張旻 杭曉敏

益生菌活菌計(jì)數(shù)方法現(xiàn)狀

隨著益生菌功能研究的深入，益生菌越來越多地應(yīng)用于食品和保健食品中， “活菌數(shù)”是保證其相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)。提高益生菌活菌計(jì)數(shù)方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性，可以為企業(yè)生產(chǎn)過程中對(duì)益生菌相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量的控制、提升食品質(zhì)量安全水平提供技術(shù)支撐，同時(shí)可以更好地應(yīng)用于監(jiān)管部門的專項(xiàng)抽查、風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)控、執(zhí)法檢驗(yàn)等活動(dòng)中。

目前較普遍使用的益生菌活菌計(jì)數(shù)方法是參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.35-2010 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》。（1）食品用乳酸菌主要分為兩大類：一類是食品加工用乳酸菌；第二類是具有健康功能的活的乳酸菌，又稱益生菌。與食品加工用乳酸菌特征指標(biāo)不同的是，益生菌產(chǎn)品的活菌數(shù)通常都很高，可達(dá)到100億至1000億以上，而冷凍干燥菌粉原料中活菌數(shù)甚至可達(dá)到1000億至10000億，且生產(chǎn)日活菌添加量與保質(zhì)期內(nèi)活菌穩(wěn)定性通常是益生菌產(chǎn)品最關(guān)鍵的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和功效指標(biāo)，也是衡量益生菌原料與終端產(chǎn)品市場價(jià)值最核心與關(guān)鍵的因素?，F(xiàn)行國標(biāo)在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行高活菌密度、某些特殊劑型及配方或含有某些新菌種的益生菌產(chǎn)品的活菌計(jì)數(shù)時(shí)，常常出現(xiàn)結(jié)果不穩(wěn)定或檢驗(yàn)結(jié)果明顯低于生產(chǎn)時(shí)活菌添加量的情況。

影響計(jì)數(shù)結(jié)果最主要的影響因素包括稀釋液和計(jì)數(shù)培養(yǎng)基。樣品稀釋時(shí)，三個(gè)因素對(duì)活菌的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)影響最大：稀釋比例、稀釋液組成和pH值。綜述前人的研究經(jīng)驗(yàn)（2）：樣品制備的稀釋比例為1：5-1：10；稀釋后樣品懸液的pH值最好與最佳生長pH值一致；因益生菌具有氧敏感性，稀釋液中應(yīng)該含有抗氧化劑。日本研究者M(jìn)asamichi MUTO和Fumiaki ABE等（2010年）在研究了多種稀釋液配方后認(rèn)為，Mitsuokas緩沖液適用于含有嚴(yán)格厭氧的雙歧桿菌活菌產(chǎn)品的稀釋，該緩沖液含有磷酸鹽、半胱氨酸和吐溫80，前2個(gè)成分分別具有緩沖能力、抗氧化能力，而吐溫80則可改善產(chǎn)品在稀釋液中的分散能力。

（3）目前國標(biāo)方法選用的培養(yǎng)基如下：以MRS瓊脂（厭氧）為總?cè)樗峋?jì)數(shù)培養(yǎng)基；在含有多菌種的產(chǎn)品中，以添加有莫匹羅星抗生素的MRS瓊脂（厭氧）作為雙歧桿菌選擇性計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，以MC瓊脂（需氧）為嗜熱鏈球菌選擇性計(jì)數(shù)培養(yǎng)基，以總?cè)樗峋鷶?shù)減去雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌數(shù)為乳桿菌數(shù)。但是，近年來，綜述多個(gè)研究結(jié)果（2，3），RCM培養(yǎng)基可提高冷凍干燥雙歧桿菌的活菌計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。此外，本實(shí)驗(yàn)室多年來采用GB 4789.34-2003 《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 雙歧桿菌檢驗(yàn)》（4）中推薦的TPY瓊脂培養(yǎng)基用于乳酸菌的計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)其用于益生菌產(chǎn)品的活菌計(jì)數(shù)結(jié)果較穩(wěn)定。

為此，本研究比較了兩種稀釋液及幾種計(jì)數(shù)培養(yǎng)基對(duì)兩類代表性益生菌產(chǎn)品（冷凍干燥活菌粉原料和益生菌顆粒產(chǎn)品）活菌計(jì)數(shù)結(jié)果的影響，以確定更符合益生菌產(chǎn)品特點(diǎn)的活菌計(jì)數(shù)方法。

材料和方法

試劑及培養(yǎng)基。生理鹽水；Mitsuokas緩沖液（6.0 g Na2HPO4，4.5 g KH2PO4，0.5g L-半胱氨酸鹽酸鹽，0.5 g 吐溫 80，1000mL蒸餾水）；MRS瓊脂、TPY瓊脂（青島海博）；RCM瓊脂（OXOID）。

