萬麗麗　王轉(zhuǎn)茸　辛強(qiáng)　董發(fā)明　洪登峰　楊光圣

摘要：利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化分別將Cry1C和Cry2A的2個單價Bt基因轉(zhuǎn)入油菜（Brasica napusL.），以兩個純合的轉(zhuǎn)基因抗蟲油菜為親本，通過有性雜交的方法將不同Bt基因聚合，培育雙價Bt抗蟲油菜，并對其抗蟲性和種子品質(zhì)性狀進(jìn)行評價。結(jié)果表明，Cry1C、Cry2A在聚合后均能穩(wěn)定表達(dá)，和單價Cry1C轉(zhuǎn)基因植株相比，雙價株系中蛋白質(zhì)含量明顯降低，以Cry2A為母本的聚合株系蛋白質(zhì)含量降低更多，Cry1C在遺傳上存在母本效應(yīng)。室內(nèi)接種小菜蛾二齡幼蟲結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化單價和雙價聚合Bt基因的抗蟲性增強(qiáng)，其中轉(zhuǎn)化單價Cry1C的抗蟲性優(yōu)于雙價聚合Bt基因和單價Cry2A基因的轉(zhuǎn)基因植株。玻璃溫室栽培轉(zhuǎn)基因植株，單價Bt和雙價聚合Bt基因的轉(zhuǎn)基因植株能生存而非轉(zhuǎn)基因植株受到嚴(yán)重蟲害而死亡。對抗性優(yōu)良的單價和雙價聚合的轉(zhuǎn)基因植株種子品質(zhì)測定發(fā)現(xiàn)，與未受到蟲害的受體材料雙低優(yōu)良恢復(fù)系7-5的含油量和硫苷含量差異不顯著，從而達(dá)到抗性改良的目的。

關(guān)鍵詞：油菜（Brassica napus L.）；蘇云金芽孢桿菌；Cry1C；Cry2A；雙價聚合；農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化；品質(zhì)性狀

中圖分類號：Q785 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）09-2386-06

油菜（Brassica napus L.）在生長發(fā)育過程中容易受到蟲害的侵襲，有10多種害蟲在油菜生產(chǎn)上能大面積發(fā)生并造成嚴(yán)重減產(chǎn)。近年來，氣候變化使得蟲害日趨嚴(yán)重。對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成損失。盡管使用化學(xué)農(nóng)藥能夠取得良好的防控效果，但是農(nóng)藥殘留對環(huán)境和人體的健康產(chǎn)生的危害已引起廣泛的關(guān)注。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將抗蟲基因轉(zhuǎn)入油菜中，可以一定程度上改良油菜的抗蟲性。轉(zhuǎn)基因抗蟲植物最重要的基因來源于微生物的抗蟲基因，即蘇云金芽孢桿菌殺蟲基因（Bt）。Bt殺蟲晶體被昆蟲攝入后，經(jīng)歷了晶體蛋白溶解、原毒索酶解活化、與中腸受體結(jié)合、不可逆插入膜內(nèi)、形成離子通道五個階段最后實現(xiàn)殺蟲效果。根據(jù)殺蟲晶體蛋白的殺蟲特異性以及氨基酸序列的同源性標(biāo)準(zhǔn)將發(fā)現(xiàn)的42種殺蟲蛋白基因分為7大類。其中類型Ⅰ（CryⅠ）抗鱗翅目（Lepidoptera）昆蟲，類型Ⅱ（CryⅡ）抗鱗翅目和雙翅目（Diptera）昆蟲，類型Ⅲ（CryⅢ）抗鞘翅目（Coleoptera）昆蟲，類型Ⅳ（CryⅣ）抗雙翅目昆蟲，CryⅤ對鱗翅目和鞘翅目以及線蟲特異，CryⅥ對線蟲特異，這六類統(tǒng)稱為晶體蛋白基因家族（Crvstalprotein gene，cry）。CrtA對雙翅目特異，與Cry基因完全不同，屬于細(xì)胞外毒索（Cvtolvtic protein，Cyt）。Bt產(chǎn)生的晶體蛋白對鱗翅目昆蟲具有特異的毒性，作為一種生物殺蟲劑在農(nóng)業(yè)害蟲防治中廣泛應(yīng)用。通過人工修飾Bt基因，如位點特異性突變的Crv3Bbl毒蛋白在玉米中表達(dá)可提高其對根蟲的抗性。1990年Monsanto公司首次在轉(zhuǎn)Bt抗蟲棉中獲得人工修飾的CryIA（6）和CryIA（c）基因，這2個基因在植株中蛋白含量占總可溶性蛋白的0.05%-0.10%。Cry基因與植物基因密碼子上的差異導(dǎo)致轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)轉(zhuǎn)錄過程形成二級結(jié)構(gòu)，mRNA的穩(wěn)定性下降以及翻譯效率降低，來自蘇云金芽孢桿菌的5個δ-內(nèi)毒素Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1C、Cry2A和Cry9C能夠與蛀莖蟲三化螟和二化螟中腸不同受體位點結(jié)合，利用毒性蛋白與刷狀緣膜囊結(jié)合能力競爭性試驗分析得出不同Bt基因抗蟲效果的差異。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻課題組人工合成Bt基因Cry1Ac、Cry2A、Cry1C和Cry9C轉(zhuǎn)入優(yōu)良水稻恢復(fù)系明恢63中，獲得對兩種主要水稻鉆蛀害蟲三化螟和二化螟抗性優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因家系。對蘇云金芽孢桿菌的Cry1Cal進(jìn)行截短，依據(jù)單子葉植物偏好來提高Bt基因的GC含量轉(zhuǎn)化到粳稻品種秀水11中能提高轉(zhuǎn)基因水稻對斜紋夜蛾和鉆蛀蟲的抗性。

