孫曉葉，康永振，沈中陽(天津市第一中心醫(yī)院 天津市器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津3009；天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院)

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肝移植患者術(shù)后14天內(nèi)膽汁中膽汁酸水平變化及其對(duì)缺血性膽管損傷發(fā)生的預(yù)測(cè)價(jià)值

孫曉葉1，康永振2，沈中陽1(1天津市第一中心醫(yī)院 天津市器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300192；2天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院)

摘要：目的觀察肝移植患者術(shù)后14天內(nèi)膽汁中膽汁酸水平變化，探討其對(duì)缺血性膽管損傷(ITBL)發(fā)生的預(yù)測(cè)價(jià)值。方法選取原位肝移植手術(shù)患者39例，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)術(shù)后第1、3、7、14天膽汁中6種膽汁酸水平變化，即甘氨膽酸(GCA)、?；悄懰?TCA)、?；鞘懰?TLCA)、甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)、甘氨酸結(jié)合脫氧膽酸(GDCA)、?；撬峤Y(jié)合脫氧膽酸(TDCA)。術(shù)后隨訪3個(gè)月，以膽道造影結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)判定是否發(fā)生ITBL，比較發(fā)生ITBL者(ITBL組)與未發(fā)生者(N-ITBL組)術(shù)后第1、3、7、14天各膽汁酸水平，采用ROC曲線評(píng)價(jià)各膽汁酸對(duì)術(shù)后發(fā)生ITBL的預(yù)測(cè)價(jià)值。結(jié)果術(shù)后第1天，ITBL組膽汁中GDCA水平較N-ITBL組降低；術(shù)后第7天，ITBL組膽汁中GCA、GDCA水平較N-ITBL組升高；術(shù)后第14天，ITBL組膽汁中TLCA、GCDCA、GDCA水平較N-ITBL組升高；組間比較P均<0.05。ROC曲線分析顯示，術(shù)后第14天膽汁中GCDCA水平對(duì)判斷肝移植術(shù)后發(fā)生ITBL的AUC為0.751、TLCA的AUC為0.764，術(shù)后第7天GCA水平對(duì)判斷肝移植術(shù)后發(fā)生ITBL的AUC為0.717。結(jié)論肝移植術(shù)后14天內(nèi)膽汁中GCDCA、GCA、TLCA水平升高，三者對(duì)肝移植患者術(shù)后3個(gè)月內(nèi)發(fā)生ITBL具有預(yù)測(cè)價(jià)值。

關(guān)鍵詞：肝臟移植；膽汁酸；缺血性膽管損傷

肝移植是目前治療各種終末期肝病的重要手段，但術(shù)后易發(fā)生膽道并發(fā)癥，影響肝臟移植受者生存率和生活質(zhì)量。缺血性膽管損傷(ITBL)是肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥的常見類型，主要指肝移植術(shù)后非吻合口部位膽管樹損傷，膽道造影顯示供體側(cè)肝內(nèi)膽道擴(kuò)張、狹窄，膽泥、膽石形成，甚至膽道損毀，是膽道并發(fā)癥中最難處理的類型。膽汁酸的代謝異常與多種肝膽疾病密切相關(guān)，其質(zhì)和量的變化對(duì)肝膽疾病的診斷、鑒別診斷及發(fā)病機(jī)理研究具有重要價(jià)值。本研究探討肝移植患者術(shù)后14天內(nèi)膽汁中膽汁酸水平變化對(duì)術(shù)后發(fā)生ITBL的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1資料與方法