改良MRS、改良TPY和改良RCM瓊脂分別為添加有50?g/ml 莫匹羅星鋰鹽（青島海博）。

樣品。所用樣品為嗜酸乳桿菌LA11-ONLLY冷凍干燥活菌粉（3000億CFU/g）、長雙歧桿菌BL88-ONLLY冷凍干燥活菌粉（3000億 CFU/g）和昂立1號(hào)益生菌顆粒（國食健字G20060027）產(chǎn)品，均來自上海交大昂立股份有限公司，各選取三個(gè)批號(hào)的樣品進(jìn)行平行檢驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)方法。稱取 2.00g±0.01g 樣品，分別至18ml生理鹽水或Mitsuokas緩沖液中，均質(zhì)1 min， 靜置5 min，分別用生理鹽水或Mitsuokas緩沖液梯度稀釋至合適濃度。

乳桿菌菌粉計(jì)數(shù)。以MRS、TPY瓊脂培養(yǎng)基，分別置于37℃厭氧、好氧條件下培養(yǎng)48-72小時(shí)，比較不同稀釋液和培養(yǎng)基對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果的影響。

雙歧桿菌菌粉計(jì)數(shù)。以MRS、TPY和RCM瓊脂培養(yǎng)基，分別置于37℃厭氧培養(yǎng)48-72小時(shí)，比較不同稀釋液和培養(yǎng)基對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果的影響。

冷凍干燥活菌粉的計(jì)數(shù)結(jié)果

乳桿菌冷凍干燥菌粉。由于乳桿菌為兼性厭氧菌，在好氧和厭氧條件下均可生長，本研究以生理鹽水或Mitsuokas緩沖液為菌粉稀釋液，以MRS或TPY為培養(yǎng)基，分別在好氧和厭氧進(jìn)行培養(yǎng)。三批嗜酸乳桿菌LA11-ONLLY菌粉采用不同方法計(jì)數(shù)的結(jié)果見表1和圖1。

從結(jié)果看出，培養(yǎng)方式對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果影響很??；而稀釋液對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果有顯著影響。用生理鹽水稀釋和用Mitsuokas緩沖液稀釋后計(jì)數(shù)結(jié)果分別為3.95×1011 cfu/g和4.47×1011 cfu/g，用生理鹽水作為稀釋液可檢出的活菌僅為Mitsuokas緩沖液的87%。

益生菌顆粒長雙歧桿菌選擇性計(jì)數(shù)。用Mitsuokas緩沖液溶解后，以改良MRS、改良TPY和改良RCM厭氧培養(yǎng)，并與國標(biāo)比較，結(jié)果見表5。以改良RCM結(jié)果為100%， 改良TPY結(jié)果為96%左右，而改良MRS結(jié)果只有71%左右。可見，MRS不適于長雙歧桿菌的活菌計(jì)數(shù)，RCM或TPY更適合。國標(biāo)方法（生理鹽水/改良MRS培養(yǎng)基）的計(jì)數(shù)結(jié)果僅為59%左右，推薦使用Mitsuokas緩沖液、改良TPY或改良RCM培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)進(jìn)行益生菌顆粒產(chǎn)品長雙歧桿菌選擇性計(jì)數(shù)。

益生菌顆粒嗜酸乳桿菌選擇性計(jì)數(shù)。用國標(biāo)方法（生理鹽水/ MRS厭氧培養(yǎng)總數(shù)減去改良MRS厭氧培養(yǎng)數(shù)）、Mitsuokas緩沖液/MRS/好氧培養(yǎng)、Mitsuokas緩沖液/TPY/好氧培養(yǎng)方法進(jìn)行選擇性計(jì)數(shù)，結(jié)果見表6。以Mitsuokas緩沖液/TPY/好氧培養(yǎng)方法計(jì)數(shù)結(jié)果為100%， Mitsuokas緩沖液/MRS/好氧培養(yǎng)結(jié)果約為95%，而國標(biāo)方法結(jié)果僅為55%。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推薦使用Mitsuokas緩沖液、MRS或TPY好氧條件下進(jìn)行益生菌顆粒中嗜酸乳桿菌選擇性計(jì)數(shù)。

雙歧桿菌冷凍干燥菌粉。雙歧桿菌與乳桿菌不同，為嚴(yán)格厭氧菌，僅在厭氧條件下生長。分別考察兩種稀釋液和三種培養(yǎng)基對(duì)長雙歧桿菌BL88-ONLLY菌粉計(jì)數(shù)結(jié)果的影響，結(jié)果見表2。

