鄧黃河　陳志偉

【摘要】 目的：探析miR-140與膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度的相關(guān)性。方法：選擇本科收治的膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者60例為骨性關(guān)節(jié)炎組（OA組），按LawrenceX線(xiàn)診斷標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅳ級(jí)患者各15例。同時(shí)選取同期非骨性關(guān)節(jié)炎患者30例為對(duì)照組（主要為外傷患者）。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量（PCR）檢測(cè)上述兩組患者膝關(guān)節(jié)液中miR-140的含量。比較兩組及不同等級(jí)患者的miR-140表達(dá)水平。結(jié)果：OA組miR-140表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；miR-140表達(dá)水平隨OA嚴(yán)重程度增加而降低，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論：miR-140表達(dá)水平與膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 臨床觀(guān)察； 膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎； miR-140

【Abstract】 Objective：To study the correlation of miR-140 with the severity of knee osteoarthritis.Method：60 patients with knee osteoarthritis were selected as the OA group.According to Lawrence X-ray diagnosis standard，there were 15 cases from level Ⅰ to level Ⅳ respectively.30 cases without OA were selected as the control group at the same time（they were mainly trauma patients）.Through real-time fluorescence quantification，the content of miR-140 in the two groups was detected.The expression levels of miR-140 in the two groups and patients of different degrees were compared.Result：The expression level of miR-140 in the OA group was significantly lower than that in the control group，the difference was statistically significant（P<0.01）.The expression level of miR-140 was reduced according with the increasing of the severity of knee osteoarthritis，the difference was statistically significant（P<0.01）.Conclusion：The expression level of miR-140 is negatively correlated with the severity of knee osteoarthritis..

【Key words】 Clinical observation； Knee osteoarthritis； miR-140

First-authors address：The Peoples Hospital of Xuwen County，Xuwen 524100，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.07.001

骨性關(guān)節(jié)炎（OA）是一種慢性關(guān)節(jié)病，典型特征為骨質(zhì)增生，關(guān)節(jié)軟骨破壞、變性等，多見(jiàn)于老年患者[1]。隨著我國(guó)人口老齡化的加劇，OA的發(fā)病率出現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。該病發(fā)病率隨年齡的增長(zhǎng)而增加，特別是55歲之后OA發(fā)病率明顯增加。OA的發(fā)病確切機(jī)理目前仍不十分清楚。近年來(lái)，有研究顯示微小RNA（microRNA）在老年退行性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中起著關(guān)鍵作用。已有研究證明，對(duì)miR-140的編碼基因定向敲除，小鼠可發(fā)生與年齡相關(guān)的膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎樣改變，如關(guān)節(jié)軟骨的纖維化、缺失蛋白多糖等[2]。為深入探究人OA及miR-140的相關(guān)性的機(jī)制，且初步分析下游靶基因的生物信息，筆者對(duì)不同分級(jí)OA患者的膝關(guān)節(jié)液進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-140表達(dá)水平，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本科收治的膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者60例為關(guān)節(jié)炎組（OA組），按LawrenceX線(xiàn)診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]：Ⅰ～Ⅳ級(jí)患者各15例。Ⅰ級(jí)患者中男

9例，女6例，年齡27～75歲，平均（41.3±4.5）歲；

Ⅱ級(jí)患者中男8例，女7例，年齡27～75歲，平均（41.2±4.4）歲；Ⅲ級(jí)患者中男10例，女5例，年齡27～75歲，平均（41.4±4.4）歲；Ⅳ級(jí)患者中男10例，女5例，年齡27～75歲，平均（41.4±4.3）歲。同時(shí)選取同期非骨性關(guān)節(jié)炎患者30例為對(duì)照組（主要為外傷患者），其中男20例，女10例，年齡27～75歲，平均（41.5±4.2）歲，各組性別、年齡等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法 （1）標(biāo)本收集及保存：關(guān)節(jié)液分離，即采用無(wú)酶、無(wú)菌的15 mL離心管采集3～4 mL符合實(shí)驗(yàn)的膝關(guān)節(jié)液，室溫環(huán)境下離心5 min，

