何春年 畢武 申潔 彭勇 肖培根

[摘要]常用中藥牡丹和芍藥種子中含有茋類成分，具有多種藥理活性，為了開發(fā)和利用牡丹種子資源，該文選擇種子中含量相對(duì)較高的10種茋類成分suffruticosol A， suffruticosol B， suffruticosol C，transresveratrol，cisεviniferin，transεviniferin，cissuffruticosol D，cisgnetin H，transsuffruticosol D和transgnetin H為指標(biāo)進(jìn)行含量測(cè)定。采用HPLCDAD，YMCpack ODSA色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相以甲醇水梯度洗脫，流速為10 mL·min-1；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm。同時(shí)采用清除DPPH自由基的方法初步評(píng)價(jià)其抗氧化作用。結(jié)果表明：所建立的方法能夠同時(shí)測(cè)定10種茋類成分的含量；牡丹和芍藥種子中的茋類成分主要集中于種皮部位（總質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)167%以上），種仁中含量很低（總質(zhì)量分?jǐn)?shù)不到03%），種皮提取物富含茋類成分，總含量達(dá)75%以上。種皮提取物及10種茋類成分多具有較好的抗氧化潛力。該文對(duì)牡丹和芍藥資源的綜合利用，特別是種皮資源的有效開發(fā)和利用奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]牡丹；芍藥；種皮；茋類；白藜蘆醇

牡丹Paeonia suffruticosa sl和芍藥P lactiflora Pall為毛茛科芍藥屬植物，傳統(tǒng)上作為觀賞和藥用，牡丹根皮作為“牡丹皮”，芍藥根作為“白芍”或“赤芍”藥用已有2 000多年歷史，是臨床常用中藥材。近年來，發(fā)現(xiàn)牡丹種子中富含多不飽和脂肪酸[1]，2011年原國(guó)家衛(wèi)生部批準(zhǔn)牡丹籽油作為新資源食品，隨后被列為國(guó)家食用油料振興產(chǎn)業(yè)之一。目前，全國(guó)油用牡丹種植面積已擴(kuò)大到近100萬畝（1 hm2=15畝）。因此，牡丹植物資源的可持續(xù)綜合利用具有廣闊的開發(fā)前景。

牡丹種子中除不飽和脂肪酸外，還含有茋類、單萜苷類、黃酮類和有機(jī)酸類等多種成分[23]，其中茋類成分主要為白藜蘆醇及其二聚和三聚體[45]。研究表明，牡丹種子中的白藜蘆醇低聚物具有多種生物活性，包括抗腫瘤[6]、抗炎[78]、抗過敏[9]和神經(jīng)氨酸酶抑制等作用[10]。已有研究表明，牡丹和芍藥種子中部分茋類化合物具有較好的抗氧化活性[11]，但采用清除DPPH自由基的方法，以及作者曾分離得到的3個(gè)新化合物cissuffruticosol D（7），cisgnetin H（8），transsuffruticosol D（9）及牡丹和芍藥種皮提取物尚沒有得到評(píng)價(jià)。因此，本文對(duì)牡丹和芍藥種子中主要的10種茋類成分和種皮提取物的抗氧化能力進(jìn)一步比較，為牡丹和芍藥種子的合理利用積累科學(xué)數(shù)據(jù)。

牡丹種子分為種皮和種仁2個(gè)部位，種仁用于榨取牡丹籽油，牡丹種皮（種殼）是牡丹籽榨油前脫去的副產(chǎn)品，其質(zhì)量占整個(gè)種子質(zhì)量的約1/3，未能得到有效利用。作者前期研究發(fā)現(xiàn)牡丹及其同屬植物種子中普遍含有茋類成分，但對(duì)該類成分在種子中的分布特點(diǎn)沒有明確。為了指導(dǎo)牡丹種子的合理利用，本文結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，把種子分為種皮和種仁2個(gè)部位，同時(shí)對(duì)種皮進(jìn)行提取，分別測(cè)定10種主要的茋類成分，為牡丹以及芍藥種子資源的綜合利用奠定基礎(chǔ)。