隨著Bt作物的普遍商業(yè)化種植給目標(biāo)昆蟲群體造成了極大的選擇壓，產(chǎn)生了昆蟲克服抗性的巨大風(fēng)險。小菜蛾（Plutella xylostella）是遷飛害蟲，主要危害十字花科植物，對幾乎所有類型的化學(xué)殺蟲劑都產(chǎn)生過抗性。在1990年田間發(fā)現(xiàn)了對Bt蛋白產(chǎn)生抗性的小菜蛾，是首次在自然條件下發(fā)現(xiàn)對Bt殺蟲蛋白產(chǎn)生抗性的昆蟲，是長期使用Bt制劑的產(chǎn)物，可以利用不同Bt基因聚合延緩昆蟲抗性。Tu等2000年利用水稻ActinⅠ啟動子驅(qū)動兩個Bt基因cry1A（6）和cry1A（c）基因融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化明恢63恢復(fù)系和雜交種汕優(yōu)63。Bt汕優(yōu)63在自然條件以及室內(nèi)接種水稻鉆蛀害蟲三化螟表現(xiàn)出很好的抗性，并且不會帶來產(chǎn)量損失。

本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以Bar基因作為抗性篩選標(biāo)記，將華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻課題組人工合成的Bt基因Cry2A和Cry1C轉(zhuǎn)入到甘藍(lán)型油菜Pol-CMS優(yōu)良恢復(fù)系材料7-5中，獲得抗蟲性改良的轉(zhuǎn)基因家系。另外。將分別轉(zhuǎn)化2個基因的植株雜交聚合，對雜交后純合轉(zhuǎn)基因家系進(jìn)行抗蟲性評價，以期為轉(zhuǎn)Bt基因油菜的抗蟲性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的甘藍(lán)型油菜為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜室所提供的優(yōu)良PolCM雙低恢復(fù)系7-5。選取干凈飽滿油菜種子，75%乙醇消毒1min，0.1%HgCl₂溶液表面滅菌15min，無菌水沖洗3次，置于MS固體培養(yǎng)基上發(fā)芽。取生長6d的無菌苗下胚軸，用于試驗材料。植物表達(dá)載體pCAMBIA-Ubiquitin promoter-Cry1C和oCAMBIA-Ubiquitin promoter-Cry2A為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻轉(zhuǎn)化課題組林擁軍教授提供。大腸桿菌Top10和根癌農(nóng)桿菌GV3101由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國家重點實驗室油菜課題組保存。DNA聚合酶購自Promega公司，DNA marker購自Takara公司。田間噴施Basta購自Bayer公司。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)基因植株鑒定 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，以改造的pCAMBIA質(zhì)粒作為載體，抗除草劑基因膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶（Bar）基因作為選擇標(biāo)記基因，以Cry1C和Cry2A分別轉(zhuǎn)化優(yōu)良的油菜恢復(fù)系7-5。