彭西甜,　夏　虹,　張　仙,　胡西州,　彭立軍,　沈　菁

(湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全

風險評估實驗室(武漢), 湖北 武漢 430064)

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研究論文

一種新型的殺螟丹分析方法及其在稻田殺螟丹殘留動態(tài)分析中的應用

彭西甜,夏虹,張仙,胡西州,彭立軍,沈菁*

(湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全

風險評估實驗室(武漢), 湖北 武漢 430064)

摘要:建立了一種水稻植株、糙米、稻殼、土壤和田水中的殺螟丹氣相色譜-火焰光度檢測(GC-FPD)方法。樣品中的殺螟丹使用稀鹽酸提取,然后在堿性條件下使用氯化鎳(NiCl2)將其衍生為沙蠶毒素,最后采用在線連接的支撐液液萃取(SLE)和固相萃取(SPE)進行萃取和富集。在優(yōu)化好的條件下,殺螟丹在5種空白樣品中低、中、高3種添加濃度的回收率為80.0%～114.4%,相對標準偏差(RSD)小于13.7%,表明所建立的方法具有良好的準確度和精密度。將所建立的方法用于大田條件下殺螟丹的殘留動態(tài)分析,為建立殺螟丹的最大殘留限量(MRL)提供參考,同時也可對農(nóng)藥施用技術(shù)的安全性進行評價。

關(guān)鍵詞:支撐液液萃取;氣相色譜-火焰光度檢測器;殺螟丹;水稻;殘留動態(tài)

殺螟丹是沙蠶毒素類農(nóng)藥,其在生物體內(nèi)首先轉(zhuǎn)化為沙蠶毒素,一種從環(huán)節(jié)動物體內(nèi)提取出來的神經(jīng)毒素,該毒素可以與乙酰膽堿受體結(jié)合,阻斷神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞,導致害蟲神經(jīng)中樞紊亂,從而起到殺蟲的作用[1-3]。目前,殺螟丹作為一種高效的有機殺蟲劑,被廣泛應用于控制水稻生產(chǎn)中的螟蟲和稻縱卷葉螟[4]。然而,有文獻報道殺螟丹對一些動物具有一定的毒性[5-7],其在食品和環(huán)境中的殘留對人體健康造成了威脅。水稻在中國是最重要的食物,其種植面積占到了世界的23%,總產(chǎn)量超過了世界的30%,排在世界第一位[8,9]。因此,發(fā)展快速、簡單、有效的殺螟丹分析方法,研究殺螟丹在稻田中的消解和殘留,對于評價施藥技術(shù)的安全性,保護環(huán)境和人類的健康,具有重要的意義。

目前,光譜法[10]、熒光探針法[11,12]、比色法[13]、氣相色譜-電子捕獲檢測(GC-ECD)[4,14]、液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)[3,15,16]等已經(jīng)被用于各種樣品中殺螟丹的檢測,其中質(zhì)譜檢測方法是目前應用最多的農(nóng)藥殘留分析方法。殺螟丹及其衍生物沙蠶毒素分子中含有兩個硫原子(見圖1),可以通過氣相色譜-火焰光度檢測(硫)(GC-FPD(S))實現(xiàn)高靈敏、高選擇性的分析檢測,同時,與HPLC-MS相比,GC-FPD(S)分析成本更低,更容易在常規(guī)實驗室中得到應用。

圖 1　　　殺螟丹和沙蠶毒素的化學結(jié)構(gòu)Fig. 1　　　Chemical structures of cartap and nereistoxin

由于樣品基質(zhì)復雜,殺螟丹在樣品中的濃度較低,在儀器分析前進行適當?shù)臉悠非疤幚硎潜夭豢缮俚?。殺螟丹是一個強極性的堿性化合物,通常通過酸性的水溶液從樣品中進行提取,然后采用有機溶劑從堿性水溶液中進行萃取[4]。然而,殺螟丹在堿性條件下不穩(wěn)定,容易降解為沙蠶毒素,使得分析結(jié)果的準確性降低[17,18]。吳剛等[19]在酸性條件下提取茶葉中的殺螟丹,在堿性條件下使用Na2S將殺螟丹衍生為沙蠶毒素,經(jīng)過乙醚萃取、pH調(diào)節(jié)、濃縮等步驟,采用GC-FPD(S)分析茶葉中的殺螟丹;該方法需要經(jīng)過多步的液液萃取(LLE)和濃縮,步驟較為繁瑣,不適合大量樣品高通量的分析檢測;同時,傳統(tǒng)的LLE無法避免乳液的形成,有機溶劑的濃縮過程費時費力。支撐液液萃取(SLE)是一種新型的樣品前處理技術(shù),由Johnson等[20]在1997年首次提出,其采用一種對水具有強吸附能力、惰性、高比表面積、多孔的固體介質(zhì)作為載體,以不溶于水的有機溶劑將目標物從載體表面的吸附水層中萃取洗脫下來[21,22],相比于LLE的方法,該方法具有高通量、重復性好、避免形成乳液等優(yōu)點。