1.1臨床資料選取2014年3月～2015年1月天津市第一中心醫(yī)院接受原位肝移植手術(shù)患者39例，男35例、女4例，年齡31～69(49.5±9.3)歲，終末期肝病模型評(píng)分(MELD評(píng)分)6～41(16.3±8.7)分，Child-Pugh分級(jí)A級(jí)7例、B級(jí)17例、C級(jí)15例，原發(fā)病為單純乙肝后肝硬化12例、乙肝肝硬化并發(fā)原發(fā)性肝癌6例、單純?cè)l(fā)性肝癌5例、酒精性肝硬化4例、單純乙肝+丙肝后肝硬化2例、伴發(fā)原發(fā)性肝癌1例、隱源性肝硬化2例、丙肝后肝硬化2例、暴發(fā)性肝臟衰竭1例、肝血管肉瘤1例、家族性淀粉樣變1例、慢加急肝臟衰竭1例、藥物性肝損害1例。納入標(biāo)準(zhǔn)： ①年齡≥16歲；②首次接受肝移植手術(shù)；③術(shù)前原發(fā)病為非膽道疾病，排除原發(fā)性硬化性膽管炎等；④術(shù)前無膽道感染、膽道手術(shù)及膽系結(jié)石等膽道相關(guān)并發(fā)癥；⑤無不可控制的全身感染，術(shù)中留置T管；⑥術(shù)后存活3個(gè)月以上。

1.2膽汁酸檢測(cè)研究對(duì)象均于術(shù)后第1、3、7、14天常規(guī)留取膽汁5～10 mL，編號(hào)并于-80 ℃深低溫保存，3個(gè)月內(nèi)分批采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定膽汁中6種膽汁酸水平，即甘氨膽酸(GCA)、?；悄懰?TCA)、?；鞘懰?TLCA)、甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)、甘氨酸結(jié)合脫氧膽酸(GDCA)、?；撬峤Y(jié)合脫氧膽酸(TDCA)。上述檢測(cè)均由天津醫(yī)科大學(xué)新科技應(yīng)用研究所中心實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3ITBL判定及其與膽汁酸水平的關(guān)系研究對(duì)象均進(jìn)行為期3個(gè)月的隨訪觀察，去除失訪或死亡病例，以膽道造影結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)判定是否發(fā)生ITBL。膽道造影具有如下改變判定為ITBL：①供體側(cè)肝內(nèi)外膽管局灶或彌漫性狹窄或擴(kuò)張；②肝內(nèi)3級(jí)以上末梢膽管充盈不良或顯影淺淡；③肝內(nèi)膽管不規(guī)則，如形態(tài)僵硬、管壁欠規(guī)整；④供體側(cè)肝內(nèi)外膽管局灶或彌漫性充盈缺損影。比較發(fā)生ITBL者與未發(fā)生者術(shù)后第1、3、7、14天6種膽汁酸水平變化。

2結(jié)果

2.1肝移植術(shù)后ITBL發(fā)生情況39例肝移植手術(shù)患者均獲為期3個(gè)月的隨訪，期間共發(fā)生ITBL 11例(ITBL組)，均為男性，年齡31～60(50.5±10.1)歲，MELD評(píng)分7～20(11.9±4.5)分，Child-Pugh分級(jí)A級(jí)3例、B級(jí)5例、C級(jí)3例，原發(fā)疾病為乙肝后肝硬化4例、原發(fā)性肝癌2例、單純乙肝+丙肝后肝硬化2例、酒精性肝硬化1例、丙肝后肝硬化1例、隱源性肝硬化1例，均無肝動(dòng)脈血管相關(guān)并發(fā)癥，1例存在門靜脈主干及腸系膜上靜脈狹窄合并腸系膜下動(dòng)脈遠(yuǎn)端多發(fā)動(dòng)靜脈瘺。移植肝內(nèi)外膽管狹窄伴擴(kuò)張5例，包括左肝管狹窄2例、右肝管近端狹窄1例、左右肝管開口部同時(shí)狹窄1例、供體側(cè)膽總管閉塞伴肝內(nèi)膽管明顯擴(kuò)張1例；肝內(nèi)膽管單發(fā)或多發(fā)充盈缺損影即膽泥形成3例，其中左肝管主干單發(fā)2例、右后肝管和左肝管起始部多發(fā)1例。膽道造影表現(xiàn)分支稀疏2例，移植肝肝內(nèi)膽管廣泛分支稀疏1例，左、右肝管開口部顯影淺淡伴遠(yuǎn)端分支稀疏1例；造影表現(xiàn)為移植肝肝內(nèi)膽管形態(tài)僵硬1例，左肝管主干纖細(xì)、右肝管分支稀疏。未發(fā)生ITBL 28例(N-ITBL組)，男24例、女5例，年齡31～69(49.5～10.1)歲。