3000 r/min，小心吸取上清液，在1.5 mL規(guī)格的EP管內(nèi)分裝，-80 ℃置存。（2）提取總RNA：進(jìn)行TRhol一步法提取，主要為裂解、分層、沉淀RNA、洗滌RNA、溶解RNA等步驟。（3）CDNA反轉(zhuǎn)錄：采用TaqMan MicroRNA Reverse Transcriptionit和TaqMan MicroRNAAssays試劑盒中特異性的莖-環(huán)狀反轉(zhuǎn)錄引物，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)在A(yíng)pplied Biosystems 2700熱循環(huán)儀上進(jìn)行，配置反應(yīng)液的所有操作均在冰上進(jìn)行。反應(yīng)體系見(jiàn)表1。反應(yīng)條件：16 ℃ 0.5 h，42 ℃ 0.5 h，85 ℃ 5 min。選擇總RNA標(biāo)本：OD260/280值為1.6～2.1?？俁NA反應(yīng)量為100 ng/次。（4）實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：應(yīng)用上述TaqMan MicroRNAAssays試劑盒中的PCR引物探針混合液進(jìn)行PCR擴(kuò)增及熒光檢測(cè)。在美國(guó)Applied Biosystems公司StepOneTM熒光定量PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s及60 ℃ 1 min，后兩步共循環(huán)50次。PCR產(chǎn)物電泳：應(yīng)用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，60 V，40 min。生物信息分析：進(jìn)行Targetscan分析預(yù)測(cè)miR-140下游靶基因。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究所得數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

OA組的miR-140表達(dá)水平為（0.8±0.5），對(duì)照組的miR-140表達(dá)水平為（2.7±1.2），OA組的miR-140表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.32，P<0.01）；OA嚴(yán)重程度Ⅰ級(jí)miR-140表達(dá)水平為（2.3±0.9），Ⅱ級(jí)miR-140表達(dá)水平為（1.8±0.7），Ⅲ級(jí)miR-140表達(dá)水平為（1.5±0.6），Ⅳ級(jí)miR-140表達(dá)水平為（0.8±0.4），miR-140表達(dá)水平隨OA嚴(yán)重程度增加而降低，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=5.90，P<0.01）。預(yù)測(cè)has-miR-140-5P的靶基因，結(jié)果有251種靶基因，與OA相關(guān)的靶基因有轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βⅠ型受體、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2，見(jiàn)圖1。

3 討論

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的整個(gè)疾病過(guò)程不僅影響到關(guān)節(jié)軟骨，還涉及整個(gè)關(guān)節(jié)，包括軟骨下骨、韌帶、關(guān)節(jié)囊、滑膜及關(guān)節(jié)周?chē)∪?。膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎主要見(jiàn)于老年人，OA導(dǎo)致的痛苦和殘疾嚴(yán)重?fù)p害了患者的生活質(zhì)量，并成為最嚴(yán)重的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)之一。膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的病因可分為原發(fā)性和繼發(fā)性?xún)煞N；原發(fā)性骨性關(guān)節(jié)炎又稱(chēng)特發(fā)性骨性關(guān)節(jié)炎，多見(jiàn)于體力勞動(dòng)者、血壓高者及女性、超過(guò)50歲、體型肥胖者；而繼發(fā)性膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎又稱(chēng)創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)炎，常繼發(fā)于關(guān)節(jié)畸形、關(guān)節(jié)損傷、關(guān)節(jié)炎癥或其他傷病。目前，大多數(shù)研究認(rèn)為可能和患者的遺傳易感性、肥胖、骨質(zhì)疏松、外傷等因素有關(guān)[4]。有研究顯示，不同種族之間OA的發(fā)病率存在一定的差異，例如髖關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎在高加索人種中較為多見(jiàn)，在我國(guó)及其他有色人種中較為少見(jiàn)[5]。同時(shí)OA存在明顯的家族聚集性，這樣的結(jié)果也說(shuō)明其發(fā)生與遺傳存在一定的相關(guān)性；肥胖患者OA的發(fā)病率顯著上升，提示超重可能是OA發(fā)病的誘因[6]；骨質(zhì)疏松者OA的發(fā)生率顯著增高，可能與軟骨下骨小梁變薄、變僵硬時(shí)，其承受壓力的耐受性就減少有關(guān)；創(chuàng)傷造成局部骨質(zhì)破壞、缺血等，造成骨營(yíng)養(yǎng)不良，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等因素可能導(dǎo)致OA的發(fā)生明顯增加。OA的發(fā)病確切機(jī)理目前仍不十分清楚[7]。近年來(lái)，有研究顯示微小RNA（microRNA）在老年退行性骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病中起著關(guān)鍵作用[8-9]。

