徐啟華 賀蓉 彭博 葉祖光 李建榮 張躍飛 代志

[摘要]觀察999感冒靈全方中中藥組分與化學藥組分配伍后在藥效學作用上的協同作用，并研究其作用機制。分別在冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增加、二甲苯致小鼠耳腫脹和角叉菜膠致大鼠胸膜炎非特異性炎癥模型和酵母菌致大鼠發(fā)熱模型和肺炎克雷白桿菌細菌生物被膜（Klebsiellar pneumonia，KPN）模型上，比較感冒靈全方、化學藥組分和中藥組分的抗炎、解熱作用的異同。結果顯示，與模型組比較，感冒靈全方組小鼠伊文思藍滲出量明顯減少，小鼠的耳腫脹度明顯減小，化學藥組分和中藥組分組均未見顯著性差異；感冒靈全方組、化學藥組分組、中藥組分組大鼠胸腔滲出液TNFα和IL1β濃度明顯降低，感冒靈全方組大鼠血清TNFα，IL1β和IL8，化學藥組分組大鼠血清TNFα，IL8和中藥組分大鼠血清IL8濃度明顯降低；感冒靈全方組和化學藥組分組大鼠分別于藥后4～8 h體溫升高值明顯減小，中藥組分組大鼠的體溫升高值無明顯差異。感冒靈全方在55～1375 g·L-1、中藥組分在45～225 g·L-1、西藥組分在10 g·L-1時可顯著降低細菌生物被膜的活菌量。掃描電鏡顯示，感冒靈全方（55 g·L-1）和西藥組分（10 g·L-1）可破壞KPN生物被膜，中藥組分（45 g·L-1）可在一定程度上破壞KPN生物被膜。結果表明，感冒靈全方具有明顯的抗炎和解熱作用，對成熟KPN生物被膜具有破壞作用。感冒靈化學藥組分和中藥組分在抗炎和抑制成熟KPN生物被膜內活菌量方面顯示明顯的協同作用，但在解熱方面未觀察到明顯的協同作用。

[關鍵詞]999感冒靈；炎癥；炎性因子；肺克雷白桿菌（KPN）；細菌生物被膜

[Abstract]To observe synergistic effects of 999 Ganmaoling （GML） and its Chinese/Western materia medica （CMM and WMM） on pharmacodynamic action and to study underlying mechanisms， their antiinflammatory， antipyretic effects were compared by assaying the increased capillary permeability induced by glacial acetic acid in mice， ear swelling induced by Xylene in mice， nonspecific pleurisy induced by carrageenan in rats， and yeast induced fever in rats Crystal violet （CV） and microbial activity （XTT） assay were used to evaluate the inhibition of GML and its CMM and WMM on KPN biofilm formation， and scanning electron microscopy （SEM） was applied for observing KPN biofilm morphology changes The results showed that compared with control group， GML could reduce exudation amount of EvansBlue and the degree of Ear swelling significantly， and CMM and WMM have no significant effects The concentration of TNFα and IL1β of rat pleural effusion in GML， CMM and WMM group decreased significantly The concentration of TNFα， IL1β and IL8 in GML group， TNFα， IL8 in WMM group and IL8 in CMM in rats serum decreased significantly The body temperature in rats decreased significantly in GML and WMM group after 48 h of administration CMM group showed no significant difference in rat body temperature compare with control Compared with control group， GML （551375 g·L-1） could inhibit KPN biofilm formation and reduce number of viable cells in the KPN biofilm CMM （45225 g·L-1） and WMM （10 g·L-1） could also inhibit KPN biofilm formation and reduce number of viable cells （P<001） Result of SEM also showed that GML （55 g·L-1） and its CMM （45 g·L-1） and WMM （10 g·L-1） could interfere the bacterial arrangement of KPN biofilm and extracellular matrix GML and its CMM &WMM could inhibit the formation of KPN biofilm， CMM &WMM in GML showed synergism and complementation in inhibit KPN biofilm Results showed that GML had obvious antiinflammatory and antipyretic effects and could destruct KPN mature biofilm WMM and CMM showed obvious synergistic effect against inflammation and inhibition of KPN biofilm formation and reduction of number of viable cells but no same effects against fever