在本文中,我們將SLE和固相萃取(SPE)在線連接用于萃取和富集樣品中的殺螟丹衍生物沙蠶毒素,結(jié)合GC-FPD(S)的分離檢測,建立了一種水稻植株、糙米、稻殼、土壤和田水中殺螟丹快速、高效的分析方法。使用酸性水溶液對樣品中的殺螟丹進行提取,在堿性條件下使用氯化鎳(NiCl2)將其衍生為沙蠶毒素,然后上硅藻土基的SLE柱,以正己烷洗脫,洗脫液直接采用在線連接的氨基SPE柱進行富集,避免了濃縮過程中分析物的損失,最后使用甲醇將沙蠶毒素從氨基SPE柱上解吸,GC-FPD(S)分離檢測。將所建立的方法應用于殺螟丹在水稻稻米、稻殼、植株、土壤、田水中的消解和殘留分析。本文的研究結(jié)果可以提供殺螟丹在環(huán)境中的降解動態(tài)數(shù)據(jù),為建立殺螟丹的最大殘留限量(MRL)提供參考,同時也可對農(nóng)藥施用技術(shù)的安全性進行評價。

1實驗部分

1.1材料與試劑

殺螟丹鹽酸鹽(純度98.1%)購自中國農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所(北京)。沙蠶毒素草酸鹽(純度99.0%)購自Dr. Ehrenstorfer GmbH (德國)。0.8%殺螟丹顆粒劑由廣東惠州中迅化工有限公司(惠州)提供。HPLC級的甲醇購自T. Baker (荷蘭)。分析級的正己烷、鹽酸、氨水、二氯化鎳(NiCl2)購自國藥集團化學試劑有限公司(上海)。Hicapt NH2SPE柱(500 mg, 6 mL)購自維泰克科技有限公司(武漢)。Cleanert@SLE柱(14.5 g, 60 mL)和Cleanert Florisil柱(1.0 g, 6 mL)購自博納艾杰爾科技有限公司(天津)。

1.2儀器和條件

日本島津GC-2010, FPD檢測器配有S濾光片,毛細管色譜柱Rtx@-35 (300 cm×0.25 mm×0.25 μm) (USA)。程序升溫:80 ℃保持2 min,以10 ℃/min升高到200 ℃;不分流進樣,進樣體積1.0 μL;超純氮氣作為載氣,流速為1.0 mL/min;進樣口和檢測器溫度分別為220 ℃和280 ℃。

1.3田間試驗

2011年,0.8%的殺螟丹顆粒劑在水稻上消解動態(tài)和最終殘留的田間試驗在湖北省武漢市、浙江省杭州市和河北省石家莊市進行。每個處理包括一個空白對照和3個重復,每小區(qū)30 m2。在植株消解動態(tài)試驗中,0.8%殺螟丹顆粒劑以推薦有效劑量的1.5倍(2 700 g/hm2)分別噴灑在水稻植株表面和田水中,在施藥后0.083 (2 h)、1、3、5、7、10、14、21、28、42天采集植株、土壤和田水樣品。在最終殘留試驗中,設(shè)高低兩個有效劑量(2 700 g/hm2, 1 800 g/hm2),各設(shè)施藥3次和施藥4次,施藥間隔期為7天,最后一次施藥距采收間隔21天或28天。待水稻成熟時,采集水稻植株、稻穗和土壤樣品。

1.4樣品制備

首先將水稻植株樣品切成1 cm長小段,然后用攪拌器攪拌粉碎。田水樣品用塑料瓶在試驗點隨機采集,分析前過濾。土壤樣品在陰涼處晾干后,用攪拌器粉碎,過40目的篩子。水稻樣品在室溫風干后分離糙米和稻殼,糙米和稻殼樣品用攪拌器攪拌成粉末。所有樣品分析前都儲藏在-20 ℃冰箱中。

1.5樣品分析過程

稱取一定量的樣品(10.0 g的糙米和土壤,5.0 g的植株和稻殼)至100 mL離心管中,加入40 mL的1.0 mol/L鹽酸溶液浸泡過夜,超聲提取15 min, 4 000 r/min離心5 min,取20 mL上清液至100 mL錐形瓶中,加入1 mL 20 g/L的NiCl2溶液和2.5 mL的氨水,溶液振蕩混勻后在室溫放置衍生反應1 h,將衍生溶液倒入硅藻土SLE柱,平衡15 min,待樣品溶液吸附在SLE柱的硅藻土填料表面后,用60 mL正己烷分3次洗脫硅藻土表面吸附水層中的衍生產(chǎn)物沙蠶毒素,同時洗脫液中的沙蠶毒素采用在線連接的氨基SPE柱進行富集。最后,吸附在氨基SPE柱上的沙蠶毒素采用2.0 mL甲醇進行解吸,GC-FPD(S)分離檢測。水樣的處理同其他樣品處理方法基本相同,將20 mL水樣放入100 mL錐形瓶中,后續(xù)處理步驟同上。整個分析過程如圖2所示。

