王朝霞

摘要 多管發(fā)酵法是糞大腸菌群檢測(cè)的經(jīng)典方法，概述了其檢測(cè)意義、發(fā)展歷程、質(zhì)量控制以及與其他方法的對(duì)比等方面的研究進(jìn)展，以期為加強(qiáng)對(duì)多管發(fā)酵法的認(rèn)識(shí)和理解提供參考。

關(guān)鍵詞 水；糞大腸菌群；多管發(fā)酵法；檢測(cè)；質(zhì)量控制

中圖分類號(hào) X832 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2016）07-0205-01

1 糞大腸菌群的檢測(cè)意義

糞大腸菌群是在44.5 ℃培養(yǎng)，24 h內(nèi)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。該菌主要來(lái)源于人畜糞便，其數(shù)量直接表明水體受糞便污染的程度。1992年，生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)修訂會(huì)議上首次提出將糞大腸菌群作為糞便污染的重要衛(wèi)生學(xué)指標(biāo)[1]。糞大腸菌群是當(dāng)前國(guó)內(nèi)、外環(huán)境監(jiān)測(cè)部門評(píng)價(jià)水體污染程度的公認(rèn)指標(biāo)和主要監(jiān)測(cè)項(xiàng)目之一，具有廣泛的衛(wèi)生學(xué)意義[2]。2014年6月起修訂施行的《GB4789.39—2013食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 糞大腸菌群計(jì)數(shù)》將糞大腸菌群在食品微生物檢驗(yàn)中由推薦檢測(cè)變成了強(qiáng)制檢測(cè)[3]。

2 多管發(fā)酵法的發(fā)展歷程

多管發(fā)酵法測(cè)定糞大腸菌群是國(guó)內(nèi)外沿用多年的方法，在我國(guó)，多管發(fā)酵法自1989年版《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》到2007年國(guó)家環(huán)境保護(hù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（HJ/T347—2007），仍為經(jīng)典方法[4]。該方法技術(shù)要求相對(duì)較低，分析成本亦較低，便于進(jìn)行普及和推廣。但該方法操作步驟繁雜，消耗大量人力物力，周期長(zhǎng)，為此很多人在方法改進(jìn)上下了不少功夫[5-10]。

3 多管發(fā)酵法的質(zhì)量控制

在微生物檢測(cè)中，不確定度主要來(lái)源于操作人員技能、計(jì)量器具校準(zhǔn)、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基、樣品的均勻性等[11]，因此要保證檢測(cè)的準(zhǔn)確度必須從以上幾個(gè)方面進(jìn)行質(zhì)量控制。

3.1 操作人員技能

為減少樣品檢測(cè)的不確定度，應(yīng)定期或不定期地對(duì)實(shí)驗(yàn)室分析人員進(jìn)行各項(xiàng)專業(yè)技術(shù)訓(xùn)練和實(shí)驗(yàn)室基本操作，及時(shí)排除各類問(wèn)題以提高實(shí)驗(yàn)室工作成效。

3.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備質(zhì)量控制

恒溫培養(yǎng)箱：需每天檢查2次，記錄培養(yǎng)架上使用區(qū)的溫度是否準(zhǔn)確和穩(wěn)定，溫度變化不可超過(guò)±0.5 ℃。

高壓蒸汽滅菌器：應(yīng)能提供均勻的高達(dá)121 ℃的高壓滅菌溫度，每月用熱變色濾紙條檢查滅菌效果。

紫外滅菌燈：每月用浸有乙醇的濕布擦拭1次，每季用紫外光度計(jì)測(cè)量紫外燈光強(qiáng)度不少于初始值的70%或用生長(zhǎng)有200～250個(gè)細(xì)菌菌落的瓊脂平皿暴露于紫外燈下2 min，99%的菌數(shù)被殺滅，否則，即應(yīng)更換新燈[12]。

為保證儀器計(jì)量精確以及正常使用，應(yīng)該由熟悉儀器的人員定期對(duì)儀器進(jìn)行維護(hù)，并按計(jì)量部門的要求定期進(jìn)行檢定；肉湯中倒管的選擇要尺寸合適，太細(xì)太長(zhǎng)容易排氣不暢，導(dǎo)致滅菌后的倒管內(nèi)有氣泡，在進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)時(shí)產(chǎn)生假陽(yáng)性現(xiàn)象，太短滅菌過(guò)程中肉湯沸騰，容易導(dǎo)致倒管翻轉(zhuǎn)。

3.3 培養(yǎng)條件

復(fù)發(fā)酵用提高培養(yǎng)溫度的方法將糞便中的大腸菌群與自然環(huán)境中的大腸菌群區(qū)分，接種后如不盡快升溫，那些在44.5 ℃以下生長(zhǎng)的非糞大腸菌群類細(xì)菌就會(huì)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，這樣就會(huì)提高復(fù)發(fā)酵陽(yáng)性率，因此標(biāo)準(zhǔn)要求“接種后所有發(fā)酵管必須在30 min 內(nèi)放進(jìn)水浴中”[13]。并且將接種好的樣品放入生化培養(yǎng)箱時(shí)，箱內(nèi)溫度達(dá)到（44.5±0.5） ℃方可放入。如用恒溫水浴箱時(shí)，其水面要高于接種物面。