[key words]999 Ganmaoling； inflamation； inflammatory cytokines； Klebsiella bacillus（KPN）； bacterial biofilm

doi：10.4268/cjcmm20160805

999感冒靈顆粒是由中藥和化學藥配伍組成的中西藥復方制劑，其中中藥部分有三叉苦、崗梅、金盞銀盤、薄荷油、野菊花等4味中藥；化學藥部分則有馬來酸氯苯那敏、咖啡因、對乙酰氨基酚等3種化學藥。它臨床用于治療感冒引起的頭痛、發(fā)熱、鼻塞、流涕、咽痛等上呼吸道感染癥狀。組方中中藥多為嶺南地區(qū)習用清熱解毒類中藥，組方中化學藥組分也是治療上呼吸道感染的常用的化學藥主要成分，該方取中、西藥的優(yōu)勢配伍用藥，并大幅降低了對乙酰氨基酚等化學藥的用量。本文觀察其中、西藥組分配伍用藥的合理性，在抗炎、解熱和對成熟KPN生物被膜內活菌量及形態(tài)方面是否具有協同作用。

1材料

999感冒靈全方（批號20130409002），999感冒靈顆粒中藥干膏粉（批號2013040901），對乙酰氨基酚（批號1040867），咖啡因（批號TC2011022），馬來酸氯苯那敏（批號110434）（華潤三九醫(yī)藥股份有限公司）；阿司匹林（北京曙光藥業(yè)有限責任公司生產，批號090508）；泰諾（酚麻美敏片）（上海強生制藥有限公司生產，批號121030823）。

肺炎克雷伯桿菌（Klebsiella pneumonia，KPN）臨床株從湖北中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院呼吸道患者痰液中分離、純化，并經Vitck 32全自動微生物鑒定/藥敏分析儀鑒定，實驗編號HB6。

角叉菜膠（Sigma，批號021M0038V）；冰醋酸（天津市華東試劑廠，批號20091228）；伊文思藍（國藥集團化學試劑有限公司，批號71016588）；IL1放免試劑盒（批號0423），IL6放免試劑盒（批號0520），IL8放免試劑盒（批號201405）（北京北方生物技術研究所）；胰蛋白胨，酵母提取物（英國OXOID公司）；硫酸卡那霉素，二甲基亞砜（DMSO），XTT，PMS，結晶紫（Sigma）；氯化鈉，葡萄糖，乙醇（國藥集團化學試劑有限公司）。

Varioskan Flash多功能酶標儀（美國Thermo公司）；J6B型離心機（美國Beckman公司）；Xh6080放免儀（西安核儀廠）；ELX50自動洗板機（美國伯騰）；HWS150恒溫恒濕培養(yǎng)箱（上海森信）；MLS3750高壓滅菌鍋（日本三洋）；Sky110恒溫震蕩培養(yǎng)箱（上海蘇昆）；V1100分光光度計（上海美譜達）；iMark酶標儀（美國伯樂）；SU1510掃描電子顯微鏡（日本日立）；Cressington 108離子濺射儀（英國）。

小鼠，ICR種，雄性，體重18～20 g，或25～30 g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK（京）20120001。大鼠，SD種，雄性，體重150～170 g，或180～200 g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號SCXK（京）20120001。飼養(yǎng)條件：中國中醫(yī)科學院醫(yī)學實驗動物中心動物房，實驗設施許可證SYXK（京）20100034。屏障系統(tǒng)，人工光照，12 h明暗周期，溫度控制在20～26 ℃，相對濕度控制范圍為40%～70%，換氣次數不少于15次/h。

2方法

21抗炎作用

211對冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增加的影響60只小鼠按體重隨機分成6組，即正常對照組、模型組、陽性對照藥阿司匹林組、感冒靈全方組、感冒靈化學藥組、感冒靈中藥組。除正常對照組和模型組外，其他各組按劑量灌胃給予相應的藥物，其中感冒靈全方組給予1543 g（生藥）·kg-1，感冒靈化學藥組給予019 g·kg-1，感冒靈中藥組給予1538 g（生藥）·kg-1，阿司匹林組給予008 g·kg-1。連續(xù)給藥3 d，1次/d。在給藥第3天，藥后30 min于動物腹腔注射1%醋酸，001 mL·g-1，30 min后于小鼠尾靜脈注射05%伊文思藍，002 mL·g-1，20 min后脫頸椎處死小鼠，將2 mL生理鹽水注入腹腔，輕柔腹部30次后，收集腹腔液，再用4 mL生理鹽水分2次洗滌腹腔，每次2 mL，分別收集腹腔液，合并3次的腹腔液后定容至8 mL；將腹腔液經3 000 r·min-1離心15 min，取上清液用多功能酶標儀在590 nm處比色，讀取吸光度（A）；并以不同濃度的伊文思藍為標準，繪制標準曲線，計算小鼠腹腔液中伊文思藍含量，對各組動物伊文思藍滲出量進行比較。