農(nóng)桿菌菌株為GV3101，轉(zhuǎn)基因植物檢測的引物Crv2A-L（CGTGTCAATGCTGACCTGAT）、Cry2A-R（GATGCCGGACAGGATGTAGT）、Cry1C-L（TTCTACTGGGGAGGACGTCG）、Cry1C-R（CGGTATCTTTGGGTGATTGG）、Bar/L（GCTCAACACATGAGCGAAAC）、Bar-R（CGCACAATCCCACTATCCTF）。轉(zhuǎn)基因植株田間噴施除草劑Basta的濃度為500mg/L，苗期每7d噴施1次，連續(xù)21d。 1.2.2 轉(zhuǎn)基因植株Bt蛋白含量的測定 轉(zhuǎn)基因植株葉片中Bt蛋白濃度測定采用EnvironLogix公司（EnvironLogix。Portland，USA）的Bt蛋白ELISA檢測試劑盒，CryIC蛋白的測定使用了EnvironLogix公司ELISA檢測試劑盒QualiPlate^TMKit fo rCry1C，具體操作參考試劑盒說明。

1.2.3 小菜蛾二齡幼蟲室內(nèi)和人工玻璃溫室中的抗性測定 待田間油菜生長至5-6葉期時，采集新鮮的葉片，剪成直徑為6（3m的圓盤。將圓盤放置于鋪有衛(wèi)生紙的培養(yǎng)皿上，將10頭二齡幼蟲接種到每片葉子上，將接種材料置于人工氣候箱中。培養(yǎng)溫度25℃，濕度80%，光照3000lx，光周期16h光照/8h黑暗。檢測轉(zhuǎn)基因植株抗蟲效果，每個處理重復(fù)3次。記錄幼蟲取食72h后的平均重量、致死率和生長狀況。轉(zhuǎn)基因植株種植在人工玻璃溫室中，苗期觀察植株被害蟲取食的情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因植株的獲得和鑒定

通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)分別獲得了轉(zhuǎn)化Cry1C和Cry2A的植株，根據(jù)基因特異序列設(shè)計引物檢測單價抗蟲轉(zhuǎn)基因T。代植株，確定陽性轉(zhuǎn)基因植株。在田間將轉(zhuǎn)化不同單價抗蟲基因的轉(zhuǎn)基因植株正反交，其中獲得Cry1C×Cry2A（以Cry1C轉(zhuǎn)基因植株為母本，Cry2A轉(zhuǎn)基因植株為父本的雜交后代）和Cry2A×Cry1C（以Cry2A為母本。Cry1C為父本的雜交后代）植株，對其進(jìn)行抗蟲基因的特異性標(biāo)記分析（圖1）。將所獲得的轉(zhuǎn)基因植株種植在大田，用Basta噴施鑒定后發(fā)現(xiàn)陽性的轉(zhuǎn)基因植株都具有除草劑抗性（圖2）。

2.2 轉(zhuǎn)基因株系室內(nèi)抗蟲性評價

選取單價抗蟲轉(zhuǎn)基因和聚合雙價抗蟲轉(zhuǎn)基因油菜植株的葉片喂食二齡小菜蛾幼蟲（圖3A、B、C），72h后統(tǒng)計喂食幼蟲的蟲重，結(jié)果表明，與野生型7-5相比較，轉(zhuǎn)化單價Cry2A基因的轉(zhuǎn)基因油菜植株喂食后蟲重下降，差異顯著。而轉(zhuǎn)化單價Cry1C基因以及雙價抗蟲基因聚合后的轉(zhuǎn)基因油菜植株葉片喂食后，小菜蛾幼蟲蟲重出現(xiàn)了顯著或者極顯著下降，進(jìn)一步證明了轉(zhuǎn)化抗蟲基因能夠有效地提高油菜抗小菜蛾幼蟲能力（圖3D、表1）。

