(gòu)被分別鑒定為香附酸（1），（4S，5E，10R）7oxotrinoreudesm5en4βol（2），4，7二甲基4羥基1四氫萘酮（3），蒲公英萜酮（4），達(dá)瑪二烯醇乙酸酯（5），澤屋萜（6），假蒟亭堿（7），幾內(nèi)亞胡椒酰胺（8），墻草堿（9），己內(nèi)酰胺（10），鵝掌楸苦素（11），3hydroxy1（4hydroxy3，5dimethoxyphenyl）2[4（3hydroxy1（E）propenyl）2，6dimethoxyphenoxy]propylβDglucopyranoside（12）和1（3，4methylenedioxyphenyl）1Etetradecene（13）。其中，化合物1為一個新的鏈狀倍半萜類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為6甲基2異丙烯基7，10二氧代十一酸，命名為香附酸；化合物2和3為2個降倍半萜類化合物?；衔?～13均為首次從該屬植物中分離得到，該研究豐富了香附的化學(xué)成分種類。

[關(guān)鍵詞]香附；香附酸；倍半萜；酰胺

香附Cyperi Rhizoma為莎草科植物莎草Cyperus rotundus L 的干燥根莖，始載于南北朝時期陶弘景的《名醫(yī)別錄》，為1963—2010年版的《中國藥典》所收載。中藥香附性平，味辛、微苦、甘，具有疏肝解郁，調(diào)經(jīng)止痛之功效[1]。國外學(xué)者在20世紀(jì)二三十年代即對香附的化學(xué)成分進(jìn)行了研究[24]，迄今，共從中分離鑒定了100多個化合物，主要包括萜類（單萜、倍半萜、三萜），黃酮，生物堿等[5]。現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗菌、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抑制乙酰膽堿酯酶、抗糖尿病及雌激素樣作用等活性[56]。本課題組利用HepG 2215細(xì)胞模型對香附進(jìn)行了體外抗HBV活性研究，發(fā)現(xiàn)香附的90%和50%乙醇提取部位具有較強(qiáng)的抑制HBV DNA復(fù)制活性，為了闡明其活性物質(zhì)，我們前期從其活性部位分離得到37個倍半萜類成分，特別是9個桉烷型倍半萜對HBV DNA的復(fù)制具有較好的抑制作用[7]。

為豐富香附的化學(xué)成分，本研究進(jìn)一步對香附的乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，從中分離鑒定了13個化合物，其中化合物1為一個新的鏈狀倍半萜，其余已知化合物（2～13）均為首次從莎草屬中分離得到。

1材料

高分辨質(zhì)譜用ITTOFLCMS（Shimadzu，Kyoto，Japan） 質(zhì)譜儀測定，熔點通過SGWX4B顯微熔點儀（上海精密科學(xué)儀器有限公司）測定。核磁共振譜用Brucker AM400，DRX500或Brucker Avance III600型超導(dǎo)核磁共振儀（Bruker，Bremerhaven，Germany）測定，TMS（四甲基硅烷） 作內(nèi)標(biāo)；紅外光譜用BioRad FTS135型紅外光譜儀測定（BioRad，Hercules，California，USA）；旋光通過Jascomodel 1020旋光儀（Horiba，Tokyo，Japan） 測定；高效液相為Waters Aillance 2695（Waters，USA），色譜柱為YMCPack ODSA（20 mm×250 mm，10 μm），中壓液相（Dr FlashII） 為上海利穗產(chǎn)品。薄層色譜硅膠和柱色譜硅膠（200～300目） 分別購自青島海洋化工有限公司和青島美高集團(tuán)有限公司；MCI CHP20P gel柱色譜分離材料購自日本三菱化學(xué)公司；Sephadex LH20來自Pharmacia 公司。分析純甲醇購自江蘇漢邦科技有限公司；顯色劑為H2SO4（10%） 的乙醇溶液；所用其他試劑均為化學(xué)純或分析純。