212對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響50只小鼠按體重隨機分成5組，即模型組、阿司匹林組、感冒靈全方組、感冒靈化學藥組、感冒靈中藥組。除模型組外，其他各組按劑量灌胃給予相應的藥物，其中感冒靈全方給予1543 g（生藥）·kg-1，感冒靈化學藥組給予019 g·kg-1，感冒靈中藥組給予1538 g（生藥）·kg-1，阿司匹林組給予008 g·kg-1。連續(xù)給藥3 d。在給藥第3天，末次給藥1 h后，將二甲苯涂于小鼠左耳前后兩面，004 mL/只，制備耳腫脹模型，以右耳為對照。致炎后4 h，將小鼠斷頸處死，沿耳廓基線剪下左右兩耳，用9 mm直徑打孔器分別在同一部位打下耳片，用組織天平稱重。每鼠的左耳片質量減去右耳片質量即為腫脹程度。計算并比較各給藥組的腫脹抑制率。

213對角叉菜膠致大鼠胸膜炎的影響60只大鼠按體重隨機分成6組，即假手術組、模型組、阿司匹林組、感冒靈全方組、感冒靈化學藥組、感冒靈中藥組。除假手術組、模型組外，其余各組動物按劑量給予相應的藥物，其中感冒靈全方組給予1070 g（生藥）·kg-1，感冒靈化學藥組給予013 g·kg-1，感冒靈中藥組給予1050 g（生藥）·kg-1，阿司匹林組給予006 g·kg-1，假手術組、模型組給予等量的蒸餾水。連續(xù)給藥4 d，1次/d。于第3天給藥30 min后，除假手術組外，其余動物胸腔注射1%角叉菜膠，02 mL/只，制備急性胸膜炎模型。假手術組注入等量生理鹽水。第4天給藥30 min后，即注射角叉菜膠后18 h，將大鼠麻醉，腹主動脈取血，收集血清。并用剪刀將右側胸腔肋軟骨處剪開一小口，從該口向胸腔注入1 mL Hanks溶液（含肝素20 U·mL-1），輕柔按摩胸腔，然后用吸管由小口處吸出液體。將收集的灌洗液3 000 r·min-1離心15 min，取上清液，凍存。采用放射免疫方法檢測大鼠血清中的TNFα，IL1β，IL8，IL6和胸膜腔滲出液中IL1β，IL8，TNFα含量。

22解熱作用

50只大鼠，實驗前1 d和實驗當天早上測肛溫2次，取2次平均值作為大鼠的基礎體溫。按基礎體溫隨機分為5組，即模型組、泰諾組、感冒靈全方組、化學藥組、中藥組。每組10只。除模型組外，各給藥組動物按劑量灌胃給予相應的藥物，其中感冒靈全方組給予1200 g（生藥）·kg-1，感冒靈化學藥組給予014 g·kg-1，感冒靈中藥組給予1200 g（生藥）·kg-1，泰諾組給予106 g·kg-1，模型組給予等量的蒸餾水，連續(xù)給藥3 d。給藥第3天，藥后各組大鼠立即于背部皮下注射20%酵母菌懸液（10 mL·kg-1），造模后4 h再給藥1次。于藥后4，5，6，7，8，9 h對各組大鼠的體溫進行測定，計算體溫升高值，比較組間差異。

23對KPN成熟生物被膜內活菌量的抑制作用

231藥液及培養(yǎng)基的配制稱取999感冒靈全方11 g，加入LB培養(yǎng)基10 mL，配制成110 g·L-1藥液，022 μm微孔濾膜過濾除菌，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩０凑?99感冒靈中藥組分及西藥組分在全方中比例，分別稱取999感冒靈中藥組分09 g、西藥組分02 g，加入LB培養(yǎng)基10 mL，配制成90，20 g·L-1藥液，022 μm微孔濾膜過濾除菌，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，其中西藥組分溶液中含適量DMSO。精密稱取硫酸卡那霉素加入適量LB培養(yǎng)基，溶解后配制成160 mg·L-1溶液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