由于轉(zhuǎn)化Cry1C基因的轉(zhuǎn)基因植株的抗蟲性表現(xiàn)極顯著優(yōu)于對照，選取單價轉(zhuǎn)化Cry1C的T₁代轉(zhuǎn)基因3個家系共21個植株的葉片和雙價聚合轉(zhuǎn)基因植株6個家系共38個植株的葉片，測定其Cry1C蛋白的含量，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)化Cry1C基因的轉(zhuǎn)基因植株中Cry1C蛋白平均含量高于聚合Cry1C和Cry2A基因的轉(zhuǎn)基因植株中的蛋白含量（圖4）。

2.3 轉(zhuǎn)基因株系在玻璃溫室中的抗蟲性

將轉(zhuǎn)化單價抗蟲基因和雙價抗蟲基因的轉(zhuǎn)基因油菜植株于4月底種植在人工玻璃溫室中，觀察蟲害對轉(zhuǎn)基因幼苗的影響（圖5），可見轉(zhuǎn)化單價Cry1C基因的轉(zhuǎn)基因植株抗蟲性表現(xiàn)最優(yōu)。

2.4 轉(zhuǎn)基因株系種子品質(zhì)評價

抗蟲轉(zhuǎn)基因油菜遇到蟲害時自身會啟動一些防御反應(yīng)，同時植物會消耗自身的能量從而導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)的下降。轉(zhuǎn)基因受體材料7-5是優(yōu)良雙低恢復(fù)系油菜，抗蟲基因Cry1C和Cry2A在泛素啟動子作用下在7-5材料中組成型表達(dá)，一定程度上會使植株產(chǎn)生代謝負(fù)荷，油菜子的品質(zhì)受到影響。因此，對單價和雙價聚合的轉(zhuǎn)基因植株種子品質(zhì)進(jìn)行測定（表2），與對照7-5相比較，Cry1C×Cry2A聚合轉(zhuǎn)基因家系油酸C18：1含量顯著增加，二十碳烯酸C20：1含量極顯著下降。Cry1C轉(zhuǎn)基因T₁代兩個家系二十碳烯酸C20：1含量極顯著高于7-5。Cry2A轉(zhuǎn)基因T₁代家系二十碳烯酸C20：1含量顯著高于7-5。對種子中含油量和硫苷進(jìn)行分析得出，所有的轉(zhuǎn)基因家系與7-5對照相比較差異不顯著（圖6）。

3 討論

3.1 Bt基因在轉(zhuǎn)基因后代中的遺傳

為了獲得優(yōu)良抗蟲表型的轉(zhuǎn)基因家系，對抗蟲表現(xiàn)不一致的T₀代轉(zhuǎn)基因植株的選擇是育種過程中的必要步驟。本試驗所獲得的T₁代都來源于轉(zhuǎn)基因插入位點為一個拷貝并且抗蟲表現(xiàn)優(yōu)于轉(zhuǎn)基因受體對照7-5的T₀代植株。對T₁代進(jìn)一步的選擇按照以下原則：①單價Bt基因穩(wěn)定遺傳的純合株系：②抗蟲表型穩(wěn)定有效：③與7-5相比沒有明顯的表型變異，產(chǎn)量和品質(zhì)不受影響。將純合的單價抗蟲Cry1C和Cry2A轉(zhuǎn)基因植株雜交獲得雙價轉(zhuǎn)基因油菜，其中以Cry1C為母本獲得的聚合油菜抗蟲性優(yōu)于以Cry2A為母本獲得的聚合油菜，這一結(jié)果與單價抗蟲Cry1C基因轉(zhuǎn)化所得的抗性高于轉(zhuǎn)化Cry2A基因植株的抗蟲性相一致，證明了Cry1C轉(zhuǎn)基因植株作為母本傳遞核物質(zhì)有著母體效應(yīng)。