香附于2011年4月購自云南省昆明市菊花村藥材市場，經(jīng)中國科學(xué)院昆明植物研究所雷立公副研究員鑒定為香附Cyperi Rhizoma，標(biāo)本存放于中國科學(xué)院昆明植物研究所抗病毒與天然藥物化學(xué)研究組（No 2011041101）。

2提取與分離

香附（5 kg），粉碎后分別用90%和50%乙醇室溫下浸泡2次，每次浸泡72 h。合并各浸泡液，減壓濃縮至干；殘留物混懸于2 L水中，用等量乙酸乙酯萃取4次，回收乙酸乙酯萃取液得乙酸乙酯部分（305 g）。乙酸乙酯部分經(jīng)硅膠柱色譜（2 000 g，175 mm×35 cm），用丙酮石油醚（0∶100～100∶0）梯度洗脫，經(jīng)TLC檢查并合并相同流分后得到9個組分（Frs E1～E9）。

Fr E3（22 g） 經(jīng)硅膠柱色譜（400 g，8 cm×30 cm），乙酸乙酯石油醚（5∶95） 洗脫，得到2個組分（Fr E31和Fr E32）。Fr E31（34 g） 經(jīng)氧化鋁柱色譜（60 g，2 cm×50 cm），丙酮石油醚（3∶97）洗脫，得到2個組分（Fr E311和Fr E312）。Fr E311（23 g） 經(jīng)氧化鋁柱色譜（40 g，15 cm×40 cm），用甲醇氯仿（1∶99） 洗脫，得到化合物4（77 mg），5（45 mg）和13（10 mg）。Fr E312（800 mg） 經(jīng)Sephadex LH20柱色譜（50 g，14 cm× 150 cm），用甲醇氯仿（50∶50） 洗脫得到化合物6（10 mg）和8（5 mg）。Fr E32（176 g） 經(jīng)氧化鋁柱色譜分離（300 g，4 cm×28 cm），丙酮石油醚（5∶95）洗脫，得到2個流分（Fr E321和Fr E322）。E322（11 g） 經(jīng)硅膠柱色譜（150 g，25 cm× 50 cm），用乙酸乙酯石油醚（20∶80～100∶0） 洗脫后，再經(jīng)Sephadex LH20（50 g，14×150 cm） 純化得到化合物2（40 mg），3（18 mg），7（15 mg）和9（3 mg）。

FrE8（11 g） 經(jīng)中壓制備液相（MCI GEL CHP20P，75～150 μm，168 g，254 cm×50 cm），甲醇水（10∶90～100∶0） 梯度洗脫，得到5個組分（Frs E81～E85）。

Fr E81（36 g） 經(jīng)硅膠柱色譜（60 g，31 cm×50 cm）用水甲醇氯仿（25∶25∶75～3∶30∶70）洗脫，再經(jīng)HPLC（YMCC18，94 mm×250 mm，5μm） 純化，乙腈水（12∶88）洗脫，得到化合物1（9 mg）。Fr E82（2 g） 經(jīng)氧化鋁柱色譜（50 g，2 cm×50 cm），水甲醇乙酸乙酯（2∶25∶75） 洗脫，再經(jīng)Sephadex LH20（50 g，14 cm×150 cm，甲醇） 純化后得化合物10（7 mg）。Fr E83（21 g） 經(jīng)硅膠柱色譜（50 g，25 cm×40 cm），水甲醇氯仿（25∶25∶75～3∶30∶70） 洗脫后再經(jīng)HPLC制備（YMCPack ODSA，10 μm，20 mm×250 mm，35 mL·min-1），甲醇水（25∶75）為流動相，得化合物11（7 mg）和化合物12（4 mg）。