232KPN培養(yǎng)及成熟生物被膜模型建立選取單個KPN菌落接種于LB 培養(yǎng)基，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。參考文獻[5]方法建立細菌生物被膜模型，用含05%葡萄糖的LB培養(yǎng)基調整KPN菌液濃度為A600=005，接種于96 孔板，37 ℃培養(yǎng)24 h，形成成熟的KPN生物被膜。

233微孔板法檢測999感冒靈全方及其組方對成熟KPN生物被膜的影響按22項下方法在96 孔板中培養(yǎng)出成熟生物被膜后，吸出孔內菌液，加入無菌水洗去殘留細菌與培養(yǎng)基，分別加入倍比稀釋的999感冒靈全方（終濃度55～043 g·L-1）、999感冒靈中藥組分（終濃度45～035 g·L-1）、999感冒靈西藥組分（終濃度10～008 g·L-1）和硫酸卡那霉素（ 終濃度40～031 g·L-1），空白對照組（control） 加入等量LB培養(yǎng)基，溶劑對照組則按照999感冒靈西藥組各濃度梯度中所含DMSO濃度分別加入等量含DMSO的LB培養(yǎng)基，每組3個復孔，放入37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

參考文獻[1]，分別進行CV和XTT染色。其中，CV檢測適用于測定全部生物被膜，包括活菌、死菌及胞外基質，染色方法：藥物作用24 h后，吸去上清，用09%生理鹽水清洗2次，洗去懸浮細菌，每孔加入04% CV溶液200 μL，室溫下靜置10 min；09%生理鹽水清洗2次，去除未結合的CV；每孔加入200 μL無水乙醇溶液溶解結晶紫，酶標儀在595 nm處讀取吸光度（A）；XTT檢測適用于測定生物被膜中活菌量，染色方法：藥物作用24 h后，吸去上清，每孔加入160 μL LB培養(yǎng)液，然后加入40 μL XTTPMS溶液（WSTPMS 9∶1），37 ℃孵育2 h，酶標儀在450 nm處讀取吸光度（A），校正波長655 nm。

234感冒靈全方及其組方對成熟KPN生物被膜影響的形態(tài)觀察24孔板中放入已經滅菌的蓋玻片作為載體，按照22項下方法培養(yǎng)成熟KPN生物被膜，使生物被膜生長于玻璃片上，吸取上清，洗去懸浮細菌，分別加入2 mL 999感冒靈全方組（終濃度55 g·L-1）、999感冒靈中藥組分（終濃度45 g·L-1）、999感冒靈西藥組分（終濃度10 g·L-1）和硫酸卡那霉素組（終濃度40 mg·L-1），空白對照組加入等量LB培養(yǎng)基，溶劑對照組參考等濃度999感冒靈西藥組所含DMSO濃度加入，置37 ℃培養(yǎng)24 h。樣本用PBS 清洗2次，洗掉懸浮細菌，25%戊二醛固定，梯度乙醇逐級脫水，真空冷凍干燥、噴金，掃描電子顯微鏡下觀察，拍照。

24統(tǒng)計方法

數據均以±s表示，多組間比較采用SPSS 130單因素方差分析比較組間差異。

3結果

31對冰醋酸致小鼠腹腔毛細血管通透性增加的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠腹腔伊文思藍的滲出量明顯增加（P<001），說明造模成功；與模型組比較，阿司匹林組和感冒靈全方組小鼠的伊文思藍滲出量明顯減少（P<005），差異顯著；化學藥和中藥組小鼠的伊文思藍滲出量雖有所減少，但無顯著性差異（表1）。

32對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響

與模型組比較，感冒靈全方組和阿司匹林組小鼠的耳腫脹度明顯減?。≒<005），腫脹抑制率分別為387%，351%；化學藥和中藥組小鼠的耳腫脹度雖有所減小，但無顯著性差異，其腫脹抑制率分別為264%，158%（表2）。

33對角叉菜膠致大鼠胸膜炎的影響

與假手術組比較，模型組大鼠胸腔滲出液中TNFα和IL1β含量、血清中TNFα，IL1β，IL8，IL6含量明顯升高（P<001或P<005）；與模型組比較，阿司匹林組、感冒靈全方組、化學藥組、中藥組大鼠胸腔滲出液TNFα和IL1β含量明顯降低（P<001或P<005）；阿司匹林組和感冒靈全方組大鼠胸腔滲出液IL8含量雖有降低趨勢，但無顯著性差異（表3）。

