劉宇麒　張英　宗憲春

摘要 以長壽花幼嫩葉片為外植體，研究不同滅菌時(shí)間對長壽花幼嫩葉片再生能力的影響以及不同激素配比對愈傷組織誘導(dǎo)、不定芽誘導(dǎo)和生根誘導(dǎo)的影響。結(jié)果表明：長壽花幼嫩葉片最佳的滅菌方式為75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗4次，再用0.1%升汞消毒7 min，無菌水沖洗5次；愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L；不定芽誘導(dǎo)分化的最適培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；不定芽誘導(dǎo)生根的最適培養(yǎng)基配方為1/2 MS+IBA 0.2 mg/L。

關(guān)鍵詞 長壽花；嫩葉片；組織培養(yǎng)；快速繁殖

中圖分類號 S682.035.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2016）07-0143-02

Abstract The research using explant from seeding leaf of Kalanchoe blossfeldiana，the regeneration ability of the leaf was tested under different duration of sterilization，and the effects of different hormones combination on the induction of callus、adventitious buds and roots of Kalanchoe blossfeldiana.The results showed that the best way of sterilization was sterilizing the leaf in 75% ethanol for 30 seconds，washing 4 times with disinfection water，then in 0.1% mercury bichloride for 7 minutes and washing with disfection water for 5 times；the optimum medium for the induction of leaves was MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L；the suitable culture medium for bud differentiation and proliferation was MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；the optimum rooting medium was 1/2 MS+IBA 0.2 mg/L.

Key words Kalanchoe blossfeldiana；seedling leaf；tissue culture；rapid propagation

長壽花（Kalanchoe blossfeldiana），又叫矮生伽藍(lán)菜、壽星花、假川蓮，是景天科（Crassulaceae）伽藍(lán)菜屬（Kalanchoe）多年生肉質(zhì)草本植物[1]。長壽花原產(chǎn)自馬達(dá)加斯加島，其花色鮮艷，花期長，觀賞效果極佳，20世紀(jì)90年代初傳入我國，近年隨著進(jìn)口花卉大量的進(jìn)入中國市場，成為了一種極具發(fā)展?jié)摿Φ摹靶缕贩N花卉”[2]。

長壽花因其耐干旱、花期長、花色鮮艷、易栽培等特點(diǎn)在市場上深受消費(fèi)者喜愛，是國際花卉市場發(fā)展最快的室內(nèi)盆栽花卉之一。其繁殖方法一般是播種和扦插，但這2種方法都易受季節(jié)影響。筆者以長壽花葉片為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，研究不同激素配比對長壽花愈傷組織生長、不定芽誘導(dǎo)以及生根效果的影響，以期得到各培養(yǎng)階段的最佳培養(yǎng)基配方，為國內(nèi)長壽花組培苗工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

健康的市售盆栽長壽花幼嫩葉片。

1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

1.2.1 培養(yǎng)基制備?；九囵B(yǎng)基為MS或1/2 MS，各培養(yǎng)基蔗糖濃度為3%，瓊脂成分為0.7%，pH值為5.8，121 ℃高壓滅菌20 min[3-8]。

1.2.2 培養(yǎng)條件。溫度23～26 ℃，光照時(shí)間12 h/d，光照強(qiáng)度1 000 lx左右培養(yǎng)[9-13]。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 外植體滅菌。取長壽花健康幼嫩的葉片，用流水沖洗10 min，移至超凈工作臺內(nèi)操作，用75%乙醇對葉片進(jìn)行消毒，無菌水沖洗4次，0.1%升汞消毒，無菌水沖洗5次。將滅菌后的葉片切成約0.5 cm×0.5 cm的小塊接種在誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基中，每瓶放置5小塊，每個(gè)處理水平接種6瓶，即每個(gè)水平共接種30塊外植體，置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，每天觀測1次并記錄，對不同消毒時(shí)長的消毒效果進(jìn)行比較[14-18]。葉片消毒時(shí)長設(shè)置4個(gè)不同的處理水平，分別為75%酒精25 s+0.1%升汞3 min（A1）；75%酒精30 s+0.1%升汞5 min（A2）；75%酒精35 s+0.1%升汞7 min（A3）；75%酒精40 s+0.1%升汞9 min（A4）。

