施伎蟬 蔣賢高 余志杰 寧洪葉 何貴清 吳正興 蔡玉偉 程愛瓊

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應用反向斑點雜交技術快速檢測結核分枝桿菌耐藥性

施伎蟬 蔣賢高 余志杰 寧洪葉 何貴清 吳正興 蔡玉偉 程愛瓊

全國第五次結核病流行病學抽樣調查資料顯示，我國15歲以上人群活動性、凃陽和菌陽肺結核的患病率分別為459/10萬、66/10萬和119/10萬，Mtb耐多藥率為6.8%[1]。近年來，流動人口的增加、診斷治療的延誤和抗結核藥物的濫用等原因導致耐藥菌株的增加，造成耐多藥結核病(MDR-TB)的流行[2]。多重耐藥Mtb的出現、臨床缺乏有效的耐藥菌株檢測手段和尚無新的抗結核藥物出現等原因，使患者錯過了最佳的治療時機，增加了耐藥菌株的傳染機會。因此，對Mtb的快速診斷及尋找有效的耐藥檢測方法成為了迫切的需求。

反向斑點雜交技術是一種可以簡單、快速檢測基因突變和基因缺失的技術手段。本研究應用反向斑點雜交技術檢測溫州地區(qū)Mtb臨床分離菌株及其對4種一線抗結核藥物耐藥相關的基因突變(利福平耐藥基因rpoB、異煙肼耐藥基因katG和inhA、鏈霉素耐藥基因rpsL、乙胺丁醇耐藥基因embB)，并與液體培養(yǎng)藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)結果進行對比，探討其在檢測Mtb及耐藥性方面的臨床應用價值。

材料和方法

一、患者來源

選取2013年11月至2014年10月在溫州市中心醫(yī)院感染科就診的93例門診和住院復治肺結核患者作為研究對象，其中男78例，女15例，平均年齡(48.0±12.5)歲。復治肺結核診斷標準參照文獻[3]，即：(1)初治失敗的患者；(2)規(guī)則用藥滿療程后痰菌復陽的患者；(3)不規(guī)則化療超過1個月；(4)慢性排菌患者。有上述情況之一者確診為復治肺結核。

收集上述患者的痰標本共計93份。留痰方法如下：(1)在留痰之前先用清水漱口數次，以清除口腔內的食物殘渣及部分雜菌。(2)留取的痰應是用力咳嗽后自氣管內咳出的痰，痰量不少于3 ml，然后盛于痰盒內送檢。不要將唾液或鼻涕吐入痰盒，以免影響查痰結果。(3)留痰標本要使用專用的痰盒，及時送到檢驗科檢查。(4)門診就診患者，留取即時痰(就診當時咳出的痰)2份，住院患者留取清晨痰(起床后深咳吐出的痰)2份。均分別送檢Mtb液體培養(yǎng)、藥敏試驗與反向斑點雜交法檢測。

二、試劑與儀器

Mtb耐藥突變基因檢測試劑盒購自深圳亞能生物技術有限公司；朗基L96+/Y型PCR儀/基因擴增儀，購自杭州朗基科學儀器有限公司；羅氏診斷real-time PCR擴增儀(型號LC-480I和Z480)、FYY-3型分子雜交儀均購自深圳亞能生物技術有限公司；可調移液器(2～10 μl、20～200 μl)購自德國艾本德公司；Fosun生物安全柜購自上海力申科學儀器有限公司；顯色液新鮮配制，用時按所需濃度加蒸餾水配制。

三、方法

1.細菌培養(yǎng)、菌種鑒定及藥敏試驗：所有痰標本按照《結核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》[4]進行BACTEC MGIT 960液體培養(yǎng)、菌種鑒定及藥敏試驗。

2.DNA提?。禾禈吮? ml加等量4% NaOH液化后，離心半徑8 cm，13 000 r/min離心5 min，混勻；離心半徑8 cm，10 000 r/min離心2 min，棄上清。向沉淀中加入50 ml細胞裂解液，打勻，沸水浴10 min，離心半徑8 cm，10 000 r/min離心2 min，留上清液進行PCR。