34對酵母菌致大鼠發(fā)熱的影響

與模型組比較，感冒靈全方組、泰諾組、化學藥組大鼠體溫在藥后5～8 h均明顯降低（P<001），藥后4～8 h體溫升高值也明顯減?。≒<001）；中藥組大鼠體溫未見明顯差異（表5，6）。

35對成熟KPN生物被膜的影響

351生物膜內活菌量與空白對照組比較，硫酸卡那霉素在40～0081 mg·L-1均不能降低成熟KPN生物被膜中的總菌量和活菌量，差異無統(tǒng)計學意義；感冒靈全方在55～043 g·L-1也不能降低生物被膜內總菌量，差異無統(tǒng)計學意義；但在55～1375 g·L-1可顯著降低生物被膜內活菌量，具有統(tǒng)計學意義（P<001， P<005）；感冒靈中藥組分在45～035 g·L-1也不能減少生物被膜內總菌量；但在45～225 g·L-1可顯著減少生物被膜內活菌量（P<001）；感冒靈西藥組方僅在10 g·L-1時降低生物被膜內活菌量（P<001），但對生物被膜內總菌量無降低作用；DMSO溶劑對照液在10個濃度范圍內也均不能減少生物被膜內總菌量和活菌量（圖1，2）。結果提示，一旦KPN細菌生物膜成熟，硫酸卡那霉素對生物膜內細菌不能產生任何抑制作用；而感冒靈全方及中、西藥組分則均可在一定程度上對生物膜內的活菌產生抑制作用。

藥物質量濃度單位mg·L-1。

圖1999感冒靈及其中、西藥組分對KPN細菌生物被膜成熟過程中總菌量的影響（CV法）

Fig1The effects of GML， CMM and WMM on total bacterial number in the process of KPN bacterial biofilm maturation

藥物質量濃度單位mg·L-1；與空白對照組比較**P<001，*P<005。

圖2999感冒靈及其中、西藥組分對KPN細菌生物被膜成熟過程中活菌量的影響（XTT法）

Fig2The effects of GML， CMM and WMM on live bacterial number in the process of KPN bacterial biofilm maturation

352掃描電子顯微鏡觀察空白對照組細菌相互聚結、成團塊樣，菌體表面可見清晰的膜樣結構、表面粗糙，菌體間分布大量黏液樣物質；硫酸卡那霉素組（40 mg·L-1）細菌聚集成團塊狀，菌體表面粗糙，也可見清晰的膜樣結構存在，菌體間也可見黏液樣物質，與空白對照組細菌形態(tài)、結構相似；999感冒靈全方組（55 g·L-1）細菌排列相對松散，菌體表面較為光滑，基本觀察不到膜樣結構，菌體間基本觀察不到黏液樣物質分布；999感冒靈中藥組分（45 g·L-1）可見部分菌體表面較光滑，但仍可在部分菌體表面觀察到較為清晰的膜樣結構存在，菌體間有少量的黏液樣物質分布；999感冒靈西藥組分（10 g·L-1）細菌呈團塊狀，但菌體表面較為光滑，菌體間有少量的黏液樣物質分布，部分菌體呈現球形變；DMSO溶劑對照組菌體結構與空白對照組接近，菌體表面可見清晰膜樣結構存在，菌體間有大量黏液樣物質分布（圖3）。結果提示，硫酸卡那霉素對成熟KPN細菌生物膜結構并無任何影響，而999感冒靈全方及中、西藥組方均可在一定程度上產生破壞KPN成熟生物膜結構的作用。

4討論

感冒是由病毒或細菌引起的上呼吸道炎癥。炎癥是機體對損傷因子所發(fā)生的一種特異防御反應。炎癥有急性和慢性炎性反應之分，感冒的炎癥主要是急性炎癥反應，為使實驗結果更接近臨床情況，本實驗采用3種常用的急性炎癥模型[2]比較感冒靈全方與其組方中相同劑量化學藥和中藥組分的抗炎作用。由于細胞因子在炎癥的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用，故在試驗中也比較研究了上述藥物對炎性因子的影響，并結合細菌生物被膜研究方法，評價其抗菌作用特點。

