王志越 呂秋艷 褚添 宋景紅 劉海濤 莊國良 曹殿起 付慧英

摘 要：依托北京市食源性疾病主動監(jiān)測體系，開展了解北京市門頭溝區(qū)食源性疾病腹瀉病例來源的副溶血性弧菌、沙門氏菌分子特征和血清學(xué)分型。2014年4月～2015年3月，對北京門頭溝區(qū)食源性疾病監(jiān)測分離到的副溶血弧菌和沙門氏菌進(jìn)行PFEG分子分型和圖譜分析。11株副溶血弧菌經(jīng)PFEG分型后，得到10個不同的帶型，帶型間相似度在0%～84.6%之間；21株沙門氏菌獲得16種帶型，帶型間相似度在20.8%～88.9%之間菌株，部分菌株具有高度同源性，但總體遺傳特證多樣。門頭溝區(qū)食源性疾病病例的部分副溶血弧菌和沙門氏菌的分子分型具有一定的相似度，菌株分子特征呈現(xiàn)遺傳多樣性，說明建立門頭溝區(qū)食源性疾病病原菌分子分型圖譜庫，對于食物中毒快速檢測、診斷及溯源具有重大意義。

關(guān)鍵詞：食源性疾病 腹瀉 副溶血弧菌 沙門氏菌 分子分型

食源性疾病作為全球主要的公共衛(wèi)生問題之一，其危害程度和導(dǎo)致的損失呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢，食品中侵染的致病生物因子是食源性疾病暴發(fā)的主要病原和誘因。我國食源性疾病的發(fā)生往往是由細(xì)菌性微生物引起，傷寒沙門氏菌（Salmonella typhosa）、副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）和志賀氏菌（Shigella spp）是主要的3類食源性致病菌[1]。副溶血弧菌（Vi. parahemolyticus）作為一種嗜鹽性弧菌，已成為我國最主要的食源性水產(chǎn)品致病菌[2]，也是近20年來我國食源性疾病暴發(fā)的最常見的病原菌[3]。同時，沙門氏菌病也是世界范圍主要的的食源性疾病之一，主要是攝入沙門氏菌污染的肉、蛋、奶等動物源性食品而導(dǎo)致食源性疾病的暴發(fā)，患者多表現(xiàn)為腹瀉、發(fā)熱、腹痛或痙孿、嘔吐、頭痛和惡心等典型癥狀[4]。副溶血弧菌、沙門氏菌頻繁導(dǎo)致食源性疾病的暴發(fā)，凸顯了食源性疾病來源的副溶血弧菌、沙門氏菌的主動監(jiān)測以及分子分型和溯源防控的重要性。

食源性致病菌分子溯源通過對病人中食源性致病菌分離株進(jìn)行分子分型和比對分析，開展分布調(diào)查和追蹤溯源，能夠早期發(fā)現(xiàn)和識別聚集性病例和暴發(fā)線索，對于食源性致病菌監(jiān)測，傳染源追蹤、傳播途徑調(diào)查和識別等暴發(fā)調(diào)查以及防控措施制定實施有著非常重要的意義。本文針對門頭溝區(qū)食源性疾病主動監(jiān)測哨點醫(yī)院診斷病例為監(jiān)測對象，采集符合食源性疾病病例病人的大便樣本，進(jìn)行副溶血弧菌、沙門氏菌的監(jiān)測和分子分型溯源，對于全面了解門頭溝區(qū)副溶血弧菌、沙門氏菌的分子流行病學(xué)特點，及時識別聚集性病例和暴發(fā)線索，制定合理的控制預(yù)防措施，提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

1.1.1 監(jiān)測點設(shè)置

選取北京市門頭溝區(qū)醫(yī)院、京煤集團(tuán)總醫(yī)院作為食源性疾病來源的副溶血弧菌、沙門氏菌的主動監(jiān)測點，診斷醫(yī)生根據(jù)病例定義篩選病人進(jìn)行監(jiān)測樣本的采集，北京市門頭溝疾控中心微生物檢驗科負(fù)責(zé)副溶血弧菌、沙門氏菌的檢測、鑒定，分子分型由北京市疾控中心完成。

1.1.2 病例定義[5]

由食品或懷疑由食品引起的，以腹瀉癥狀為主訴的就診病例。腹瀉是指每日排便3次或3次以上，且糞便性狀異常，如稀便、水樣便、粘液便或膿血便等。

1.1.3 樣本采集

采集監(jiān)測病例新鮮糞便1～2g置于無菌塑料便盒中（如采樣困難，可采用無菌棉拭子以直腸內(nèi)采集糞便后，置Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基，室溫保存運(yùn)送，忌冰箱冷藏），2～8℃、4h內(nèi)檢測。2014年4月～2015年3月，共完成350件樣本的采集和監(jiān)測。