3結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1油狀物。HRESIMS顯示準(zhǔn)分子離子峰m/z 267159 7[M-H]-（計算值267160 2），可推測其分子式為C15H24O4，不飽和度為4。紅外光譜（KBr） 顯示其結(jié)構(gòu)中含有羥基（3 441 cm-1），羰基（1 711 cm-1） 和雙鍵（1 633 cm-1） 等基團(tuán)。1HNMR中：δH219（3H，s），165（3H，s） 和108（3H，d，J=68 Hz）提示結(jié)構(gòu)中有3個甲基；13CNMR（DEPT） 譜顯示15個碳信號，包括4個季碳，2個次甲基，6個亞甲基，3個甲基見表1。13CNMR譜中的δC（2130，2074），提示結(jié)構(gòu)中有2個羰基；δC1778（s） 提示結(jié)構(gòu)中具有1個羧基。此外，13CNMR中δC 1453（s），1127（t） 和185（q） 提示結(jié)構(gòu)中有1個異丙烯基。1H1H COSY 中δH269（2H，t，J=65 Hz，H8） / 267（2H，t，J=65 Hz，H9）的相關(guān)表明結(jié)構(gòu)中具有片段A（圖 1）；δH 254（1H，t，J=67 Hz，H2） / 239（2H，dt，J=67，62 Hz，H3） / 158（1H，m，H4a）/135（1H，m，H5b） / 254（1H，m，H6） / 108（3H，d，J=68 Hz，H15） 存在相關(guān)，提示結(jié)構(gòu)中具有1個片段B，見圖1。在HMBC譜中，見圖1，δH 108（3H，d，J=68 Hz，H15） 與δC 2130（s，C7） 的相關(guān)，以及δH 269（2H，t，J=65 Hz，H8） 與δC 2074（s，C10） 的相關(guān)可以推測2個羰基分別處于C7和C10位；δH 165（3H，s，H14） 與δC 433（d，C2） 及δC 1127（t，C13） 存在相關(guān)，δH 239（2H，dt，J=67，62 Hz，H3） 與δC1453（s，C12） 存在相關(guān)，可以推測異丙烯基連接在C2位。至此，化合物1的平面結(jié)構(gòu)可以確定為：6甲基2異丙烯基7，10二氧代十一酸，命名為香附酸見圖1。遺憾的是現(xiàn)有數(shù)據(jù)無法確定C2和C6的構(gòu)型；因此，該化合物的立體構(gòu)型問題仍有待解決。該化合物是1個新的鏈狀倍半萜類化合物，且不符合異戊二烯規(guī)則，作者推測其結(jié)構(gòu)可能源自anthoplaone型倍半萜[8]，見圖1。Anthoplaone型倍半萜最早于1990年被日本學(xué)者從太平洋側(cè)花?？ˋnthopleura pacifica Uchida） 中發(fā)現(xiàn)，該類化合物亦不服從異戊二烯規(guī)則，且結(jié)構(gòu)中有1個三元環(huán)。日本學(xué)者推測該類化合物是由lepidozene型倍半萜經(jīng)過開環(huán)、氧化后所形成[8]。本文報道的化合物1可能由anthoplaone型倍半萜的三元環(huán)開環(huán)、氧化而來，這也是首次從高等植物中發(fā)現(xiàn)該類型倍半萜類化合物。

化合物1油狀物。[α]24D-125（c 01，MeOH）；IR（KBr）νmax：3 441，1 711，1 633 cm-1。HRESIMS m/z 267159 7（計算值267160 2）[M-H]-。1H和13CNMR數(shù)據(jù)見表1。

其余化合物（2～13）的結(jié)構(gòu)均通過與文獻(xiàn)報道的波譜數(shù)據(jù)比較，分別鑒定為：（4S，5E，10R）7oxotrinoreudesm5en4βol（2）[9]，4hydroxy4，7dimethyl1tetralone（3）[10]，蒲公英萜酮（taraxerone，4） [11]，達(dá)瑪二烯醇乙酸酯（dammaradienyl acetate，5）[12]，澤屋萜（zeorin，6）[13]，假蒟亭堿（sarmentine，7）[14]，幾內(nèi)亞胡椒酰胺（guineensine，8）[15]，墻草堿（pellitorin，9）[16]，己內(nèi)酰胺（caprolactam，10）[17]，鵝掌楸苦素（liriodendrin，11）[18]，3hydroxy1（4hydroxy3，5dimethoxyphenyl）2[4（3hydroxy1（E）propenyl）2，dimethoxyphenoxy]propylβDglucopyranoside（12）[19]，1（3，4methylenedioxyphenyl）1Etetradecene（13）[14]。

[參考文獻(xiàn)]

[1]中國藥典. 一部 [S]. 2010：241.