2.2ITBL組、N-ITBL組肝移植術(shù)后膽汁中膽汁酸水平比較術(shù)后第1天，ITBL組膽汁中GDCA水平較N-ITBL組升高；術(shù)后第7天，ITBL組膽汁中GCA水平、GDCA水平較N-ITBL組升高；術(shù)后第14天，ITBL組膽汁中TLCA、GCDCA、GDCA水平較N-ITBL組升高；組間比較P均<0.05。見表1。

2.3膽汁酸對(duì)診斷ITBL的價(jià)值選取表1組間比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的數(shù)據(jù)，ROC曲線分析膽汁酸對(duì)ITBL發(fā)生的預(yù)測(cè)價(jià)值，結(jié)果顯示術(shù)后第14天TLCA水平對(duì)判斷肝移植術(shù)后發(fā)生ITBL的AUC及敏感性最高，術(shù)后第7天GCA水平對(duì)判斷肝移植術(shù)后發(fā)生ITBL的診斷特異性最高。

3討論

肝移植術(shù)后膽道并發(fā)癥發(fā)生率為10%～30%，其表現(xiàn)多樣，ITBL是其中最常見和最難處理的類型，對(duì)移植受者的危害也最為嚴(yán)重[1,2]。肝移植術(shù)后ITBL病變廣泛、病情反復(fù)，治療時(shí)間長(zhǎng)，再次肝移植是其治療的主要方法。本研究肝移植術(shù)后ITBL發(fā)生率為28.2%， 高于以往報(bào)道[1,2]， 原因可能為我們放寬了ITBL的診斷標(biāo)準(zhǔn)，將膽道造影顯示膽道形態(tài)不規(guī)則、管壁僵硬和膽道充盈不良、分支稀疏的病例均納入到ITBL。肝移植術(shù)后早期膽道造影結(jié)果顯示，膽道形態(tài)不規(guī)則和膽道充盈不良對(duì)發(fā)生ITBL的診斷敏感度和特異度可分別高達(dá)72.22%和87.44%[3]，因此如將這部分患者排除在外將使研究的假陰性率提高。肝移植術(shù)后非吻合口部位膽泥形成可能是ITBL的繼發(fā)改變，常在膽管已有損害的基礎(chǔ)上發(fā)生，特別是局灶性部位膽泥進(jìn)行網(wǎng)籃清理后?？砂l(fā)現(xiàn)膽泥形成部位伴有狹窄形成，故本研究也未將其排除在外?？紤]到部分患者在膽道已有病變時(shí)可能尚未出現(xiàn)肝臟酶學(xué)指標(biāo)或血清總膽紅素水平的升高，且肝臟酶學(xué)指標(biāo)或膽紅素水平的升高受其他非膽道因素的影響較大，因此本研究對(duì)ITBL的診斷主要依靠膽道造影結(jié)果。

表1　ITBL組、N-ITBL組肝移植術(shù)后第1、3、7、14天膽汁中膽汁酸水平比較

注：與N-ITBL組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05；與同組第1天比較，#P<0.05。