1材料

Agilent 1200高效液相色譜儀（G1322A型在線脫氣機(jī)、G13llA型液相泵、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1315B型DAD檢測(cè)器、Agilent色譜工作站）；梅特勒托利多電子天平（AL204）；ULVAC薄膜真空泵（DTC21）；C9860A超聲波清洗器（上海杰恩普超聲設(shè)備有限公司）；Quant MQX200 微孔板掃描分光光度計(jì) （Biotek Instruments， Inc，美國(guó)）。

甲醇、乙腈為色譜純（FisherScieniific）；甲酸（CNW公司，德國(guó)）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)）；生育酚（江蘇碧云天生物科技公司提供），DPPH（Sigma公司，美國(guó)），其余試劑均為分析純。茋類對(duì)照品suffruticosol A （1）， suffruticosol B（2）， suffruticosol C（3），cisεviniferin（5）， transεviniferin（6）， cissuffruticosol D（7）， cisgnetin H （8）， transsuffruticosol D（9）和transgnetin H （10）均為本實(shí)驗(yàn)室從牡丹種子中分離得到，經(jīng)HPLC檢測(cè)，純度大于95%；對(duì)照品transresveratrol（4）（純度>99%，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司）。

牡丹種子和芍藥種子2014年收集于北京和山東菏澤，牡丹和芍藥種皮提取物為本實(shí)驗(yàn)室自制，制備方法為種皮加入適量乙醇多次冷浸提取，減壓回收乙醇，提取浸膏真空干燥即得。

2方法與結(jié)果

2110種茋類成分含量測(cè)定

211色譜條件和系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

YMCpack ODSA色譜柱（46 mm×250 mm， 5μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）和水（B），線性梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?～10 min， 35%～52%（A）；10～30 min，52%～60%（A）。流速為10 mL·min-1；柱溫25 ℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；進(jìn)樣體積為5 μL。10個(gè)對(duì)照品的液相色譜圖見圖1。

212對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取10種茋類對(duì)照品適量，即1（814 mg），2（1227 mg），3（248 mg），4（717 mg），5（617 mg），6（540 mg），7（717 mg），8（774 mg），9（750 mg）和10（774 mg），用5 mL甲醇溶解并定容至刻度，作為儲(chǔ)備液。使用時(shí)分別吸取01 mL的單個(gè)對(duì)照品儲(chǔ)備溶液至1 mL量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。

213供試品溶液制備

分別精密稱取牡丹種皮提取物約010 g；牡丹和芍藥種皮約025 g；芍藥和牡丹種仁約050 g。

加入約100 mL甲醇，超聲提取30 min，用甲醇定容，045 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

214方法學(xué)考察

2141線性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限參照作者前期發(fā)表的文章[12]所建立的方法進(jìn)行。分別精密吸取上述混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加流動(dòng)相稀釋成6個(gè)不同濃度的混合對(duì)照品溶液。分別按上述色譜條件進(jìn)行HPLCDAD分析，每個(gè)濃度進(jìn)樣3次，記錄10個(gè)對(duì)照品色譜峰的峰面積Y，分別以各對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)X，以各峰面積3次進(jìn)樣的平均值為縱坐標(biāo)Y進(jìn)行線性回歸，得到各對(duì)照品的線性回歸方程。將混合對(duì)照品溶液多次稀釋，分別進(jìn)行HPLCDAD分析，得到各對(duì)照品的最小檢測(cè)限（LOD，S/N=3）和最小定量限（LOQ，S/N=10）， 見表1。