圖 2　　　在線連接SLE-SPE分析植株、糙米、稻殼、土壤和田水中的殺螟丹示意圖Fig. 2　　　Scheme of on-line combination of SLE and SPE for cartap analysis in rice plants, 　　　husked rice, rice hull, soil and water

2結(jié)果與討論

2.1樣品制備過程的優(yōu)化

QuEChERS(Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, Safe)法是目前應用最廣泛的食品中農(nóng)藥殘留分析的前處理方法[23,24]。在本文中,我們嘗試采用傳統(tǒng)的QuEChERS方法進行提取,然而由于殺螟丹的水溶性較高,其回收率只有50%左右。此外,我們發(fā)現(xiàn)當樣品溶液在減壓或氮氣吹干的條件下進行濃縮時,殺螟丹的衍生物沙蠶毒素很容易揮發(fā),造成回收率降低。

因此,在本文中,通過在線連接SLE和SPE,我們建立了一種水稻植株、糙米、稻殼、土壤和田水中殺螟丹快速、穩(wěn)定的分析方法。殺螟丹是一種堿性分析物,采用稀鹽酸進行提取。對超聲提取和振蕩提取法進行了比較,發(fā)現(xiàn)超聲提取15 min回收率基本可以達到100%。然后,使用NiCl2在堿性條件下將殺螟丹衍生為沙蠶毒素,含有沙蠶毒素的樣品溶液上硅藻土SLE柱,對3種洗脫溶劑(正己烷、乙醚、乙酸乙酯)的洗脫效率進行了優(yōu)化,發(fā)現(xiàn)60 mL正己烷可以完全將硅藻土表面吸附水層中的沙蠶毒素洗脫下來。最后,采用NH2和Florisil柱在線富集洗脫液中的沙蠶毒素,我們發(fā)現(xiàn)兩種萃取柱都可以完全萃取洗脫液中的沙蠶毒素。然而,由于強的靜電和氫鍵作用,沙蠶毒素很難從Florisil柱上解吸下來,而2 mL甲醇可以完全解吸氨基柱上的沙蠶毒素。在線的SLE和SPE的結(jié)合克服了傳統(tǒng)LLE中乳液形成的缺點,避免了濃縮過程中目標物的損失。在最優(yōu)化的條件下,空白和添加樣品的色譜圖見圖3。

圖 3　　　(a)糙米、(b)稻殼、(c)植株、(d)田水、(e)土壤空白樣品和加標樣品的GC色譜圖Fig. 3　　　Typical GC chromatograms of blank and spiked samples of (a) husked rice, 　　　(b) rice hull, (c) rice plants, (d) water and (e) soil

2.2方法學考察

根據(jù)線性范圍、定量限(LOQ)、精密度、回收率等對本方法進行了考察。不同濃度的沙蠶毒素標準溶液進入GC-FPD(S)分析。在0.1～40 mg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),峰面積與分析物的含量具有較好的對數(shù)關(guān)系,相關(guān)方程為lgy=2.04 lgx+6.61，R2為0.999 5,其中y為峰面積，x為分析物的含量(mg/kg)。按照基線與噪聲的標準偏差的10倍計算方法的LOQ,糙米和土壤中的LOQ為0.05 mg/kg,植株和稻殼中的LOQ為0.1 mg/kg,田水中的LOQ為0.01 mg/kg。

在空白的植株、糙米、稻殼、土壤和田水樣品中添加低、中、高3種濃度的殺螟丹,計算方法回收率和相對標準偏差(RSDs)?；厥章适峭ㄟ^計算實測值(采用標準曲線計算)和實際添加值的比得到的。如表1所示,方法回收率為80.0%～114.4%,相對標準偏差小于13.7%,表明所建立的方法具有良好的準確度和精密度,可以用于實際樣品的分析檢測。

表 1　　　不同樣品中殺螟丹的回收率和相對標準偏差(n=5)