1.1.4 主要設(shè)備與試劑

弧菌顯色培養(yǎng)基、沙門氏菌顯色培養(yǎng)基（鄭州人福博賽生物技術(shù)有限公司）；3%氯化鈉堿性蛋白胨水、3%氯化鈉三糖鐵瓊脂、嗜鹽性試驗培養(yǎng)基（0%、3%、6%、8%，北京陸橋技術(shù)有限公司）；API 20E生化鑒定條、濁度儀（Densimat），梅里埃公司；Seakem Gold瓊脂糖，美國Cambrex BioScience Rockland；蛋白酶K，德國Merck；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ，北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司；脈沖場凝膠電泳儀及配套設(shè)備、凝膠成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad；試驗用去離子水系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法

參照文獻(xiàn)[5]規(guī)定的要求，參照GB 4789規(guī)定的方法進(jìn)行病例大便樣本的副溶血弧菌、沙門氏菌的檢測、鑒定。

1.2.2 PFGE分型及聚類分析

參照國際食源性致病菌分子分型監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)PulseNet以及2014年食源性疾病監(jiān)測工作手冊中副溶血弧菌和沙門氏菌的PFGE分型的標(biāo)準(zhǔn)操程序進(jìn)行[6]。副溶血弧菌主要步驟：膠塊內(nèi)染色體DNA的酶切使用內(nèi)切酶NotⅠ酶切（標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812使用XbaⅠ酶切），在CHEE MAPPER脈沖場電泳儀（美國Bio-Rad公司）上電泳（溫度14℃、起始轉(zhuǎn)換時間為10s，終止轉(zhuǎn)換時間為35.03s）18h。電泳結(jié)束后，1%的EB染色30min，脫色90min后，使用Gel Doc EQ拍攝圖像。沙門氏菌的主要步驟：細(xì)菌懸液濃度用VITEK濁度儀調(diào)至4.0～4.2麥?zhǔn)蠞岫龋蝗?00μL菌懸液加等量的膠制備膠塊；使用XbaⅠ限制性內(nèi)切酶（40U），37℃酶切3h；緩沖液為0.5×TBE；電泳電壓為6V/cm；電泳參數(shù)為2.2～63.8s，19h；膠塊電泳后使用GelRed染色，純水脫色，讀取電泳圖譜。用BioNumerics軟件對電泳圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，構(gòu)建聚類樹狀圖。聚類圖類型根據(jù)非加權(quán)配對算術(shù)平均法構(gòu)建，條帶位置差異容許度設(shè)為1.5%。

2 結(jié)果

2.1 菌株的基本情況

2014年4月～2015年3月，北京市門頭溝區(qū)350例主動監(jiān)測病例樣本中，共檢測出副溶血弧菌、沙門氏菌食源性致病菌32株，食源性致病菌陽性檢出率為9.14%。其中，11例樣本副溶血弧菌陽性檢出，病例陽性副溶血弧菌檢出率為3.14%，在TCBS上呈現(xiàn)典型菌落特征；沙門氏菌陽性檢出21例，檢出率為6%，生化鑒定符合沙門氏菌特征。說明門頭溝區(qū)食源性致病菌中副溶血弧菌、沙門氏菌為主要致病菌。

2.2 PFGE分型結(jié)果

2.2.1副溶血弧菌的分子分型

分離得到的11株陽性菌株的DNA片段能得到較好的分離，經(jīng)PFGE分型后得到10株電泳圖譜，F(xiàn)R-bjmtg0117未得到明顯的條帶忽略不計，BioNumerics軟件對電泳圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析結(jié)果見圖1。在74.9%的相似水平，菌株mtgQ-2014-016-FR、mtgQ-2015-0042-FR、mtgQ-2014-081-FR、mtgQ-2014-095-FR分離條帶相似度較高，尤其mtgQ-2014-016-FR、mtgQ-2015-0042-FR的相似度84.6%，說明其可能來自同一污染源的菌株，從流行病學(xué)的角度考慮，菌株mtgQ-2014-016-FR、和菌株mtgQ-2015-0042-FR導(dǎo)致的食源性疾病可能來自同一菌株所致。菌株FR-bjmtg17-3、FR-bjmtg17-4的條帶分布也存在較高的相似度，達(dá)到了80%，其他各菌株P(guān)FGE 圖譜條帶差異較大，說明2014～2015年mtgQ-2014-016-FR、和FR-bjmtg17-3帶型是門頭溝區(qū)食源性疾病的副溶血弧菌優(yōu)勢帶型。