3.4 培養(yǎng)基

每一批次的培養(yǎng)基[14]，要用陰陽(yáng)性菌株驗(yàn)證其有效性；培養(yǎng)基溶解后和滅菌后分別測(cè)量pH值，以保證細(xì)菌生長(zhǎng)所需的pH值；配制后的培養(yǎng)基，要盡快分裝到試管中進(jìn)行滅菌，以免細(xì)菌繁殖破壞培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分；培養(yǎng)基在高壓滅菌器滅菌結(jié)束后，當(dāng)氣壓降至0后，應(yīng)立即從滅菌器中取出培養(yǎng)基，使之冷卻；震動(dòng)可能在內(nèi)置倒管內(nèi)產(chǎn)生氣泡從而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，因此在使用之前要檢查試管，將有氣泡的培養(yǎng)基廢棄掉；配制好的培養(yǎng)基，不宜保存過(guò)久，且每批應(yīng)注明配制日期。已滅菌的培養(yǎng)基可在4～10 ℃存放7 d；存放時(shí)應(yīng)避免陽(yáng)光直射，且要避免液體蒸發(fā)和雜菌侵入；當(dāng)培養(yǎng)液顏色變化，或體積變化明顯時(shí)廢棄不用。肉湯管水分散失的簡(jiǎn)單檢查方法是標(biāo)記每一批次的幾根管的原始水平，如果估算的水分散失超過(guò)10%，應(yīng)廢棄肉湯管。

3.5 樣品均勻性

樣品在接種前，應(yīng)充分振搖，使菌落盡可能分散分布。

4 各種檢測(cè)方法的對(duì)比

隨著環(huán)境及食品問(wèn)題的日益嚴(yán)峻，對(duì)糞大腸菌群的檢測(cè)要求不斷增加，各種應(yīng)急監(jiān)測(cè)的需求不斷增大，多管發(fā)酵法因其操作步驟繁雜、檢測(cè)周期長(zhǎng)、培養(yǎng)基保存時(shí)間短、工作量大、干擾因素多、需要消耗大量的人力和物力的缺點(diǎn)，已經(jīng)不能滿足當(dāng)前國(guó)內(nèi)外的檢測(cè)需求，因而國(guó)內(nèi)外相繼研發(fā)出各種快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法，下面對(duì)各種檢測(cè)方法進(jìn)行對(duì)比。

濾膜法：可檢測(cè)體積較大的水樣，操作簡(jiǎn)單，一次到位，避免操作過(guò)程中的二次污染；稀釋度越大，誤差越大；受孔徑影響，不能檢測(cè)濁度大、非大腸桿菌類細(xì)菌密度大的水樣[15]。

紙片法：人力物力成本不高，檢測(cè)周期短，不需要確認(rèn)試驗(yàn)，操作和結(jié)果判斷均比較容易，與多管發(fā)酵法的相關(guān)性好，但其穩(wěn)定性不足，二次污染大[16-17]。

酶底物法：操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)周期短，準(zhǔn)確度高，不需要確認(rèn)試驗(yàn)，可同時(shí)檢測(cè)水中大腸菌群和大腸埃希氏菌的污染狀況，可作為應(yīng)急監(jiān)測(cè)或者災(zāi)害監(jiān)測(cè)的重要方法[18]。不受濁度的影響，適用于任何水質(zhì)。密封培養(yǎng)技術(shù)檢測(cè)醫(yī)院廢水時(shí)，可以避免檢測(cè)人員受到疾病威脅[19]。缺點(diǎn)是成本較高。

聚合酶鏈?zhǔn)郊夹g(shù)、熒光原位雜交技術(shù)以及自動(dòng)化檢測(cè)方法等先進(jìn)的方法，檢驗(yàn)周期短，不需要確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，但這些先進(jìn)的技術(shù)檢測(cè)設(shè)備及試劑費(fèi)用高昂，技術(shù)復(fù)雜，還無(wú)法短時(shí)間內(nèi)應(yīng)用普及[20]。

5 結(jié)語(yǔ)

隨著技術(shù)的進(jìn)步和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，各種先進(jìn)的檢測(cè)技術(shù)一定會(huì)取代傳統(tǒng)方法，節(jié)省時(shí)間和人力資源，在新技術(shù)支持下，精確、快速、可靠、環(huán)保、低廉的自動(dòng)檢測(cè)儀器被研發(fā)并應(yīng)用與普及將使自動(dòng)化檢測(cè)方法成為監(jiān)測(cè)工作的發(fā)展方向。但其他方法的研究都是與多管發(fā)酵法進(jìn)行準(zhǔn)確度和可靠性的比較，因此多管發(fā)酵法始終是糞大腸菌群檢測(cè)的經(jīng)典方法。

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