1.3.2 愈傷組織的誘導(dǎo)。取相同條件下消毒后的葉片進(jìn)行切塊，切成約0.5 cm×0.5 cm的小塊，接種在不同激素配比的誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基中，每瓶放置5小塊，每個(gè)處理水平接種6瓶，即每個(gè)水平共接種30塊外植體，置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，定期觀測愈傷組織生長及增殖的情況并進(jìn)行記錄[19-20]。對激素配比設(shè)置5個(gè)不同處理水平，分別為MS+6-BA 0.2 mg/L+2，4-D 0.1 mg/L（B1），MS+6-BA 0.2 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L（B2），MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L（B3），MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 0.3 mg/L（B4），MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 0.4 mg/L（B5）。

1.3.3 愈傷組織的芽誘導(dǎo)。把愈傷組織切成小塊轉(zhuǎn)接至分化培養(yǎng)基，每瓶放置5小塊，每個(gè)處理水平接種6瓶，即每個(gè)水平共接種30塊愈傷組織，置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，定期觀測芽的分化情況，接種后30 d進(jìn)行芽增殖數(shù)統(tǒng)計(jì)。對激素配比設(shè)置4個(gè)不同處理水平，分別為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L（C1），MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L（C2），MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L（C3），MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L（C4）。

1.3.4 根的誘導(dǎo)。待不定芽生長至2～3 cm高時(shí)，將健壯的單株芽苗切下轉(zhuǎn)接至生根培養(yǎng)基中，每瓶放置5株，每個(gè)處理水平接種6瓶，即每個(gè)水平共接種30株芽苗，置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，觀測不定根的生長情況并記錄。對激素配比設(shè)置4個(gè)不同處理水平，分別為MS（D1），MS+IBA 0.2 mg/L（D2），1/2 MS（D3），1/2 MS+IBA 0.2 mg/L（D4）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌時(shí)長對長壽花葉片滅菌效果的影響

接種15 d后對葉片的污染率、死亡率、成活率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。處理A3、A4等2個(gè)處理污染率最低，分別為20%和30%；處理A1、A3等2個(gè)處理死亡率最低，分別為5%和10%；處理A2、A3等2個(gè)處理成活率較高，分別為45%和70%。因此，處理A3的處理方式為最佳，即先用75%酒精消毒30 s，再用0.1%升汞消毒7 min，消毒后外植體的污染率為20%，死亡率為10%，成活率為70%。

2.2 不同激素配比對長壽花葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以MS為基本培養(yǎng)基添加不同濃度的6-BA及2，4-D，接種30 d后觀察各激素配比對愈傷組織生長情況的影響，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

處理B1、B2、B3、B4、B5的誘導(dǎo)率分別為47%、87%、97%、53%、47%，其中處理B3的愈傷組織誘導(dǎo)率是最高的。因此，處理B3的激素配比為最佳，培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L，愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)97%。

2.3 不同激素配比對長壽花不定芽誘導(dǎo)的影響

以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的6-BA及NAA，將愈傷組織接種到繼代分化培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)接40 d后對不定芽的分化情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。處理C1、C2、C3、C4分化率分別為73%、80%、93%及73%，其中處理C3的不定芽分化率明顯高于其他組。因此，處理C3的激素配比為最佳（圖1），培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，不定芽的分化率達(dá)93%。

2.4 不同激素配比對長壽花芽苗根誘導(dǎo)的影響

轉(zhuǎn)接7 d后對不定根的生長情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。處理D1、D2、D3、D4的生根率分別為80%、93%、70%、100%，其中處理D4的生根率明顯高于其他組，基部長出白色不定根（圖2）。因此，處理D4的激素配比為最佳，培養(yǎng)基配方為1/2 MS+IBA 0.2 mg/L，芽苗的生根率可達(dá)到100%。