獲得副溶血弧菌的PFGE圖譜可以作為北京市門頭溝區(qū)2014～2015年的副溶血弧菌代表菌株的PFGE圖譜數(shù)據(jù)庫，用于副溶血弧菌導(dǎo)致的食源性疾病的溯源、傳播途徑調(diào)查和識別以及預(yù)防控制措施的制定實施。

2.2.2 沙門氏菌的分子分型

21株沙門菌通過PFGE分型后，共分為16個帶型，每個帶型包含1～5株菌，2個帶型包含菌株>1，分別為2和5株菌株，其他帶型均包含1株菌株（圖2）。菌株2014mtgQ-116、mtgj-2014-055、mtgj2014-106、mtgQ2015-0011、mtgQ2015-18為同一個帶型，而菌株mtgQ-2014-088和mtgQ-2014-088/#1帶型相同；說明其病原具有同源性，可能為同一污染源和病原，往往是食源性疾病聚集暴發(fā)的因子。16種分子分型條帶的相似度為20.8%～88.9%，菌株mtgQ-2015-36和mtgQ2014-118條帶相似度達(dá)到了90.9%，菌株mtgj-2014-120與mtgQ-2015-017條帶相似度為89.7%，且跨年度菌株，說明門頭溝區(qū)沙門氏菌病人病原相同，污染源相近；菌株mtgQ-2014-088 mtgQ-2014-088/#1、mtgQ-2014-125相似度為88.9%；且為同年度分離獲得，說明可能為聚集暴發(fā)病例或感染后處置不徹底形成延續(xù)病例。

分離21株沙門氏菌，PFGE獲得16中帶型圖譜，可以作為門頭溝區(qū)的食源性致病菌沙門氏菌的圖譜而構(gòu)建圖譜庫，為今后門頭溝區(qū)食源性致病菌沙門氏菌的食源性疾病主動監(jiān)測、分子溯源、傳播途徑調(diào)查和識別以及預(yù)防控制措施的制定實施，提供依據(jù)。

3 討論

當(dāng)前，病原微生物污染防控是食品安全的剛性需求，微生物污染是食品不合格和造成食物中毒的主要原因，食源性副溶血弧菌和沙門氏菌是食源性疾病暴發(fā)的主要因素之一。而PFGE分子分型方法被認(rèn)為是細(xì)菌分子分型最可靠的手段，能夠快速進(jìn)行致病菌的比對和溯源。FGE結(jié)果進(jìn)行比較，追溯致病食品源頭[7]。本研究依托北京市食源性疾病主動監(jiān)測體系，獲得11株副溶血弧菌和21株沙門氏菌陽性菌株，均來自門頭溝區(qū)食源性疾病主動監(jiān)測哨點醫(yī)院，由食品或懷疑由食品引起的，獲得PFEG圖譜說明，副溶血弧菌具有10種帶型，沙門氏菌16種帶型。副溶血弧菌的mtgQ-2014-016-FR、mtgQ-2015-0042-FR、mtgQ-2014-081-FR、mtgQ-2014-095-FR菌株條帶相似度較高；FR-bjmtg17-3、FR-bjmtg17-4的條帶也具有較高的同源性；其他菌株條帶差異較大。沙門氏菌菌株16種分子分型條帶的相似度為20.8%～88.9%，菌株mtgQ-2015-36和

mtgQ2014-118條帶相似度達(dá)到了90.9%，菌株mtgj-2014-120與mtgQ-2015-017條帶相似度為89.7%。

11株副溶血弧菌和21株沙門氏菌的圖譜聚類分析顯示，門頭溝區(qū)食源性副溶血弧菌和沙門氏菌的遺傳呈現(xiàn)多態(tài)性，菌株間的親緣關(guān)系較復(fù)雜，且與樣本采集時間有關(guān)聯(lián)，與文獻(xiàn)報道較一致[8，9]。部分食源性疾病病例分得到的副溶血弧菌和沙門氏菌陽性菌株的PFGE圖譜歸屬于同一群，在遺傳學(xué)為親緣較近菌株，圖譜條帶的差異為菌株發(fā)生了單個遺傳[10]。北京門頭溝區(qū)食源性致病菌監(jiān)測顯示，食品中副溶血弧菌檢出率最高為22.22%，污染生食動物性水產(chǎn)品[11]，沙門氏菌也是食品污染主要致病菌[4]。故本研究結(jié)果獲得的PFEG圖譜，能夠為門頭溝區(qū)食源性疾病沙門氏菌和副溶血弧菌分子分型數(shù)據(jù)庫建立奠定良好的基礎(chǔ)，有助于開展沙門氏菌、副溶血弧菌的主動監(jiān)測、暴發(fā)調(diào)查、傳染源追蹤和分子溯源，對于預(yù)防和控制食源性副溶血弧菌導(dǎo)致的食源性疾病具有重大現(xiàn)實意義。

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