從表2結(jié)果可見，菌粉稀釋液和培養(yǎng)基均對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果產(chǎn)生了顯著影響，Mitsuokas緩沖液與RCM瓊脂組合檢出的活菌數(shù)最高，以此為100%，那么Mitsuokas緩沖液與MRS和TPY組合的計(jì)數(shù)結(jié)果分別為36%和98%；而用生理鹽水，MRS、TPY和RCM計(jì)數(shù)結(jié)果僅分別25%、76%和78%，生理鹽水作為稀釋液對(duì)活菌細(xì)胞影響較大，會(huì)影響計(jì)數(shù)結(jié)果。

益生菌顆粒計(jì)數(shù)結(jié)果

稀釋液對(duì)pH值的影響。對(duì)昂立1號(hào)?益生菌顆粒連續(xù)3個(gè)批號(hào)，分別采用生理鹽水和Mitsuokas緩沖液溶解并測定pH值，結(jié)果見表3。生理鹽水稀釋液pH值為4.41，而Mitsuokas緩沖液組的為6.56。可見，稀釋液對(duì)樣品勻液的pH值影響較大。

益生菌顆?？?cè)樗峋?jì)數(shù)。采用生理鹽水和Mitsuokas緩沖液進(jìn)行樣品稀釋，分別以MRS、TPY和RCM厭氧培養(yǎng)進(jìn)行總?cè)樗峋?jì)數(shù)，結(jié)果見表4。Mitsuokas緩沖液與RCM組合的計(jì)數(shù)結(jié)果記為100%，則MRS和TPY的結(jié)果分別為85%和98%，而用生理鹽水時(shí)三種培養(yǎng)基結(jié)果分別為60%、74%和72%，這表明，MRS用于乳桿菌和雙歧桿菌復(fù)配產(chǎn)品的總?cè)樗峋?jì)數(shù)時(shí)，結(jié)果偏低，Mitsuokas緩沖液、TPY和RCM培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)更適用于本產(chǎn)品中總?cè)樗峋?jì)數(shù)。

討論

推薦用于冷凍干燥活菌粉的稀釋液和培養(yǎng)基。稀釋液對(duì)結(jié)果的影響可能是由于高密度菌粉本身呈酸性，若菌粉稀釋液呈酸性，可能會(huì)對(duì)細(xì)胞造成傷害，而Mitsuokas緩沖液添加了磷酸鹽作為緩沖體系以及吐溫80作為細(xì)胞膜表面活性劑，可以保護(hù)細(xì)胞在溶解復(fù)水過程中免受損害。經(jīng)過本實(shí)驗(yàn)，推薦Mitsuokas緩沖液作為冷凍干燥活菌粉的菌粉和梯度稀釋液；推薦MRS和TPY瓊脂好氧培養(yǎng)用于乳桿菌冷凍干燥活菌粉的計(jì)數(shù)；推薦TPY和RCM瓊脂厭氧培養(yǎng)用于雙歧桿菌冷凍干燥活菌粉的計(jì)數(shù)。

推薦用于益生菌產(chǎn)品的稀釋液和培養(yǎng)基。Mitsuokas緩沖液比生理鹽水更適合用于該活菌產(chǎn)品的稀釋。益生菌顆粒為乳桿菌與雙歧桿菌及其它輔料復(fù)配而成的產(chǎn)品。本研究推薦用TPY或RCM在厭氧條件下檢驗(yàn)總?cè)樗峋鷶?shù)，采用MRS或TPY在好氧條件下檢驗(yàn)嗜酸乳桿菌數(shù)，采用以莫匹羅星鋰鹽改良的TPY或改良RCM在厭氧條件下檢驗(yàn)長雙歧桿菌數(shù)。

結(jié)論

通過比較研究，發(fā)現(xiàn)Mitsuokas緩沖液更適用于益生菌活菌樣品溶解與梯度稀釋。對(duì)乳桿菌活菌粉，推薦采用MRS或TPY于好氧或厭氧條件下計(jì)數(shù)；對(duì)雙歧桿菌活菌粉，推薦采用TPY或RCM于厭氧條件下計(jì)數(shù)；對(duì)乳桿菌和雙歧桿菌混合復(fù)配產(chǎn)品，推薦采用TPY或RCM于厭氧條件下進(jìn)行總?cè)樗峋?jì)數(shù)，采用莫匹羅星鋰鹽改良的TPY或改良RCM于厭氧條件下進(jìn)行雙歧桿菌選擇性計(jì)數(shù)，采用MRS或TPY于好氧條件下進(jìn)行嗜酸乳桿菌選擇性計(jì)數(shù)。

（作者單位：上海交大昂立股份有限公司）