3.2 Bt基因聚合的重要性以及有性雜交聚合的優(yōu)勢

本試驗在甘藍(lán)型油菜7-5中導(dǎo)入兩個Bt基因，若2種毒素能夠識別有差異的受體，那么昆蟲對他們同時產(chǎn)生抗性的幾率會降低。因為2種與昆蟲類受體結(jié)合的毒蛋白同時失效的可能性不大，雙價Bt抗蟲轉(zhuǎn)基因植株能夠有效地延遲抗性失效的時間。在大田環(huán)境下，油菜容易遭受多種蟲害危害，聚合多個Bt基因能夠產(chǎn)生很好的防控作用，同時可以有效延緩抗性品種的應(yīng)用時間。在美國和澳大利亞等國家主要采用高劑量和庇護(hù)所同時種植，即大田環(huán)境下種植Bt作物的同時需要種植一些非轉(zhuǎn)基因的植株來維持一定數(shù)量的敏感昆蟲個體。那么雙價Bt作物所需要的庇護(hù)所比例較小，可以將經(jīng)濟(jì)損失降到很低。但是中國的種植制度、農(nóng)戶規(guī)模以及靶標(biāo)害蟲等社會和生態(tài)環(huán)境不同，這種高劑量庇護(hù)所策略在中國推廣實施較困難，因而通過雙價或者多價基因聚合更符合國情需求。

在本試驗中通過有性雜交的方式進(jìn)行基因聚合，首先分別獲得純合的單價Bt轉(zhuǎn)基因家系，將它們雜交后再次選擇純合株系。這個過程中需要對兩個隨機(jī)插入到基因組的Bt基因同時進(jìn)行標(biāo)記篩選，經(jīng)歷的時間長工作量大。但這種方法在實際育種材料的改良應(yīng)用中存在著一定優(yōu)勢，首先將現(xiàn)有的多個育種材料作為受體進(jìn)行單價Bt基因轉(zhuǎn)化，獲得變異小抗性和農(nóng)藝性狀穩(wěn)定優(yōu)良的家系，之后可以根據(jù)不同育種需求將含有單價Bt基因的材料自由組配，實現(xiàn)父母本家系的優(yōu)勢互補(bǔ)，改良產(chǎn)量、品質(zhì)等性狀，從而提高獲得理想材料的機(jī)會，這樣可以避免對每個組合進(jìn)行雙價或者多價基因的遺傳轉(zhuǎn)化。

3.3 雙價Bt抗蟲轉(zhuǎn)基因葉片中Cry1C蛋白含量與單價Cry1C蛋白的差異

本試驗中單價抗蟲基因Cry1C和Cry2A都是在來源于玉米的組成型啟動子Ubiquitin promoter作用下實現(xiàn)表達(dá)的。盡管這兩個Bt基因在序列上沒有極高的相似性，但是二者聚合后由于啟動子的完全同源會引起基因沉默導(dǎo)致抗蟲基因表大量下降。對Cry1C蛋白含量檢測發(fā)現(xiàn)，雙價轉(zhuǎn)基因家系中蛋白濃度普遍低于單價Cry1C轉(zhuǎn)基因植株。在實際應(yīng)用中采用不同的啟動子，如CaMV35S和Actin作用聚合不同的Bt基因表達(dá)可以降低聚合后基因表達(dá)量下降以及基因沉默失效的機(jī)率。另外，組成型表達(dá)的啟動子在植物的各個器官表達(dá)勢必造成能量的消耗而產(chǎn)生代謝損耗，并且種子中Bt蛋白的含量高會引發(fā)消費者對轉(zhuǎn)基因食品安全的質(zhì)疑。因此，利用組織特異啟動子，如水稻rbcS（1，5-二磷酸羧化酶或者加氧酶的小亞基）啟動子驅(qū)動Bt抗蟲基因在葉片、莖稈組織中特異表達(dá)可以提高抗蟲的有效性。Bt基因持久高效的表達(dá)會影響植株的其余性狀的變異，如株高、育性等。增加對田間昆蟲的選擇壓。加速昆蟲的抗性變異，最終導(dǎo)致植物抗性喪失。因此。選擇農(nóng)藝和品質(zhì)性狀變異少。抗蟲性優(yōu)良而Bt蛋白含量較低的轉(zhuǎn)基因家系應(yīng)用于大田可以有效地避免上述問題，