2.3消解試驗

稻田水中殺螟丹的消解試驗結(jié)果如圖4a所示,在田水中以2 700 g/hm2的有效劑量施用0.8%殺螟丹顆粒劑后,在三地(湖北、河北、浙江)田水中殺螟丹的初始濃度分別為5.06、3.07和3.73 mg/L,消解動力學可以采用一級動力學方程進行描述:C=5.06e-3.23t(湖北),C=3.08e-1.07t(河北),C=3.72e-1.30t(浙江),其中C和t分別表示質(zhì)量濃度(mg/L)和時間(天)。根據(jù)這3個動力學方程,殺螟丹在湖北、河北、浙江田水中的半衰期(t1/2)分別為0.21、0.65和0.53天,表明殺螟丹在田水中會快速地消解。湖北和浙江水稻植株中殺螟丹的消解曲線如圖4b所示,施藥3天后殺螟丹在植株中的含量分別為0.12和0.22 mg/kg,在5天后達到峰值,隨后快速降低,這可能是由于光照、氧化、水解、生長稀釋等原因造成的。在河北植株樣品中沒有檢測到殺螟丹的殘留,這可能是氣候環(huán)境的原因。

圖 4　　　殺螟丹在田水和水稻植株中的消解動態(tài)Fig. 4　　　Dissipation of cartap in paddy water and rice plants

對于殺螟丹在土壤中的消解情況,在河北和湖北的土壤樣品中沒有檢測到殺螟丹的殘留,在浙江土壤樣品中的檢出值也低于0.25 mg/kg,這可能是由于殺螟丹在水中具有很高的溶解度,其消解速度也很快,導致沉積在土壤中的殺螟丹很少。

2.4最終殘留試驗

將0.8%的殺螟丹顆粒劑以推薦的有效劑量(1 800 g/hm2)和1.5倍的推薦有效劑量(2 700 g/hm2)施藥3次或4次(施藥間隔期7天)后的第21天和28天后采集樣品,殺螟丹在所有的糙米、稻殼、土壤中都沒有檢出。在水稻植株中的殘留量為0.13～1.46 mg/kg,這是由于在水稻生長的后期施用了多次農(nóng)藥,生長稀釋的效應較弱,最終導致水稻植株中殺螟丹的檢出值較高。

3結(jié)論

本文通過在線連接的支撐液液萃取-固相萃取技術(shù),建立了一種高效的水稻植株、糙米、稻殼、土壤、田水中殺螟丹的氣相色譜-火焰光度檢測(硫)檢測方法,方法學考察表明該方法具有良好的準確度和精密度。該方法克服了傳統(tǒng)液液萃取的缺陷,避免了樣品濃縮過程中分析物的損失。將所建立的方法應用于大田條件下殺螟丹在水稻植株、糙米、稻殼、土壤、田水中的殘留動態(tài)分析,結(jié)果表明在水稻糙米和稻殼中沒有檢出殺螟丹,殺螟丹在田水和植株中的消解速度很快,田水中的半衰期小于1天,在土壤中的殘留量也很低,表明目前的施藥方法是安全的。

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Development of a novel analytical method of cartap and its application to the residue and dissipation analysis of cartap in paddy field

PENG Xitian, XIA Hong, ZHANG Xian, HU Xizhou, PENG Lijun, SHEN Jing*

(Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology Research, Hubei Academy of Agricultural Science/Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Agroproducts (Wuhan), Ministry of Agriculture, Wuhan 430064, China)

Abstract:Cartap has been widely used as a highly effective pesticide in rice fields for the control of rice stem borer and leaf folde. In this paper, a novel analytical method of cartap in rice plants, husked rice, rice hull, soil and water was developed by gas chromatography-flame photometric detector (GC-FPD). Cartap in these sample matrices was first extracted with dilute hydrochloric acid solution, and then derivatized to nereistoxin with nickel chloride (NiCl2) under basic condition. At last, nereistoxin was extracted and concentrated by on-line combination of supported liquid-liquid extraction (SLE) and solid phase extraction (SPE). Under the optimal conditions, the recoveries of cartap in these sample matrices spiked at three levels ranged from 80.0% to 114.4% with relative standard deviations (RSDs) less than 13.7%, indicating good accuracy and precision of our proposed method. The proposed method was then applied to the analysis of residue and dissipation of cartap in rice plants, husked rice, rice hull, soil and water under field conditions. The results can provide reference for the establishment of the maximum residue level (MRL) of cartap and estimation of safety of pesticide application technology.

Key words:supported liquid-liquid extraction (SLE); gas chromatography-flame photometric detector (GC-FPD); cartap; rice; residue and dissipation

中圖分類號:O658

文獻標識碼:A

文章編號:1000-8713(2016)04-0436-06

基金項目:湖北省農(nóng)科院青年科學基金(2013NKYJJ18);湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心項目(2016-620-000-001-037).

*收稿日期:2016-01-07

DOI:10.3724/SP.J.1123.2015.12034

*通訊聯(lián)系人.Tel:(027)87389808,E-mail:myshenjing@126.com.

Foundation item: Youth Fund for Hubei Academy of Agricultural Science (No. 2013NKYJJ18); Project of Hubei Provincial Innovation Center for Agricultural Sciences and Technologies (No. 2016-620-000-001-037).