表2　　　　膽汁酸對(duì)肝移植術(shù)后發(fā)生ITBL預(yù)測(cè)價(jià)值的

注：臨界值為0.700。

肝移植術(shù)后發(fā)生ITBL是多因素共同作用的結(jié)果，其相關(guān)危險(xiǎn)因素包括肝動(dòng)脈血管并發(fā)癥、膽管周圍血管叢損傷[4]、灌注保存液的黏度大[5]、缺血-再灌注損傷、膽道二次熱缺血損傷、ABO血型不相容[6]、排斥反應(yīng)[7]、巨細(xì)胞病毒(CMV)感染和膽汁酸鹽毒性等，涉及從供肝切取后的灌注、保存、修整到供肝植入時(shí)肝動(dòng)脈吻合再到術(shù)后抗排斥和CMV感染的整個(gè)肝臟移植過程。非吻合口膽管狹窄最初被認(rèn)為與肝動(dòng)脈阻塞引起缺血有關(guān)，經(jīng)典多型的膽道造影影像學(xué)特征有膽管狹窄、膽管擴(kuò)張甚至膽管鑄型形成；而后此類病變被認(rèn)定為缺血性膽管炎或ITBL，說明肝動(dòng)脈血管并發(fā)癥的發(fā)生與ITBL關(guān)系密切。近年來越來越多的學(xué)者開始研究門靜脈血液供應(yīng)和氧供對(duì)ITBL發(fā)生的影響并取得進(jìn)展[8]。Farid等[9]研究結(jié)果提示，門靜脈血液供應(yīng)在肝移植術(shù)后膽道系統(tǒng)血供和氧供方面具有重要的病理生理作用。本研究中11例發(fā)生ITBL患者未發(fā)現(xiàn)并存肝動(dòng)脈血管性并發(fā)癥，僅有1例并發(fā)門靜脈主干和腸系膜上靜脈狹窄合并腸系膜下動(dòng)脈遠(yuǎn)端多發(fā)動(dòng)靜脈瘺，可能與本研究樣本量少有關(guān)。

肝臟合成的膽鹽占膽汁總固體量的50%～70%。膽鹽既是膽固醇代謝的終產(chǎn)物，又是在細(xì)胞損傷及膽固醇、脂類、糖類代謝中活躍的信號(hào)分子。膽汁是有毒性的液體，但在生理狀態(tài)下其對(duì)肝細(xì)胞和膽管上皮的毒性作用被頂端膜高膽固醇和鞘磷脂、膽鹽微膠粒、膽汁水化或堿化等限制；此外，膽囊和較大膽管黏液形成的保護(hù)作用以及膽汁流動(dòng)沖刷作用可降低膽汁與膽管上皮細(xì)胞膜頂端區(qū)域的作用時(shí)間，使膽汁的毒性作用難以顯現(xiàn)[10]。但是，當(dāng)膽汁在肝臟-膽道之間的輸送中斷或膽汁成分比例改變、膽鹽/膽固醇失衡等均會(huì)導(dǎo)致膽汁毒性作用顯現(xiàn)并繼發(fā)肝細(xì)胞和(或)膽管損傷[11]。膽汁酸是雙親性分子，具有分子定向平衡和膠團(tuán)形成兩種特殊性能，這使得其在一定范圍內(nèi)(1～10 mmol/L)能夠使生物膜的磷脂和蛋白質(zhì)脫落，導(dǎo)致膜損害，引起細(xì)胞膜通透性增加并最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。膽汁酸對(duì)生物膜影響的突出表現(xiàn)為其對(duì)線粒體膜通透性的影響。線粒體在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用，但在膽汁淤積時(shí)其也最容易成為膽汁酸在細(xì)胞內(nèi)攻擊的靶點(diǎn)，成為細(xì)胞功能缺陷的始動(dòng)因素。膽汁酸進(jìn)入細(xì)胞后，抑制線粒體氧化呼吸化作用，使ATP合成減少，鈣泵失活；同時(shí)，因?yàn)榧?xì)胞膜對(duì)Ca2+的通透性增加，細(xì)胞外Ca2+超載，激活蛋白水解酶，引起蛋白質(zhì)、DNA、RNA分解，導(dǎo)致細(xì)胞功能失常直至死亡[12]。已有實(shí)驗(yàn)證明，膽汁酸可以使體外培養(yǎng)的鼠肝細(xì)胞發(fā)生凋亡。Li等[13]體外培養(yǎng)鼠肝細(xì)胞2 h時(shí)分別將不同劑量(25、50、100、200、300 mol)的GCDCA加入培養(yǎng)基，結(jié)果顯示鼠肝細(xì)胞表現(xiàn)出典型的凋亡形態(tài)學(xué)及生化學(xué)變化，且呈濃度依賴和時(shí)間依賴效應(yīng)。GCDCA引起凋亡的機(jī)制是通過配體非依賴性Fas受體激活觸發(fā)的，Caspase-8、組織蛋白酶B和蛋白激酶C參與其中[14,15]。