41對非特異性炎癥及其炎性因子的抑制作用

實驗結果顯示，在腹腔毛細血管通透性增加小鼠模型上，感冒靈化學藥組分和中藥組分均不能有效降低小鼠腹腔伊文思藍的滲出量（表1）；在小鼠耳腫脹試驗中，感冒靈化學藥組分和中藥組分也不能明顯抑制二甲苯致小鼠的耳腫脹度（表2）；這提示無論是中藥部分或者化學藥部分，單獨使用沒有顯著的抗炎藥理作用。但感冒靈全方在上述2模型的試驗中卻顯示明顯的抗炎作用。上述結果表明，感冒靈化學藥組分和中藥組分在抗炎方面上顯示一定的協同作用。

炎癥反應的發(fā)生過程中，它們是主要影響炎癥進程的細胞因子[3]。TNFα由活化的單核巨噬細胞產生；經抗原刺激的T細胞、活化的自然殺傷細胞（NK細胞）和肥大細胞也可分泌TNFα，其在細胞因子級聯反應刺激其他細胞因子的合成過程中發(fā)揮著主要作用，可刺激增強中性多核白細胞的浸潤、吞噬活性與氧自由基的產生、溶酶體的釋放等，啟動單核巨噬細胞釋放IL6，IL8，PGE2等炎癥介質，通過多種途徑發(fā)揮其致炎作用，而后者反過來又增強組織細胞對TNF2α的敏感性。TNFα屬內源性致熱原，可引起發(fā)熱，在炎癥病理性損害和感染性休克中起重要作用，并被認為是導致內毒素休克的關鍵介質[4]。IL1β由多種細胞（如單核巨噬細胞、中性粒細胞、肝細胞）合成，具有廣泛生物學效應，可在局部或全身發(fā)揮作用，如發(fā)熱、促進免疫應答、參與炎癥反應、促進傷口愈合、刺激造血功能。IL8主要由單核/巨噬細胞、內皮細胞等產生，對中性粒細胞有強趨化作用，并使之激活，可趨化T細胞、嗜堿性粒細胞和其他炎癥細胞，還可參與血管形成。IL6主要由單核巨噬細胞、血管內皮細胞、成纖維細胞等產生，可促進B 細胞增殖分化和分泌抗體、促進肝合成急性期蛋白，作為內源性致熱源，參與炎癥反應[5]。

鑒于上述因子在炎癥過程的中藥作用，所以在角叉菜膠致大鼠胸膜炎模型上，通過對模型大鼠胸腔滲出液中細胞因子TNFα，IL1β和IL8以及血清細胞因子TNFα，IL1β，IL8，IL6水平的檢測，進一步觀察感冒靈中化學藥和中藥2組分在抗炎方面的協同作用，并初步探討感冒靈全方的抗炎機制。實驗結果顯示，感冒靈全方可明顯降低角叉菜膠致大鼠胸膜炎模型大鼠胸腔滲出液中TNFα，IL1β及血清TNFα，IL1β，IL8含量，感冒靈中化學藥組分和中藥組分均可不同程度的減少模型大鼠胸腔滲出液中細胞因子TNFα和IL1β的滲出，降低血清中炎性因子TNFα，IL1β和IL8的含量。實驗結果進一步提示，感冒靈中化學藥組分和中藥組分在抑制炎性細胞因子產生方面也表現出一定的協同作用，并主要體現在對胸腔滲出液和血清中TNFα和IL1β含量的抑制方面。

42對成熟KPN生物被膜內活菌量的抑制作用

長期以來科學家僅對浮游細菌（或游離細菌）進行深入研究，忽視對細菌生物被膜（細胞群體狀態(tài)）這一自然界中細菌存在主要形式的研究[6]。美國CLSI（臨床實驗室標準化協會）抗微生物藥物敏感性試驗操作方法和判斷標準即以浮游細菌作為研究對象，判定藥物的抗菌效應、耐藥性等，并為臨床感染的抗生素治療提供重要的參考依據。傳統(tǒng)中藥中很多經典清熱解毒方劑、單味藥在臨床運用過程中顯示較好的抗菌效果[7]，但當以CLSI判斷標準進行相關研究時幾乎所有抗菌中藥復方制劑的抑菌作用都遠遠達不到現代醫(yī)學對抗微生物藥物的評價要求[8]，實驗結果通常與其臨床作用不符。顯然這種單純以浮游細菌為研究對象的經典微生物學方法并不能合理評估中藥的抗菌作用。