3 結(jié)論與討論

通過對不同消毒時(shí)長影響長壽花葉片再生能力以及不同激素配比影響長壽花愈傷組織生長、不定芽誘導(dǎo)和生根效果的試驗(yàn)，長壽花嫩葉片最佳的消毒處理方式為：先用75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗4次，再用0.1%升汞消毒7 min，無菌水沖洗5次。消毒后外植體的污染率為20%，死亡率為10%，成活率為70%，這種外植體滅菌方法大大提高了無菌外植體建立的成功率。愈傷組織誘導(dǎo)效果及生長狀況最佳的培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 0.2 mg/L；誘導(dǎo)不定芽分化的最適培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，其芽分化的效果最好；誘導(dǎo)不定芽生根的最適培養(yǎng)基配方為1/2 MS+IBA 0.2 mg/L，基部長出粗壯白色的不定根。

4 參考文獻(xiàn)

[1] 華金渭，劉南祥，吳華芬，等.長壽花栽培技術(shù)[J].中國花卉園藝，2005（6）：29.

[2] 顏俊.長壽花品種選擇與盆花生產(chǎn)[J].中國花卉園藝·半月刊，2005（16）：12-15.

[3] 孫新政，李慶偉，梁明勤.白花長壽花組培快繁技術(shù)研究[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)科學(xué)，2006，2（22）：39-42.

[4] 王玉英，高新一.植物組織培養(yǎng)技術(shù)手冊[M].北京：金盾出版社，2006：68-73.

[5] 王文靜，袁道強(qiáng)，高松潔.植物組織培養(yǎng)的應(yīng)用現(xiàn)狀[J].河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2000（3）：137-139.

[6] 梅家訓(xùn)，丁習(xí)武.組培技術(shù)及其快繁應(yīng)用[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2003.

[7] DODDS JOHN H，KOBERTS LORIN W.Experiments in plant tissues culture[M].3rd.ed.Cambridge：Cambridge University Press，1995.

[8] 何鐘配，翟志席.玉米離體根尖的多層濾紙床液體靜止培養(yǎng)方法[J].西北植物學(xué)報(bào)，2001（6）：15-17.

[9] 羅士韋.植物組織與細(xì)胞培養(yǎng)研究工作的進(jìn)展及其應(yīng)用[J].植物生理學(xué)報(bào)，1978（4）：91-112.

[10] 宋思楊，樓士林.生物技術(shù)概論（第2版）[M].北京：江蘇科技出版社，1988：1-14.

[11] 李思經(jīng).國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)進(jìn)展[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社，1997.

[12] 彭承霞.長壽花（Kalanchoe blossfeldiana T.）組培快繁及多倍體新類型培育的研究[D].重慶：西南大學(xué)，2008.

[13] 沈海龍.植物組織培養(yǎng)[M].北京：中國林業(yè)出版社，2005.

[14] 梁稱福.植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展與應(yīng)用概況[J].經(jīng)濟(jì)林研究，2005，23（4）：99-105.

[15] 孫敬三，桂耀林.植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京：科學(xué)出版社，1995.

[16] 許鳳芹，劉桂茹，楊學(xué)舉.植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，9（1）：99-103.

[17] 夏鎮(zhèn)澳.植物組織培養(yǎng)與農(nóng)業(yè)[J].植物生理學(xué)通訊，1995，31（1）：62-64.

[18] 林秀蓮，賴鐘雄，黃雙龍，等.紅花長壽花莖段及葉片的離體培養(yǎng)與快速繁殖[J].亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2005，1（2）：1-5.

[19] 關(guān)艷清，柳玉晶，張秀麗.長壽花葉片愈傷組織培養(yǎng)及植株再生的研究[J].遼寧農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，10（3）：20-22.

[20] 段鵬慧，李興澤.重瓣長壽花葉片組織培養(yǎng)及植株再生的研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（1）：169-172.