[2]Rao B S， Panicker P B， Sudborough J J. Essential oil of Cyperus rotundus[J]. J Indian Inst Sci， 1925， 8A：39.

[3]Hegde B J， Rao B S. Essential oil from the rhizomes of Cyperus rotundus， Linn[J]. J Soc Chem Ind（London）， 1935， 54：387.

[4]Bradfield A E， Hedge B H， Rao B S， et al. Alphacyperone， a sesquiterpene ketone from the oil of Cyperus rotundus[J]. J Chem Soc， doi：101039/JR9360000667.

[5]徐燕， 李大祥， 凌鐵軍， 等. 香附化學(xué)成分研究進(jìn)展[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志， 2010， 16（11）：214.

[6]黃險峰， 彭國平. 香附的化學(xué)成分及藥理研究進(jìn)展[J]. 中藥材，2003，26（1）：65.

[7]Xu H B， Ma Y B， Huang X Y， et al. Bioactivityguided isolation of antihepatitis B virus active sesquiterpenoids from the traditional Chinese medicine：rhizomes of Cyperus rotundus[J]. J Ethnopharmacol， 2015， 171：131.

[8]GuoChi Z， Hatano M， Ishitsuka M O， et al. Novel secoand seconorsesquiterpenes having a cyclopropane ring from the okinawan actinia Anthopleura pacificaUchida[J]. Tetrahedron Lett， 1990， 31（18）：2617.

[9]Cheng S Y， Wang S， Wen Z H， et al. Three new eudesmanoids from the Formosan soft coral Nephthea erecta[J]. J Asian Nat Prod Res， 2009， 11（11）：967.

[10]Mulholland D A， Mcfarland K， Randrianarivelojosia M. Sesquiterpenoid derivatives from Cipadessa boiviniana （Meliaceae）[J]. Biochem Syst Ecol， 2006， 34（4）：365.

[11]周忠玉， 王立松， 王飛， 等. 綠槽枝衣的化學(xué)成分[J]. 云南植物研究， 2007， 29（5）：586.

[12]Grande M， Torres P， Piera F， et al. Triterpenoids from Dittrichia viscosa[J]. Phytochemistry， 1992， 31（5）：1826.

[13]Feng J， Yang X W， Su S D， et al. Studies on chemical constituents from herbs of Usnea longissima[J]. China J Chin Mate Med， 2009， 34（6）：708.

[14]Likhitwitayawuid K， Ruangrungsi N， Lange G L， et al. Structural elucidation and synthesis of new components isolated from Piper sarmentosum（Piperaceae）[J]. Tetrahedron， 1987， 43（16）：3689.

[15]Lee S A， Hwang J S， Han X H， et al. Methylpiperate derivatives from Piper longum and their inhibition of monoamine oxidase[J]. Arch Pharmacal Res， 2008， 31（6）：679.

[16]LeitoCunha E V， OliveiraChaves M C. Two amides from Piper tuberculatum fruits[J]. Fitoterapia， 2001， 72（2）：197.

[17]劉麗娟， 周小平， 王廣樹， 等. 分蘗蔥頭中含氮化合物的分離與鑒定[J]. 中國藥物化學(xué)雜志， 2009， 19（5）：368.

[18]華會明， 李銑， 邢素娥， 等. 柳穿魚化學(xué)成分的研究[J]. 中國藥學(xué)雜志， 2005， 40（9）：653.

[19]Takara K， Matsui D， Wada K， et al. New antioxidative phenolic glycosides isolated from Kokuto noncentrifuged cane sugar[J]. Biosci Biotechnol Biochem， 2002， 66（1）：29.

[責(zé)任編輯丁廣治]