隨著細菌生物被膜研究的深入，已證實有生物被膜形成的細菌對抗生素不敏感，而浮游生長狀態(tài)的同類細菌卻較敏感[9]。慢性感染性疾病的難以治愈、細菌耐藥性的產生等與細菌生物被膜的形成密切相關[10]。單味中藥及組分和臨床經典方劑[1112]具有較好的抗生物被膜作用；與抗生素聯合用藥時具有協同抗生物被膜作用[13]，中藥在抗細菌生物被膜方面的作用日益得到重視。同時研究提示，一些抗生素在亞抑菌濃度（subminimum inhibitory concentration）時即可有效干擾生物被膜的形成。鑒于其良好的臨床應用前景，亞抑菌濃度下抗生素對細菌生物被膜形成的調控作用倍受重視[14]。因此結合細菌生物被膜研究手段和方法，合理評價中藥的抗菌作用，有效防治耐藥菌株的產生，才能更好地促進中藥推廣、創(chuàng)新和發(fā)展。

肺炎克雷伯菌是導致呼吸道和泌尿道感染的重要病原菌，也是醫(yī)院感染的常見病原菌之一，可引起身體多個部位多個器官的嚴重感染。研究表明，肺炎克雷伯菌所致感染多與形成生物膜有關[15]。作者前期以浮游細菌為研究對象對感冒靈的抗菌作用進行相關研究，結果表明感冒靈全方、中藥組分對金葡球菌的MIC50分別為1039，1115 g·L-1，對肺炎球菌、肺炎桿菌沒有抑制作用；感冒靈西藥組分在162 g·L-1以下對金葡球菌、肺炎球菌、肺炎桿菌均沒有抑制作用；而青霉素MIC50低于0016 g·L-1。顯然以浮游細菌為研究對象時，感冒靈的抗菌作用得到合理評價，與其較好的臨床作用也不相符。本研究結果表明，一旦KPN細菌生物被膜成熟后，硫酸卡那霉素對生物被膜的總菌量及活菌量不能產生很好的抑制作用；而感冒靈全方在亞抑菌質量濃度（55～1375 g·L-1）時即可顯著減少KPN生物被膜內活菌量，產生抑制生物被膜內活菌增殖的效應，同樣中藥組分在亞抑菌質量濃度（45～225 g·L-1）時也可顯著降低生物被膜中的活菌量，產生抑制生物被膜內活菌繁殖的效應；感冒靈西藥組分在10 g·L-1時可抑制細菌生物被膜的活菌量。此外，感冒靈全方（55 g·L-1）對生物被膜內活菌量的抑制效應遠強于等效劑量時中藥組分（45 g·L-1）和西藥組分（10 g·L-1）時所產生的抑制效應；同時感冒靈全方在1375 g·L-1時仍可有效抑制生物被膜內活菌量，而等效劑量濃度的中藥組分（1125 g·L-1）和西藥組分（25 g·L-1）均無抑制作用。因此對于肺炎克雷伯桿菌生物被膜而言，與感冒靈中、西藥組方相比，全方所產生抑制效應的濃度范圍更廣、抑制效應更強。感冒靈全方由中、西藥組方組成，因此全方所產生的抑制效應包含中藥組方和西藥組分的聯合貢獻，在KPN生物被膜成熟階段，中、西藥組方間存在一定程度地協同效應。掃描電子顯微鏡對KPN生物被膜形態(tài)觀察的結果也表明999感冒靈全方及中、西藥組分可在一定程度上破壞KPN生物被膜結構，這也與CV，XTT的結果相互印證。在999感冒靈西藥組分中少部分菌體呈現球形變，推測可能是細菌在相對惡劣環(huán)境發(fā)生的適用性改變，但機制尚待進一步研究證實。

綜上，感冒靈全方及其中、西藥組方對成熟KPN生物被膜具有抑制作用，在生物被膜成熟階段，中、西藥組方間存在一定程度地協同效應。同時亞抑菌濃度下感冒靈較好的抗生物被膜作用也提示在與其他抗生素聯合運用時其可能具有較好的協同作用，其具體作用及機制尚需臨床及實驗進一步研究證實。

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[責任編輯馬超一]