本研究探析miR-140與膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度的相關(guān)性，結(jié)果顯示OA組的miR-140表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；miR-140表達(dá)水平隨OA嚴(yán)重程度增加而降低，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度與miR-140表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，與Miyaki等[10]的研究結(jié)果大體一致，膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的病變中心是軟骨損傷；疾病的第一征象為膠原纖維支架的分離，破損軟骨承受應(yīng)力的能力降低，導(dǎo)致軟骨下骨承受相對(duì)較低的應(yīng)力而發(fā)生微骨折，修復(fù)后的骨組織失去正常的彈性，引發(fā)關(guān)節(jié)軟骨的進(jìn)一步損傷[11-12]；軟骨基質(zhì)蛋白多糖生物合成和分解異常，軟骨細(xì)胞無(wú)法合成正常的具有長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸和聚氨基葡萄糖，由此產(chǎn)生的短鏈蛋白多糖聚合物由膠原網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中溢出，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨局部軟化、失去彈性、磨損及結(jié)構(gòu)破壞；繼發(fā)反應(yīng)有超氧化物自由基、膠原酶和磷脂酶的激活，進(jìn)一步導(dǎo)致軟骨的損傷并引發(fā)關(guān)節(jié)相鄰骨骼的骨性關(guān)節(jié)炎反應(yīng)[13]；miR-140micRNAs的家族成員為miR-140，某些軟骨中可表達(dá)miR-140，且可對(duì)軟骨發(fā)育進(jìn)行調(diào)節(jié)，軟骨組織中特異性表達(dá)miR-140且其表達(dá)水平的改變可致病[14]。軟骨細(xì)胞中可生成成熟的miR-140，在膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎中表達(dá)水平下降可能源于膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者的軟骨細(xì)胞出現(xiàn)病理性變化，生成miR-140下降；可影響Dicer酶及Drosha酶活性的因素引發(fā)miR-140生成減少；OA患者軟骨細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，引發(fā)miR-140降解；OA病情進(jìn)展促進(jìn)miR-140的降解因素的增加，miR-140抑制降解因素下調(diào)，miR-140表達(dá)水平減低。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)，PDGF受體中含有負(fù)性調(diào)節(jié)作用的miR-140結(jié)合位點(diǎn)，miR-140基因可通過(guò)PDGF信號(hào)途徑調(diào)節(jié)PDGF受體蛋白水平，表明miR-140與軟骨的發(fā)育密切相關(guān)。miR-140在體內(nèi)平衡及軟骨發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，對(duì)miR-140目標(biāo)基因的敲除，建立動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究結(jié)果顯示，miR-140可以對(duì)軟骨的發(fā)育進(jìn)行調(diào)節(jié)，miR-140缺失引發(fā)關(guān)節(jié)軟骨的纖維化及蛋白多糖的丟失符合年齡相關(guān)的膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎樣變化[15-16]。綜上所述，miR-140表達(dá)水平與膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。

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（收稿日期：2015-10-08） （本文編輯：王利）