2142精密度試驗(yàn)10個(gè)對(duì)照品的精密度試驗(yàn)方法為采用3種不同濃度（高、中、低）分別測(cè)定日內(nèi)精密度和日間精密度。日內(nèi)精密度是連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定10個(gè)對(duì)照品色譜峰的保留時(shí)間和峰面積，并計(jì)算其RSD，分別在009%～025%和038%～35%；日間精密度為每隔12 h進(jìn)樣，連續(xù)3d內(nèi)共進(jìn)6次，測(cè)定10個(gè)對(duì)照色譜峰的保留時(shí)間和峰面積，并計(jì)算其RSD，分別在011%～091%和034%～37%。表明儀器精密度良好。

2143穩(wěn)定性試驗(yàn)同一份牡丹種皮樣品在25℃下避光保存，分別在0，6，12，18，24，48 h測(cè)定，以峰面積的平均標(biāo)準(zhǔn)偏差為指標(biāo)評(píng)價(jià)樣品的穩(wěn)定性，結(jié)果表明樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定（RSD<19%）。

2144重復(fù)性試驗(yàn)取同一份牡丹種皮樣品6份，按供試品溶液制備方法制備，按上述色譜條件測(cè)定，各對(duì)照品色譜峰的峰面積對(duì)應(yīng)的濃度的RSD小于22%，結(jié)果表明此方法的重復(fù)性良好。

2145加樣回收率試驗(yàn)用加樣回收率測(cè)定方法的準(zhǔn)確度，即向已知含量的樣品（牡丹種皮）中加入3種濃度（高、中、低）混合對(duì)照品溶液，按供試品溶液制備方法和樣品一起提取和分析，每個(gè)濃度重復(fù)3次，按上述色譜條件測(cè)定。各對(duì)照品成分的回收率在9665～1029% （RSD<31%）。結(jié)果見表2。

215樣品測(cè)定

將樣品按上述高效液相條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。

測(cè)定結(jié)果表明牡丹和芍藥種子中的茋類成分組成和含量上相似，均主要集中于種皮部位（總量高于167%），種仁中含量很低（總量不到03%），種皮提取物富含茋類成分，總量達(dá)75%以上。10中茋類成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)順序?yàn)閠ransgnetin H （10）>suffruticosol B（2）> transεviniferin（6）>transsuffruticosol D（9）≈suffruticosol A（1）>suffruticosol C （3）>transresveratrol （4）≈cisεviniferin （5）≈cisgnetin H （8）>cissuffruticosol D（7）。另外，3對(duì)順反異構(gòu)化合物含量比較發(fā)現(xiàn)，反式結(jié)構(gòu)含量明顯高于順式結(jié)構(gòu)，如化合物10>8；9>7；6>5。

22種皮提取物及10種茋類成分抗氧化能力的測(cè)定

牡丹及芍藥種皮提取物及10種茋類化合物抗氧化能力采用清除DPPH自由基的方法，參照相關(guān)文獻(xiàn)[13]，即吸取稀釋不同濃度的樣品溶液各7 μL，分別添加到新鮮配置的193 μL的02 mmol·L-1濃度的DPPH溶液中，混勻，避光反應(yīng)30 min，同時(shí)以生育酚（Trolox）作為對(duì)照，乙醇為空白對(duì)照，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。按照以下公式計(jì)算DPPH自由基清除率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，求得清除率的平均值。以IC50（清除率大達(dá)50%時(shí)所需的濃度）作為抗氧化能力的強(qiáng)弱。

DPPH自由基清除率=（A0-A1）·A0-1×100/%

式中A1為測(cè)試樣品吸收度；A0為空白對(duì)照的吸收度。

測(cè)定結(jié)果表明，牡丹種皮提取物（MD）和芍藥種皮提取物（SY）及10種茋類化合物均具有一定的清除DPPH自由基活性，2種種皮提取物的IC50值分別為4910，5031 mg·L-1，無顯著性差異；10種茋類化合物中suffruticosol B（2）和transresveratrol（4）的IC50值較低，分別為634，460 μmol·L-1，與生育酚相當(dāng)（IC50 490 μmol·L-1），具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基能力；化合物suffruticosol A的IC50最高，活性較弱，而其他7個(gè)茋類化合物活性一般。另外，結(jié)果也表明實(shí)驗(yàn)中的白藜蘆醇及其低聚物隨聚合度增加清除DPPH自由基能力無明顯構(gòu)效關(guān)系， 見圖3。