3.膜芯片設計：經GenBank數據庫檢索和比對分析，設計23條特異性探針，并點樣至尼龍膜上，制成膜芯片。

4.PCR擴增：取出PCR 反應管，在管壁上做好標記，離心半徑8 cm，50 000 r/min離心2 min，加入已提取的待測樣品 DNA 4 μl。同時取兩管PCR反應管分別加入陽性標本提取的DNA和陰性標本提取的DNA，作為產品使用過程的質量控制。反應體系如下：模板DNA 20 ng、2.5 mmol/L dNTP 2 μl，25 mmol/L MgCl21.5 μl，25 μmol/L上、下游引物各0.5 μl， DNA Taq酶2.5 U， 10×PCR緩沖液2.5 μl。使用ABI-7300儀器擴增，循環(huán)條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 45 s、68 ℃ 60 s，循環(huán)次數為30；95 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、68 ℃ 60 s，循環(huán)次數為30；68 ℃ 5 min。

5.反向斑點雜交技術：取檢測膜條置15 ml離心管中，加5 ml雜交緩沖液(1×檸檬酸鈉鹽、0.1%十二烷基硫酸鈉) 和PCR 產物, 沸水浴10 min，58 ℃雜交2 h。將膜條移至裝有預熱洗液(0.5×檸檬酸鈉鹽、0.1% 十二烷基鈉)的50 ml管中，于58 ℃輕搖洗滌15 min。用雜交緩沖液配制1∶2000的過氧化物酶溶液，室溫輕搖泡膜30 min，棄過氧化物酶液。用雜交緩沖液室溫輕搖洗膜2次，每次5 min。將膜條浸泡于新鮮配制的顯色液中(0. 1 mol/L檸檬酸鈉19 ml、2 mg/ml四甲基聯苯胺1 ml、3% H2O210 μl)，避光顯色5～10 min, 出現藍色斑點即為含有相應的待檢基因。

6.結果判讀：陽性質控品正常顯色而臨床樣本只有第CC位點顯色，表明被檢樣本為陰性(即無Mtb)或者樣本中待檢測的Mtb在本試劑盒最低檢出限以下。膜條探針排列順序見圖1。

結 果

一、耐藥情況

在93份送檢液體培養(yǎng)及藥敏試驗的痰標本中，44份液體培養(yǎng)Mtb 陽性，4份為非結核分枝桿菌，45份液體培養(yǎng)Mtb陰性。對44株Mtb菌株進行一線抗結核藥物藥敏試驗，RFP耐藥15株，INH耐藥15株，EMB耐藥7株，Sm耐藥12株。38.6%(17/44)的Mtb菌株為耐藥菌株，其中多重耐藥菌株占耐藥菌株的88.2%(15/17)(表1)。

二、反向斑點雜交技術檢測結果

表1 44株Mtb菌株中不同耐藥類型的統計

93份痰標本中，應用反向斑點雜交法共檢出Mtb基因陽性57份，陽性檢出率為61.3%(57/93)，其中野生型32份，突變型25份，耐藥基因突變菌株占陽性菌株的43.9%(25/57)。