本研究肝移植術(shù)后14天，ITBL組肝汁中GDCA、GCA、GDCA、TLCA、GCDCA水平均較N-ITBL組升高；ROC曲線分析結(jié)果顯示，術(shù)后第14天膽汁中GCDCA水平對(duì)判斷肝移植術(shù)后發(fā)生ITBL的AUC為0.751、14天TLCA的AUC為0.764，術(shù)后第7天GCA的AUC為0.717，提示GCDCA、GCA、TLCA可能是預(yù)測(cè)肝移植患者術(shù)后3個(gè)月內(nèi)發(fā)生ITBL的可靠指標(biāo)，其中敏感性最高的是術(shù)后第14天膽汁中TLCA水平，特異性最高的是術(shù)后第7天膽汁中GCA水平。但由于本研究樣本量較小，在大規(guī)模樣本量研究中是否支持以上結(jié)論還需進(jìn)一步研究。

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Bile acid level in the bile of patients within 14 days after liver transplantation and its predictive value for occurrence of ischemic-type biliary lesions

SUNXiaoye1,KANGYongzhen,SHENZhongyang

(1TianjinFirstCenterHospital,Tianjin300192,China)

Abstract:ObjectiveTo detect the levels of bile acids in the bile of patients within 14 days after liver transplantation and to investigate their predictive value for the occurrence of ischemic-type biliary lesion (ITBL). MethodsThirty-nine orthotopic liver transplant patients were selected. Using LC-MSMS to detect the contents of six kinds of bile acids including glycocholic acid (GCA), taurocholic acid (TCA), TLCA, glycochenodeoxycholic acid (GCDCA), glycine combined with deoxycholic acid (GDCA) and taurine combined with deoxycholic acid(TDCA) on day 1, 3, 7 and 14. They were followed up for three months after surgery, and then we determined whether ITBL occurred according to cholangiography results which served as gold standard, and compared the content of each bile acid on day 1, 3, 7 and 14 between patients with ITBL (ITBL group) and patients without ITBL (N-ITBL group). We used ROC curve to assess the predictive value of bile acids for the occurrence of ITBL. ResultsOn day 1, the content of GDCA was lower in the ITBL group than that in the N-ITBL group; on day 7, the contents of GCA and GDCA were higher in the ITBL group than those in the N-ITBL group; on day 14, the contents of TLCA, GCDCA and GDCA were higher in the ITBL group than those in the N-ITBL group, and significant difference was found between these two groups (all P<0.05). Analysis results of ROC carve showed that the AUC of GCDCA on day 14 for the occurrence of ITBL was 0.751, AUC of GCA on day 7 was 0.717, and AUC of TLCA on day 14 was 0.764. ConclusionThe contents of GCDCA, GCA and TLCA within 14 days after liver transplantation are increased and they all can be used as reliable indexes to predict whether ITBL occurs within 3 months after surgery.

Key words:liver transplantation; bile acid; ischemic-type biliary lesions

(收稿日期：2016-01-20)

中圖分類號(hào)：R657.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)12-0005-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2016.12.002

通信作者簡(jiǎn)介：沈中陽(1962-)，男，主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)楦闻K移植。E-mail: zhongyangshen@vip.sina.com

第一作者簡(jiǎn)介：孫曉葉(1975-)，女，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)楦闻K移植。E-mail: sxy_tj@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(2012AA021001)；國(guó)家臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目(201354408)；天津市衛(wèi)生局攻關(guān)項(xiàng)目(12KG103)。