1suffruticosol A； 2suffruticosol B； 3 suffruticosol C ； 4 transresveratrol ； 5 cisεviniferin ； 6 transεviniferin ； 7 cissuffruticosol D； 8 cisgnetin H； 9 transsuffruticosol D； 10 transgnetin H； MD 牡丹種皮提取物； SY 芍藥種皮提取物； Trolox 生育酚。

圖3牡丹和芍藥種皮提取物及10種茋類化合物清除DPPH自由基能力

Fig3The removal ability of DPPH free radicals of peony seed coat extract and its ten stilbenes

3分析與討論

天然茋類化合物（stilbenoids）是一類以1， 2二苯乙烯為骨架結(jié)構(gòu)的天然多酚類化合物，代表性的為白藜蘆醇和 combretastatin A4，前者潛在的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值已被廣泛認(rèn)可，后者具有強(qiáng)的抑制微觀蛋白多聚化已被修飾為磷酸化鹽衍生物CA4P，目前作為甲狀腺未分化癌治療藥物已處于臨床Ⅲ期。

天然白藜蘆醇低聚物是白藜蘆醇在自然界通過低聚化和異構(gòu)化等方式修飾產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)類型多樣的一類數(shù)目最多的重要茋類化合物，除了作為天然的植物抗毒素外，具有多種藥理活性[14]，如抗病原微生物（細(xì)菌、真菌和病毒）、抗腫瘤、抗氧化、雌激素樣、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等。許多研究表明一些茋類低聚體的抗氧化、抗腫瘤和抗炎活性明顯強(qiáng)于其單體白藜蘆醇，作用機(jī)制也不盡相同。激勵(lì)國(guó)內(nèi)外學(xué)者從中發(fā)現(xiàn)選擇性高、毒副作用小的新型藥物候選物和藥物資源[1516]。然而由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜性使得缺乏有效的全合成方法[17]，同時(shí)該類化合物大多在自然界中含量低、難以分離和結(jié)構(gòu)鑒定，限制了對(duì)其系統(tǒng)研究和開發(fā)。因此尋找高含量、活性強(qiáng)的茋類低聚體的植物資源，并在此基礎(chǔ)上通過人工修飾、改善生物利用度和選擇性是當(dāng)前的主要手段。

本文研究表明，牡丹和芍藥種子中白藜蘆醇及其低聚物等茋類成分特征性地分布于種皮部位，含量達(dá)167%以上，明顯高于目前已知的其他天然植物。而牡丹和芍藥種仁僅含有少量的茋類成分，有利于對(duì)牡丹和芍藥種子的分類利用。牡丹和芍藥種皮中茋類成分經(jīng)提取后能得到有效富集，總茋類成分含量在提取物中可達(dá)75%以上，有利于種皮中活性茋類成分的開發(fā)利用。

牡丹（包括油用和藥用）植物人工栽培面積大，資源豐富，但在使用上其種殼作為廢棄物未能得到有效利用，而白藜蘆醇低聚物在種皮中含量高，這為將來開發(fā)利用提供了資源保障。另外，國(guó)內(nèi)外學(xué)者和作者研究表明，牡丹種子中的茋類化合物具有多種生物活性，特別是抗腫瘤活性較強(qiáng)，對(duì)肺癌和乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制濃度低，分別比白藜蘆醇強(qiáng)20和68倍，且無明顯毒性[6]，提示牡丹種皮中的茋類成分是重要的潛在藥物資源。

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[責(zé)任編輯丁廣治]