N1●N2●N3●N4●N5●315N●?15N●CC●編號D516VD516GH526YH526DS531LS531W315M?15M 543N●88N●306N●43M88M306M1306M2306M3Mtb

N1●N2●N3●N4●N5315N●?15N●CC●編號D516VD516GH526YH526DS531L●S531W315M?15M 643N●88N●306N●43M88M306M1306M2306M3Mtb

N1●N2●N3●N4●N5●315N●?15NCC●編號D516VD516GH526YH526DS531LS531W315M?15M● 3843N●88N●306N●43M88M306M1306M2306M3Mtb

N1●N2●N3●N4●N5315N?15N●CC●編號D516VD516GH526YH526DS531L●S531W315M●?15M 443N●88N●306N●43M88M306M1306M2306M3Mtb

N1●N2●N3●N4●N5315N?15N●CC●編號D516VD516GH526YH526DS531L●S531W315M●?15M 5143N88N●306N●43M●88M306M1306M2306M3Mtb

N1●N2●N3●N4●N5315N●?15NCC●編號D516VD516GH526YH526DS531L●S531W315M?15M● 343N88N●306N43M●88M306M1●306M2306M3Mtb

注 (1)第一排N代表該位點為野生型，第二排是突變位點，其中后2個探針的M代表突變探針。第一 排N1到N5和第二排的前6個位點(D516V到S531W)是利福平耐藥相關基因rpoB檢測探針；其他的第315和-15位點分別是異煙肼的耐藥相關基因katG和inhA檢測探針。第三排43N、88N代表鏈霉素rpsL基因第43和88位密碼子位點為野生型，43M、88M代表鏈霉素rpsL基因相應位點發(fā)生突變。第三排306N代表乙胺丁醇embB基因第306位點為野生型，306M1 306M2、306M3代表乙胺丁醇embB基因位點發(fā)生不同類型的突變。(2)516代表相關基因(這里是rpoB)上第516個氨基酸，其他位點類同；在rpoB基因相關位點中，N1探針覆蓋的位點有511和513及附近區(qū)域位點，即若正常位點中只有N1位點不顯色，則表明有511、513或附近區(qū)域位點發(fā)生了突變，其他位點類同；以下是幾個正常探針覆蓋到的位點及附近區(qū)域(N1:511、513；N2:516；N3:522、523；N4:526、529；N5:531、533)；突變位點的氨基酸變化：D516V：D→V，代表天冬氨酸突變?yōu)槔i氨酸；其他氨基酸含義：H為組氨酸，Y為酪氨酸，L為亮氨酸，S為絲氨酸，T為蘇氨酸，N為天冬氨酸。(3)編號5膜條代表RHSE均“S”，編號6膜條代表RHSE分別為“R、S、S、S”，編號38膜條代表RHSE分別為“S、R、S、S”，編號4膜條代表RHSE分別為“R、R、S、S”，編號51膜條代表RHSE分別為“R、R、R、S”，編號3膜條代表RHSE分別為“R、R、R、R”；“R”代表耐藥，“S”代表敏感

圖1 反向斑點雜交技術檢測結核分枝桿菌耐藥基因的膜條顯色示例圖

25株耐藥基因突變的菌株中，rpoB基因突變占68.0%(17/25)，katG+inhA基因突變占80.0%(20/25)，rpsL基因突變占52.0%(13/25)，embB基因突變占12.0%(3/25)。不同突變類型各個突變基因位點的檢出情況見表2。

表2 不同突變基因在25株耐藥菌株中的檢出情況

三、反向斑點雜交法與藥敏試驗比較

以藥敏試驗結果為金標準，用反向斑點雜交法檢測44株痰培養(yǎng)陽性Mtb菌株對抗結核藥物RFP、INH、Sm、EMB耐藥基因突變的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值，具體見表3。

討 論

2011—2015年全國結核病防治規(guī)劃要求，以地市級為單位開展耐多藥肺結核診治工作的覆蓋率要達到50%，耐多藥肺結核可疑者篩查率達到60%[5]。因此，快速準確的耐藥性檢測對指導臨床用藥以提高結核病治療療效，防止耐藥Mtb的產生和傳播具有重要意義。Mtb耐藥基因芯片檢測系統是將高敏感度的PCR技術和高通量的反向斑點雜交技術相結合的基因檢測技術。其原理是應用生物素修飾的特異性引物擴增相關耐藥基因，將帶有生物素標記物的PCR產物變性后與標記在硝酸纖維素膜上的特異性探針雜交，經生物素或過氧化物酶系統顯色，通過膜條上探針雜交后是否顯色，來判斷是否發(fā)生耐藥基因突變。若突變位點顯色即發(fā)生耐藥基因突變，若野生位點顯色即未發(fā)生耐藥基因突變。

Mtb對利福平耐藥主要是由于rpoB基因編碼區(qū)發(fā)生了點突變、微缺失或微插入等。編碼的RNA 聚合酶β亞基構象發(fā)生變化，利福平與其親合力降低所致[6-7]。而rpoB基因是編碼β亞基的編碼基因，95%以上的耐利福平藥物耐藥菌都發(fā)生rpoB基因突變[8]，突變主要集中在第507～533氨基酸位點范圍內，其中80%突變與第531、526位點高度相關。異煙肼耐藥則與KatG基因突變及inhA基因突變密切相關[9-10]，這些突變基因都直接或間接地參與異煙肼中間活性體的形成。最常見的katG基因突變位點為第315位點，它的發(fā)生頻率約為76.7%。inhA的耐異煙肼突變主要發(fā)生在其啟動子區(qū)的-15位點上[11]。 耐鏈霉素與核糖體蛋白S12編碼基因(rpsL)及16S rRNA編碼蛋白(rrs)突變相關[12]，而大約有69%的乙胺丁醇耐藥菌株都檢測出embB的突變[13]，第306位密碼子突變在耐藥菌株中最為常見，還有第303、330位密碼子的突變都能導致Mtb對乙胺丁醇耐藥。

表3 藥敏試驗與反向斑點雜交法檢測結果的對比分析

注 敏感度=藥敏試驗、反向斑點雜交法均陽性株數/藥敏試驗陽性株數×100%；特異度=藥敏試驗、反向斑點雜交法均陰性株數/藥敏試驗陰性株數×100%；陽性預測值=藥敏試驗、反向斑點雜交法均陽性株數/反向斑點雜交法陽性株數×100%；陰性預測值=藥敏試驗、反向斑點雜交法均陰性株數/反向斑點雜交法陰性株數×100%

本研究采用反向斑點雜交技術對浙江溫州地區(qū)93份痰標本進行rpoB、katG、inhA、rpsL、embB基因突變檢測，同時采用液體培養(yǎng)及藥敏試驗，分析該技術檢測RFP、INH、Sm、EMB耐藥性的敏感度、特異度等指標。研究發(fā)現，38.6%的Mtb菌株為耐藥菌株，其中多重耐藥菌株占耐藥菌株的88.2%，說明溫州地區(qū)耐藥結核病的流行趨勢嚴重。

反向斑點雜交技術檢測Mtb陽性菌株57株，檢出率為61.3%，與單萬水等[14]報道相似。本研究中，反向斑點雜交技術檢測INH、RFP、Sm、EMB的耐藥基因的敏感度、特異度、陽性預測值與國內外相關報道相似[15-16]。其中，44株臨床菌種與藥敏試驗相比，存在假陽性耐藥基因突變株，出現與液體藥敏結果不同的假陽性結果，可能與擴增標本中DNA是既往殺滅的Mtb的DNA，也可能是每一種藥物的耐藥基因突變是逐漸積累的結果，很少量的耐藥菌株能擴增為陽性，但藥敏試驗并不一定表現為耐藥，包括藥敏試驗過程中一些人為因素也可能導致結果的不一致。此外，仍存在未檢測出突變位點的耐藥菌株，尤其是檢測EMB、Sm耐藥株敏感度較低，可能由于探針數量的限制，突變類型在本檢測芯片設計的探針之外或者存在其他的耐藥機制。

目前，臨床Mtb耐藥性的檢測以液體培養(yǎng)和藥敏試驗為主，此法不僅操作復雜、費時，一般需要4～6周，且培養(yǎng)困難，難以滿足臨床需要。GeneXpert Mtb/RIF系統雖然檢測Mtb的敏感度和特異度高，但僅能檢測利福平rpoB基因是否發(fā)生耐藥[17]。而利用反向斑點雜交技術檢測Mtb耐藥法不僅能同時檢測異煙肼、利福平、鏈霉素、乙胺丁醇是否發(fā)生耐藥，還能檢測出基因發(fā)生耐藥突變的具體位點或區(qū)域，檢測時間僅需1 d，可應用于臨床Mtb耐藥性的篩查，指導抗結核藥物的臨床選用，從而減少耐藥Mtb的傳播，降低耐藥率和死亡率。

[1] 全國第五次結核病流行病學抽樣調查技術指導組,全國第五次結核病流行病學抽樣調查辦公室.2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告.中國防癆雜志,2012,34(8):485-508.

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(本文編輯：王然 李敬文)

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.03.016

325000 浙江省溫州市中心醫(yī)院感染科(施伎蟬、蔣賢高、寧洪葉、何貴清、吳正興、蔡玉偉、程愛瓊)；溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院內科實驗室(余志杰)

蔣賢高，Email：jiangxiangao368@163.com

2015-08-11)